本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，特別涉及一種快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21世紀(jì)人類健康的頭號(hào)殺手。2009年8月拜耳醫(yī)藥在歐洲心臟病學(xué)會(huì)年會(huì)上報(bào)道指出2005年全球約有1750萬人死于心血管疾病，預(yù)計(jì)2015年這一數(shù)字將攀升到2000萬人，大約有一半病例發(fā)生在亞太地區(qū)。生活條件的改善和生活方式的轉(zhuǎn)變，使中國人發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)迅速趕超美國等發(fā)達(dá)國家。我國1990年城市居民心血管疾病死亡率為92/10萬人，2000年為106/10萬人，平均每年死亡增長率為1.3％。2008年死亡率已達(dá)到121/10萬人，相比2000年時(shí)，平均死亡增長率為1.4％，其中急性心肌梗塞的死亡率占到其中的三分之一，說明心肌梗塞死亡率仍呈不斷增長趨勢(shì)。隨著中國人口老齡化趨勢(shì)，按平均死亡增長率為1.5％計(jì)算，到2015年，血管疾病死亡率將達(dá)到141/10萬人，急性心肌梗塞的死亡率將達(dá)到47/10萬人。中國衛(wèi)生部2008年公布的急性心肌梗塞的死亡率為39.72/10萬人，每年急性心肌梗塞的發(fā)病人數(shù)超過500萬人，至少有超過200萬的人群去醫(yī)院就醫(yī)進(jìn)行心肌梗塞疾病的相關(guān)檢測(cè)，這并不包含每年因胸痛懷疑為心肌梗塞的病人人數(shù)，實(shí)際醫(yī)院每年檢測(cè)人數(shù)已達(dá)千萬人次。心肌梗塞的典型臨床癥狀是胸痛，心律失常，心力衰竭等。但實(shí)際臨床上胸痛的癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣，危險(xiǎn)性差異也較大，還有心梗病人無典型癥狀。醫(yī)學(xué)上將急性心肌梗死發(fā)病后6小時(shí)以內(nèi)作為搶救的“黃金時(shí)間”，超過這個(gè)時(shí)間段，治療效果就會(huì)大打折扣，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重后果危及生命。中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)分會(huì)2006年制定的“冠狀動(dòng)脈疾病和心力衰竭時(shí)心臟標(biāo)志物臨床檢測(cè)應(yīng)用建議”指出，適用于臨床的心臟標(biāo)記物應(yīng)具有較好的診斷、危險(xiǎn)分層和預(yù)后估計(jì)的價(jià)值，分析檢測(cè)方法應(yīng)特異、靈敏、快速，而且心臟標(biāo)志物的檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間＜60min。肌酸激酶同工酶(CK-MB)是一種中晚期心肌標(biāo)志物，在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發(fā)生時(shí)，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，認(rèn)為在心肌梗塞的診斷中測(cè)定肌酸激酶的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時(shí)，肌酸激酶在起病6小時(shí)內(nèi)升高，24小時(shí)達(dá)高峰，3-4日內(nèi)恢復(fù)正常。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。傳統(tǒng)上CK-MB多用化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法或者熒光免疫層析法等方法測(cè)定?；瘜W(xué)發(fā)光法對(duì)技術(shù)要求高，操作步驟相對(duì)比較繁瑣，需要多步試劑添加過程。膠體金免疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢(shì)，然而當(dāng)遇到某些樣品中抗原或抗體含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺甚至無顯色，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。熒光免疫層析法雖然靈敏度比膠體金免疫層析法要高，但是其檢測(cè)精密度并不理想，靈敏度與大型化學(xué)發(fā)光或者電化學(xué)發(fā)光儀器仍有差距。脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)在活性脂肪酸代謝的組織中大量存在，如心臟和肝臟，它們的主要功能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的長鏈脂肪酸運(yùn)輸?