相關申請的交叉參考

本申請要求2007年10月22日提交的美國臨時專利申請序列號60/999920的權益，在此通過參考全文引入。本申請還要求2008年6月25日提交的PCT/US2008/068136的權益，PCT/US2008/068136要求2007年6月25日提交的美國臨時專利申請序列號60/937179的權益，這兩篇申請在此通過參考全文引入。

技術領域

本發(fā)明涉及評價在含有機基聚硅氧烷的懸浮液中蛋白質材料聚集的方法以及用有機基聚硅氧烷和含蛋白質材料的懸浮液表面涂布的醫(yī)療組件。

背景技術：

治療性蛋白質對疾病和健康狀況，例如糖尿病、癌癥、血友病、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化和心肌梗死提供許多獨特和關鍵的治療。市場上已經(jīng)存在許多蛋白質產(chǎn)品，且數(shù)百種之多處于臨床前和臨床開發(fā)之中。此外，近來隨著“人類化(humanizing)”抗體的強有力方法的到來，在生物技術產(chǎn)品開發(fā)上存在新的復蘇(resurgence)，因為待研究的治療人類疾病的抗體產(chǎn)品數(shù)量巨大地增加。采用現(xiàn)代基因和蛋白質方法的情況下，每天發(fā)現(xiàn)了新的比較安全和比較有效的蛋白質療法。然而，若蛋白質產(chǎn)品不可能充分地穩(wěn)定，因此它對人類健康的益處從未實現(xiàn)。典型的蛋白質藥物產(chǎn)品的經(jīng)濟可行性所要求的貨架期為18－24個月。尤其難以實現(xiàn)這一目標，因為蛋白質在其自然狀態(tài)下具有相對低的熱動力學穩(wěn)定性。蛋白質的活性取決于其自然的三維結構。另外，甚至在熱動力學比所呈現(xiàn)狀態(tài)(unfolded)的條件(例如在37℃下，中性pH)更極大有利于自然狀態(tài)下，蛋白質對形成非天然聚集體和沉淀高度敏感。聚集體中的蛋白質的生物活性通常大大下降。更加重要的是，非天然的蛋白質聚集體可引起患者副反應，例如免疫應答或過敏性休克。不可能預期給定蛋白質聚集體誘導負面應答的能力；在沒有采用高昂和耗時的臨床試驗情況下，也不可能測定安全所要求的最大聚集程度。

因此，配方科學的主要目標是設計在極低的水平下保持聚集的配方。一般地，目標是在產(chǎn)品的貨架期內(nèi)，不大于全部蛋白質群的1－2％形成聚集體。甚至在其中蛋白質的物理穩(wěn)定性看起來最優(yōu)以便在本體溶液中最小化蛋白質聚集的溶液條件下，可形成可占全部蛋白質群僅僅小的分數(shù)的可見和亞可見(subvisible)蛋白質顆粒。存在甚至數(shù)量少的蛋白質顆粒可使得產(chǎn)品臨床不可接受。蛋白質粒狀物尤其是致免疫的。盡管粒狀物對于疫苗配方來說是所需的(其中蛋白質分子鍵合到鋁鹽顆粒上)，但在治療蛋白質產(chǎn)品中，對這種顆粒的免疫應答可引起患者嚴重的負面應答。因此，即使聚集的蛋白質量可能如此小，以致于對產(chǎn)品效力基本上不具有有害影響，但可能大大地犧牲了安全性。

可在加工步驟過程中，例如在小瓶/注射器填充過程中泵送蛋白質溶液時，常規(guī)地形成顆粒。在其他情況下，顆粒的形成可能表面上是隨機的。例如，可在給出產(chǎn)品批次中，在小部分的小瓶或預填充的注射器內(nèi)觀察到顆粒。其他情況下，填充到給定批次小瓶或注射器內(nèi)的產(chǎn)品可在大部分容器內(nèi)形成蛋白質顆粒。遺憾的是，這些顆粒在下游的滅菌過濾步驟出現(xiàn)，且在皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)注射過程中不可能通過過濾除去。

