一種基于γH2AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物丫肥AX的檢測方法，并將其用于卷煙煙氣中化合 物的基因毒性檢測，具體說是一種基于丫肥AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 嚴(yán)重的細(xì)胞DNA損傷主要出現(xiàn)于W下幾種情況；1)細(xì)胞在物理、化學(xué)或生物等因 素作用下直接誘導(dǎo)或是通過復(fù)制壓力誘導(dǎo)形成的雙鏈斷裂（DSBs), 2)細(xì)胞自身調(diào)控的程序 性DSBs, 3)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞過程中產(chǎn)生的DSBs。而W上S種情況的細(xì)胞DNA損傷均可 誘導(dǎo)丫肥AX的磯酸化（C肥AX)和簇集形成焦點，該一過程可發(fā)生在幾分鐘之內(nèi)，丫肥AX所 形成的焦點數(shù)量與造成的DNA雙鏈斷裂數(shù)量存在一一對應(yīng)關(guān)系。因此，丫肥AX被認(rèn)為是檢 測細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的特異性指標(biāo)。
[0004] 目前，檢測丫肥AX的方法主要包括；免疫巧光法，免疫印跡法，流式細(xì)胞技術(shù)間接 標(biāo)記法。但該些技術(shù)存在操作步驟繁瑣，易受非特異巧光干擾，多次洗漆細(xì)胞的丟失量大， 且試驗周期長等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明正是針對上述問題，提供一種基于丫肥AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法。并將 其用于卷煙煙氣中化合物的基因毒性檢測。
[0006]本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種基于丫肥AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法，包括W下工藝步驟： 1) 配制實驗試劑；（1)細(xì)胞培養(yǎng)液；（2)預(yù)冷的70%己醇；（3)磯酸緩沖鹽溶液（PBS); (4)0. 5% 的TritonX-IOO; 2) 細(xì)胞培養(yǎng)；C冊細(xì)胞生長于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 °C、5% C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3) 細(xì)胞染毒：將指數(shù)生長期的Cffi)細(xì)胞(也適用于人肺癌上皮細(xì)胞A549細(xì)胞)，按 1XIO6個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，進(jìn)行細(xì)胞染毒，每個處理組設(shè)=個 平行，染毒時間為24h; 4) 基于流式細(xì)胞儀對細(xì)胞中丫肥AX測定，具體步驟如下： a、 細(xì)胞提取：細(xì)胞染毒24h后棄去染毒液，加入500yLO. 25%膜酶，消化1-2min,棄 去膜酶，加入1HiL磯酸鹽緩沖溶液（PBS)混懸，1500rpm/min離屯、，棄去上清，洗漆兩次； b、 己醇固定；準(zhǔn)備70%的己醇，-20°C預(yù)冷，在禍旋使細(xì)胞團(tuán)粒松開后，邊禍旋邊一滴滴 的加入預(yù)冷的70%己醇1血，放置于-20°C冰箱固定過夜； c、TritonX-100破膜；取出固定的待檢測樣品，1500巧m/min離屯、，棄上清，用PBS洗漆 兩次。加入 0.5% 的TritonX-IOO100Ul破膜； t加入FITC直標(biāo)的Anti-肥AX(購至Biolegend公司）10JiL至待檢測樣品，室溫解 育50min后轉(zhuǎn)移到流式管中待檢測； e、流式細(xì)胞儀檢測：流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置；設(shè)置激發(fā)光；488nm;檢測發(fā)射光通道：SYTOX巧光；FLlchannel(530/30band-passfilter);EMA巧光；FL3channel(670 long-passfilter)，每個批次試驗須根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整巧光補償和光電倍增參數(shù)，但批次 內(nèi)保持其參數(shù)設(shè)置不變。
[0007] 5)結(jié)果與分析；通過流式細(xì)胞儀檢測含有丫肥AX焦點的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并依 下述公式，計算檢測的細(xì)胞中產(chǎn)生丫H2AX的焦點率；
[000引本發(fā)明中所用的實驗試劑配制方法如下： (1) 細(xì)胞培養(yǎng)液；DMEM培養(yǎng)液+10%的胎牛血清（FBS) +100lU/mL青霉素+100yg/ mL鏈霉素； (2) 預(yù)冷的70%己醇；取無水己醇70血，用去離子水定容至100血，混勻后放置于-20 °C冰箱中預(yù)冷24h; (3) 磯酸緩沖鹽溶液（PBS);0.2gK化，0. 2gKH2P04,8g化化，2. 9g化2冊04* 12&0,加 雙蒸水至1L，PH7. 2~7. 4,高壓滅菌； (4) 0. 5% 的TritonX-IOO;取 0. 5 血TritonX-100,加入 99. 5 血的PBS，37°C水浴震 蕩至溶解。
[0009] 所述染毒毒素可為卷煙煙氣中的煙草特有亞硝胺NNK、雜環(huán)胺AaC。