，F(xiàn)已確定九個(gè)不同類型的FABP，其中，H-FABP(心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白)是最廣泛的，因?yàn)樗罅看嬖谟谛募〖?xì)胞。其低分子量和細(xì)胞質(zhì)的位置相結(jié)合，使H-FABP成為急性冠脈綜合癥(尤其是胸痛發(fā)作6小時(shí)內(nèi))的一個(gè)高敏的早期標(biāo)志物，缺血性發(fā)作30分鐘后即可檢測(cè)。這可能是因?yàn)樵谛募∪毖托募乃酪院螅杆購募?xì)胞質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)。H-FABP在6-8小時(shí)左右達(dá)到濃度峰值，然后在24-30小時(shí)左右恢復(fù)至正常水平。如此迅速恢復(fù)至正常水平得益于高腎清除率，這意味著H-FABP不僅能夠用作AMI早期標(biāo)志物，還是理想的心肌梗死復(fù)發(fā)診斷標(biāo)志物。盡管H-FABP的釋放特點(diǎn)與肌紅蛋白相似，但其心肌特異性是肌紅蛋白的15-20倍；因此H-FABP是更有效的心肌損傷標(biāo)志物。此外，H-FABP的正常血清/血漿值比肌紅蛋白低，從而降低假陽性比率。相較于單獨(dú)使用肌鈣蛋白的情況，使用H-FABP和肌鈣蛋白的組合已證實(shí)，在癥狀出現(xiàn)后的早期(<4小時(shí)或<6小時(shí))，可顯著改善MI/ACS的診斷敏感性。關(guān)于預(yù)后，一些大型臨床試驗(yàn)中肌鈣蛋白陽性和肌鈣蛋白陰性的患者分層長期ACS的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)說明了H-FABP的價(jià)值。即使在使用高度敏感的肌鈣蛋白的情況下，診斷和預(yù)后，也常增添H-FABP。除了ACS，H-FABP還用于其他范圍，例如肺栓塞(PE)，冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)(CABG)和腦血管疾病。時(shí)間分辨熒光(Time-resolvedFluorescence，TRF)是一種非同位素?zé)晒鈽?biāo)記物，與普通熒光相比，具有stock位移大，熒光壽命長等特點(diǎn)，可以有效的避免樣品中的本底熒光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。目前市面上采用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的試劑均采用解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?DELFIA)，它采用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合物，使其一段與銪(Eu)連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)后形成免疫復(fù)合物，由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，需要加入一種解離增強(qiáng)劑，使得銪離子從復(fù)合物上解離下來，并與增強(qiáng)劑中的另一種螯合劑形成膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑，該試劑能在較短的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)完成cTnI、H-FABP的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)靈敏度高。本發(fā)明還提供了快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑的制備方法。一種快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑，其特征在于：所述的試紙條包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)。所述Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)水平方向順序連接固定于底板上。所述硝酸纖維素膜(3)上包被有H-FABP單克隆抗體1(5)、cTnI單克隆抗體1或多克隆抗體1(6)構(gòu)成的檢測(cè)線和兔IgG抗體(7)構(gòu)成的質(zhì)控線。所述的熒光液(8)包含H-FABP單克隆抗體2標(biāo)記的時(shí)間分辨熒光微球、cTnI單克隆抗體2標(biāo)記的時(shí)間分辨熒光微球、羊抗兔抗體標(biāo)記的時(shí)間分辨熒光微球。所述的時(shí)間分辨熒光微球選自修飾過的聚苯乙烯微球。