[0010] 本發(fā)明所用溶液中除已明確標(biāo)明的W外所設(shè)及的％均為體積百分比。與現(xiàn)有技術(shù) 相比，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果： 在整個試驗過程中減少了多次洗漆細(xì)胞的試驗步驟，使操作方法更簡便；針對間接 標(biāo)記法中較強的非特異巧光干擾的問題，確立了流式直接免疫巧光標(biāo)記的方法，減少了細(xì) 胞的丟失，檢測過程更快速方便，檢測結(jié)果也更穩(wěn)定；本發(fā)明省去了間接標(biāo)記法中標(biāo)記第 一抗體和第二抗體的步驟，縮短了檢測周期，提高了檢測效率；本發(fā)明用流式細(xì)胞儀分析 丫H2AX的相對巧光強度，結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確，統(tǒng)計學(xué)精度高。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明的工藝步驟圖。
【具體實施方式】
[001引實例1對NNK進(jìn)行評價 收集處于指數(shù)生長期的Cffi)細(xì)胞W1X106個/孔細(xì)胞接種于6孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)2化后進(jìn)行NNK染毒，染毒時間為24h。實驗中WNNK的劑量分別為0yg/mL，25 yg/mL，50yg/mL，100yg/mL，200yg/mL和 400yg/mL染毒C冊細(xì)胞，每種條件設(shè) 3 個 平行孔，置于37 °C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細(xì)胞染毒結(jié)束后，加入500uLO. 25% 膜酶，消化1-2min,棄去膜酶，加入1血磯酸鹽緩沖溶液（PBS)混懸，1500巧m/min離屯、， 棄去上清，洗漆兩次。己醇固定；準(zhǔn)備70%的己醇，-20 °C預(yù)冷。在禍旋使細(xì)胞團(tuán)粒松開后， 邊禍旋邊一滴滴的加入預(yù)冷的70%己醇ImU放置于-20 °C冰箱固定24h。TritonX-IOO破膜；取出固定的待檢測樣品，1500rpm/min離屯、，棄上清，用PBS洗漆兩次。加入0. 5%的 TritonX-IOO100UL破膜。加入FITC直標(biāo)的Anti-肥AX(購至Biolegend公司）10UL至待 檢測樣品，室溫解育50min后轉(zhuǎn)移到流式管中待檢測。流式細(xì)胞儀檢測；流式細(xì)胞儀參數(shù) 設(shè)置；設(shè)置激發(fā)光；488nm;檢測發(fā)射光通道；SYTOX巧光；FLlChanneK530/30band-pass filter);EMA巧光；FL3channel(670long-passfilter),每個批次試驗須根據(jù)細(xì)胞狀 態(tài)調(diào)整巧光補償和光電倍增參數(shù)，但批次內(nèi)保持其參數(shù)設(shè)置不變。通過流式細(xì)胞儀檢測含 有丫H2AX焦點的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并依下述公式，計算檢測的細(xì)胞中產(chǎn)生丫H2AX的焦點 率。
[001引表1顯示的是NNK染毒Cffi)細(xì)胞后丫肥AX的焦點數(shù)（平均值和標(biāo)準(zhǔn)差）。
[0014]實例2對AaC進(jìn)行評價 收集處于指數(shù)生長期的Cffi)細(xì)胞W1X1〇6個/孔細(xì)胞接種于6孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行AaC染毒，染毒時間為24h。實驗中WAaC的劑量分別為0yg/ 血，2. 5yg/血，5yg/血，10yg/血，20yg/血和40yg/mL染毒C冊細(xì)胞，每種條件 設(shè)3個平行孔，置于37 °C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細(xì)胞染毒結(jié)束后，加入500 yLO. 25%膜酶，消化1-2min,棄去膜酶，加入1血磯酸鹽緩沖溶液（PBS)混懸，1500巧m/ min離屯、，棄去上清，洗漆兩次。己醇固定；準(zhǔn)備70%的己醇，-20 °C預(yù)冷。在禍旋使細(xì)胞 團(tuán)粒松開后，邊禍旋邊一滴滴的加入預(yù)冷的70%己醇1mU放置于-20 °C冰箱固定過夜。 TritonX-IOO破膜；取出固定的待檢測樣品，1500巧m/min離屯、，棄上清，用PBS洗漆兩次。 加入 0.5% 的TritonX-IOO100Ul破膜。加入FITC直標(biāo)的Anti-肥AX(購至Biolegend 公司）10UL至待檢測樣品，室溫解育50min后轉(zhuǎn)移到流式管中待檢測。流式細(xì)胞儀檢 巧U;流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置：設(shè)置激發(fā)光；488nm;檢測發(fā)射光通道；SYTOX巧光；FLlchannel (530/30band-passfilter);EMA巧光；FL3channel(670long-passfilter),每個批次 試驗須根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整巧光補償和光電倍增參數(shù)，但批次內(nèi)保持其參數(shù)設(shè)置不變。通過 流式細(xì)胞儀檢測含有丫H2AX焦點的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并依下述公式，計算檢測的細(xì)胞中 產(chǎn)生丫肥AX的焦點率。
[00巧]表2顯示的是AaC染毒Cffi)細(xì)胞后丫肥AX的焦點數(shù)（平均值和標(biāo)準(zhǔn)差）。
[001引表1NNK染毒CHO細(xì)胞后丫肥AX的焦點數(shù)
【主權(quán)項】
1. 一種基于YH2AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于：包括以下工藝步驟： 1) 配制實驗試劑：（1)細(xì)胞培養(yǎng)液；（2)預(yù)冷的70%乙醇；（3)磷酸緩沖鹽溶液（PBS); (4) 0? 5% 的TritonX-IOO; 2) 細(xì)胞培養(yǎng)：CHO細(xì)胞生長于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 °C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3) 細(xì)胞染毒：將指數(shù)生長期的CHO細(xì)胞，按IXIO6個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中， 培養(yǎng)24h后，進(jìn)行細(xì)胞染毒，每個處理組設(shè)三個平行，染毒時間為24h; 4) 基于流式細(xì)胞儀對細(xì)胞中YH2AX測定，具體步驟如下： a、 細(xì)胞提?。杭?xì)胞染毒24h后棄去染毒液，加入500yL0. 25%胰酶，消化1-2min，棄 去胰酶，加入ImL磷酸鹽緩沖溶液（PBS)混懸，1500rpm/min離心，棄去上清，洗絳兩次； b、 乙醇固定：準(zhǔn)備70%的乙醇，-20°C預(yù)冷，在渦旋使細(xì)胞團(tuán)粒松開后，邊渦旋邊一滴滴 的加入預(yù)冷的70%乙醇ImL，放置于-20°C冰箱固定過夜； c、TritonX-100破膜：取出固定的待檢測樣品，1500rpm/min離心，棄上清，用PBS洗絳 兩次，加入 〇? 5% 的TritonX-IOO100yL破膜； d、 加入FITC直標(biāo)的Anti-H2AX10yL至待檢測樣品，室溫孵育50min后轉(zhuǎn)移到流式 管中待檢測； e、 流式細(xì)胞儀檢測； 5) 結(jié)果與分析：通過流式細(xì)胞儀檢測含有YH2AX焦點的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并依下述 公式，計算檢測的細(xì)胞中產(chǎn)生YH2AX的焦點率：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于YH2AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于：實驗試 劑的配制方法如下： (1) 細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液+10%的胎牛血清（FBS) +100IU/mL青霉素+100yg/ mL鏈霉素； (2) 預(yù)冷的70%乙醇：取無水乙醇70mL，用去離子水定容至100mL，混勻后放置于-20 °C冰箱中預(yù)冷24h; (3) 磷酸緩沖鹽溶液（PBS):0.2gKCL，0.2gKH2P04,8gNaCL，2.9gNa2HPO4* 12H20,加 雙蒸水至1L，PH7. 2~7. 4,高壓滅菌； (4) 0.5%的！'1'行〇1^-100:取0.5 1^1'1'行〇1^-100，加入99.5 1111的？85,371：水浴震 蕩至溶解。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于YH2AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于：所述染 毒毒素為卷煙煙氣中的煙草特有亞硝胺NNK、雜環(huán)胺AaC。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于YH2AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于：流式 細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置：設(shè)置激發(fā)光：488nm;檢測發(fā)射光通道：SYTOX熒光：FLlchannel:530/30 band-passfilter;EMA焚光：FL3channel: 670long-passfilter。
【專利摘要】一種基于γH2AX的細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于：包括以下工藝步驟：1）配制實驗試劑，2）細(xì)胞培養(yǎng)，3）細(xì)胞染毒，4）基于流式細(xì)胞儀對細(xì)胞中γH2AX測定，5）結(jié)果與分析。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下特點：在整個試驗過程中減少了多次洗滌細(xì)胞的試驗步驟，使操作方法更簡便；針對間接標(biāo)記法中較強的非特異熒光干擾的問題，確立了直接免疫熒光標(biāo)記的方法，使檢測過程更快速方便，檢測結(jié)果也更穩(wěn)定；本發(fā)明省去了間接標(biāo)記法中標(biāo)記第一抗體和第二抗體的步驟，縮短了檢測周期，提高了檢測效率；本發(fā)明用流式細(xì)胞儀檢測γH2AX的相對熒光強度，結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確，統(tǒng)計學(xué)精度高。
【IPC分類】G01N33/58, G01N15/14
【公開號】CN104964910
【申請?zhí)枴緾N201510451238
【發(fā)明人】趙俊偉, 李翔, 謝復(fù)煒, 康彧, 趙閣, 尚平平, 劉惠民, 謝劍平
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月29日