所述的聚苯乙烯微球，表面修飾官能團(tuán)為羧基、羥基或環(huán)氧基的一種，粒徑為100～500nm。所述的時(shí)間分辨熒光微球內(nèi)部填充鑭系元素的螯合物。所述的鑭系元素為銪、釤、鈊、鏑中的一種。所述的時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記步驟如下：(1)肌鈣蛋白I單克隆抗體2標(biāo)記時(shí)間分辨熒光微球的制備及稀釋：將時(shí)間分辨熒光微球溶于MES緩沖液中，加入活化劑活化；隨后加入氨基乙酸，使得微球表面連接手臂；洗滌、離心后，再次加入活化劑活化；再次洗滌、離心，將時(shí)間分辨熒光微球用硼酸緩沖液復(fù)溶，隨后加入肌鈣蛋白I單克隆抗體2進(jìn)行反應(yīng)，硼酸緩沖液、微球與抗體的質(zhì)量比在10mg:0.01mg～10mg：2.0mg；反應(yīng)完后加入封閉劑進(jìn)行封閉；封閉過后，洗滌、離心，再次用硼酸緩沖液及封閉劑復(fù)溶、超聲，使微球均勻分散在緩沖液中，2-8℃避光保存，選擇合適的緩沖液稀釋熒光微球，工作濃度在0.5～50μg/ml，用于肌鈣蛋白I性能的評(píng)估。(2)H-FABP單克隆抗體2標(biāo)記時(shí)間分辨熒光微球的制備及稀釋羊抗兔抗體標(biāo)記的熒光微球的制備及稀釋過程同(1)所述。優(yōu)選的，采用銪粒子螯合物填充的時(shí)間分辨熒光微球，粒徑為：100～500nm；優(yōu)選的，硼酸緩沖液、微球與抗體的質(zhì)量比例為：10mg:0.01mg～10mg：2.0mg；優(yōu)選的，熒光液的工作濃度為：0.5～50μg/ml；(1)制備檢測(cè)線和質(zhì)控線：硝酸纖維素膜(3)在免疫熒光試紙條中用于固定包被抗體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生的場(chǎng)所；檢測(cè)線(5)是將H-FABP單克隆抗體1使用檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀釋，劃線于所述硝酸纖維素膜(3)上；檢測(cè)線(6)是將cTnI單克隆抗體1或多克隆抗體1使用檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀釋，劃線于所述硝酸纖維素膜(3)上；質(zhì)控線(7)是將兔IgG抗體使用檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀釋，劃線與所述硝酸纖維素膜(3)上，將劃好的硝酸纖維素膜置于真空干燥箱，在37～45℃下，烘干24～48小時(shí)，檢測(cè)線(5)、(6)位于同一位置或不同位置，若為不同位置，則檢測(cè)線(5)、(6)均位于質(zhì)控線(7)同一側(cè)，即液體首先接觸的位置；(2)試紙條的組裝：在試紙條底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水紙(4)，將組裝好的大板切成小條，即得到所述快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條。優(yōu)選的，檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀中檸檬酸鹽或蔗糖占5-20％；優(yōu)選的，檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的劃膜濃度為0.5～2mg/ml；優(yōu)選的，檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的劃膜噴量為0.5～2.0μl/cm；以上快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑的檢測(cè)方法，其步驟包括：(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取10～20μl的cTnI、H-FABP混合標(biāo)準(zhǔn)品與80～500μl的熒光混合液(cTnI、H-FABP、羊抗兔熒光液)混合，取混合液70～100μl滴加到試紙條的Fusion5上，反應(yīng)時(shí)間15～20分鐘，通過與試紙條配套的時(shí)間分辨免疫層析定量分析儀讀取系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)1、系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)2，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的各濃度為橫坐標(biāo)，各濃度T/C的平均值為縱坐標(biāo)，擬合制備標(biāo)準(zhǔn)品曲線；(2)待測(cè)樣品的檢測(cè)，分別取10～20μl的待測(cè)樣品與80～500μl的熒光混合液(cTnI、H-FABP、羊抗兔熒光液)混合，取混合液70～100μl滴加到試紙條的Fusion5上，反應(yīng)時(shí)間15～20分鐘，通過T/C的值即可得到待測(cè)樣品中的cTnI、H-FABP的濃度值。(1)中，cTnI、H-FABP混合標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為:cTnI：0、0.1、0.5、1.0、5.0、25.0、50.0ng/ml；H-FABP：0、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、120.0ng/ml；本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明采用Fusion5為樣品墊，摒棄了傳統(tǒng)的樣品墊及結(jié)合物釋放墊，無需預(yù)處理，可以進(jìn)行全血、血清、血漿樣本的檢測(cè)，能夠極大的提高檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確性。(2)本發(fā)明將熒光液置于硝酸纖維素膜之外，不同于傳統(tǒng)方法將熒光微球固定于結(jié)合物釋放墊上，不存在熒光微球釋放不均一的現(xiàn)象，同樣能夠極大的提高檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確性。(3)本發(fā)明采用銪粒子螯合物填充的時(shí)間分辨熒光微球，由于其大的Stokes位移(激發(fā)波長為340nm左右，發(fā)射波長為615nm左右，差值為275nm左右)，能夠明顯降低背景信號(hào)值，提高檢測(cè)的靈敏度。(4)本發(fā)明的采用極少的樣本量(10～20μl)，能夠有效的排除樣本的干擾。附圖說明圖1是本發(fā)明快速定量同時(shí)檢測(cè)cTnI、H-FABP的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑的結(jié)構(gòu)示意圖(1為底板、2為Fusion5、3為硝酸纖維素膜、4為吸水墊、5為H-FABP檢測(cè)線、6為cTnI檢測(cè)線、7為兔IgG質(zhì)控線)。圖2是本發(fā)明H-FABP的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。圖3是本發(fā)明cTnI的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。圖4是本發(fā)明奧普與膠乳增強(qiáng)免疫比濁H-FABP的相關(guān)性曲線。圖5是本發(fā)明奧普與化學(xué)發(fā)光法cTnI的相關(guān)性曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：本發(fā)明中，H-FABP抗體、cTnI抗體和熒光微球的供應(yīng)商和貨號(hào)如下所示抗體名稱目錄號(hào)廠家Anti-hFABP3clone2302100292MedixAnti-hFABP3clone2303100293Medix19C7單克隆抗體(cTnI)4T21Hytest16A11單克隆抗體(cTnI)4T21HytestG-129-C多克隆抗體(cTnI)G-129-CBiospacific200nm熒光微球FC02FBangslaboratories實(shí)施例1(1)cTnI、H-FABP時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條的制備：A.檢測(cè)線(T1、T2)溶液的制備：用10倍、50mM的檸檬酸鹽溶液分別稀釋cTnI單克隆抗體及多克隆抗體、H-FABP單克隆抗體至1～2mg/ml；B.質(zhì)控線(C)溶液的制備：用用10倍、50mM的檸檬酸鹽溶液稀釋兔IgG抗體至1～2mg/ml；在帶有背膠的底板(1)上采用搭接的方式，首先粘貼硝酸纖維素膜(3)，然后再硝酸纖維素膜(3)的兩端分別粘貼Fusion5膜(2)和吸水紙(4)。在硝酸纖維素膜(3)且靠近Fusion5膜(2)處，分別劃T1(H-FABP捕獲線(5))、T2(cTnI捕獲線(6))，在靠近吸水紙(4)的一端劃C(兔IgG)線，T1、T2、C的間距都為4mm。在T線處，分別劃T1、T2，在C線處劃C線。T1、T2線抗體的終濃度為1mg/ml，C線兔IgG的終濃度為1mg/ml，C、T線的噴量為1.0μl/cm。將噴好的大卡置于37℃恒溫烘箱中烘烤24小時(shí)。烘烤完后，在濕度小于40％的房間，用切條機(jī)將其切成3.85mm寬度的試紙條，將其裝入塑料殼中壓實(shí)，然后裝入一袋干燥劑，封口置于干燥柜中保存，待用。具體如圖1所示。實(shí)施例2cTnI、H-FABP時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測(cè)(1)制備cTnI、H-FABP羊抗兔時(shí)間分辨熒光微球?qū)r(shí)間分辨熒光微球(粒徑為200nm左右)溶于100mMMES緩沖液(PH為6.0)中，加入活化劑(NHS,20mg/ml；EDC,20mg/ml)活化15分鐘；洗滌、離心，將時(shí)間分辨熒光微球用60mM硼酸緩沖液(PH為8.5)復(fù)溶，隨后加入肌鈣蛋白I單克隆抗體2進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)(微球與抗體的質(zhì)量比在10mg:0.5mg)；反應(yīng)完后加入封閉劑(BSA，100mg/ml)進(jìn)行封閉2小時(shí)；封閉過后，洗滌、離心，再次用60mM硼酸緩沖液(PH為8.5)及封閉劑(BSA，100mg/ml)復(fù)溶、超聲，使微球均勻分散在緩沖液中，2-8℃避光保存。H-FABP單克隆抗體2標(biāo)記的熒光微球的制備、羊抗兔抗體標(biāo)記的熒光微球的制備過程同cTnI制備微球的過程相同。(2)滴配用PH為8.0、100mM的Tris緩沖液將步驟(1)中的cTnI、H-FABP、羊抗兔包被的熒光微球進(jìn)行稀釋。其中，cTnI、H-FABP包被的熒光微球稀釋200～300倍，羊抗兔包被的熒光微球稀釋2000～3000倍，混合后即為所需要的熒光混合液。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用小牛血清稀釋cTnI、H-FABP混合標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為:cTnI：0、0.1、0.5、1.0、5.0、25.0、50.0ng/ml；H-FABP：0、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、120.0ng/ml。分別取10μl混合標(biāo)準(zhǔn)品與80μl熒光混合液混合，再取80μl混合液滴加載實(shí)施例1中的cTnI、H-FABP時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條上，反應(yīng)15分鐘后，通過與cTnI、H-FABP時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條配套的免疫層析讀數(shù)儀，分別讀取系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)1、系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)2，每個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品的濃度檢測(cè)三次。實(shí)施例3精密度檢測(cè)用實(shí)施例2中的測(cè)試方法，分別測(cè)試cTnI、H-FABP的混合標(biāo)準(zhǔn)品(cTnI的濃度為1和25ng/ml、H-FABP的濃度為10和80ng/ml)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)十次，具體檢測(cè)數(shù)值如下表1所示。表1精密度測(cè)試結(jié)果表如表1數(shù)據(jù)可知，采用本發(fā)明的三聯(lián)檢測(cè)試紙條，cTnI、H-FABP的精密度均小于10％，完全符合POCT產(chǎn)品精密度小于15％的要求。實(shí)施例4臨床樣本的相關(guān)性檢測(cè)用實(shí)施例2中的測(cè)試方法，分別選取40例國外化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)cTnI及膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)H-FABP的臨床樣本(樣本濃度分別覆蓋標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)范圍)，用上海奧普生物的兩聯(lián)檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)。具體檢測(cè)結(jié)果如表2所示。表2上海奧普兩聯(lián)檢測(cè)與化學(xué)發(fā)光法及膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)數(shù)據(jù)分別以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的cTnI濃度、膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)的H-FABP為橫坐標(biāo)，上海奧普生物檢測(cè)cTnI、H-FABP濃度為縱坐標(biāo)，繪制樣本相關(guān)性曲線。如圖4、圖5所示。其中，H-FABP的相關(guān)性方程為y＝0.924x+1.760，R2＝0.966；cTnI的相關(guān)性方程為y＝1.095x+1.968，R2＝0.964。兩個(gè)項(xiàng)目的相關(guān)性系數(shù)R均大于0.95，完全符合臨床試驗(yàn)的要求。當(dāng)前第1頁1 2 3