硅油在醫(yī)療制品中常常用作潤滑劑。盡管硅油不易于氧化，但對于預填充的注射器來說，可能出現(xiàn)遷移和粘附，和高拆卸(breakout)和/或松脫(breakloose)力成為問題。表明在一些條件下，甚至在低濃度下，硅油誘導蛋白質聚集。在預填充注射器內(nèi)制備數(shù)種最新商業(yè)化的含水蛋白質產(chǎn)品，其中包括紅細胞生成素(例如Recormon^TM和Eprex^TM)、干擾素(例如Avonex^TM和Rebif^TM)和類風濕關節(jié)炎治療劑(例如Enbrel^TM和Humira^TM)。預填充的注射器的內(nèi)表面用硅油涂布，以提高注射器的功能，因此配制的蛋白質暴露于硅油表面下。硅油誘導的治療性蛋白質聚集，從而潛在地導致產(chǎn)品損失和制備成本增加是藥物工業(yè)所關心的。

需要評估具有含蛋白質材料的含水懸浮液或乳液的方法，以決定在溶液內(nèi)包括合適的聚集抑制劑來抑制聚集。這些研究的結果將提供公司如何開發(fā)抗硅油誘導的蛋白質聚集的蛋白質配方所需的知識方面的建議。另外，期望提供快速配方篩選的實驗體系。因此，藥物和生物技術公司可遵守合理的配方開發(fā)計劃，針對每一蛋白質得到快速最佳配方，所述蛋白質將避免硅油誘導的蛋白質聚集問題和患者潛在的負面應答?？蓽y定在開發(fā)中測試新的注射器或醫(yī)療制品可使用的模型蛋白質和合適的溶液條件。

技術實現(xiàn)要素：

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供在含有機基聚硅氧烷的懸浮液內(nèi)含蛋白質材料的聚集的評價方法，該方法包括：(a)提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的含水懸浮液；(b)使用熒光活化的顆粒分類(sorting)，測量熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質材料的相對顆粒熒光強度；和(c)比較熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質材料的相對強度。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供在含有機基聚硅氧烷的懸浮液中，含蛋白質材料的聚集的評價方法，該方法包括：(a)提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質材料的含水懸浮液，其中當熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料各自暴露于由激光器發(fā)射的相同波長的光下時，用發(fā)射在第一波長范圍內(nèi)的光的第一熒光部分來標記有機基聚硅氧烷，和用發(fā)射第二波長范圍內(nèi)的光的第二熒光部分來標記含蛋白質的材料，其中第一波長范圍基本上不與第二波長范圍重疊；(b)使用熒光活化的顆粒分類，測量熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度；和(c)比較熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質材料的相對強度。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供在含有機基聚硅氧烷的懸浮液中抑制含蛋白質材料聚集的方法，該方法包括：(a)提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的多種含水懸浮液，其中每一含水懸浮液進一步包括選自非離子表面活性劑和糖類中的至少一種聚集抑制劑，其中(i)至少一種聚集抑制劑在每一含水懸浮液中不同，或者(ii)聚集抑制劑的用量在每一含水懸浮液中不同；(b)使用熒光活化的顆粒分類，測量在每一含水懸浮液內(nèi)，熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度；(c)對于每一含水懸浮液，比較熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度；和(d)對于每一含水懸浮液，基于熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度，選擇在包含含蛋白質的材料的懸浮液中所使用的至少一種聚集抑制劑。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供醫(yī)療制品，它包括：(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的內(nèi)表面在其上具有由含有機基聚硅氧烷的組合物制備的涂層；和(b)包括(i)至少一種含蛋白質的材料，(ii)至少一種非離子表面活性劑與(iii)至少一種糖的溶液。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供醫(yī)療制品，它包括：(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的內(nèi)表面在其上具有由含有機基聚硅氧烷的組合物制備的涂層；和(b)包括(i)至少一種含蛋白質的材料與(ii)至少一種非離子表面活性劑的溶液。

附圖說明

當結合附圖閱讀時，根據(jù)下述具體實施方案的說明，會最好地理解本發(fā)明：

圖1A是對于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含mAb和硅油的配方來說，作為時間的函數(shù)，mAb與硅油吸附/聚集的圖表；

圖1B是對于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及本發(fā)明含蔗糖、非離子表面活性劑、mAb和硅油的配方來說，作為時間的函數(shù)，mAb與硅油吸附/聚集的圖表；

圖2A是對于不具有蔗糖或表面活性劑的對照配方來說，F(xiàn)L1強度和FL2強度的熒光強度散射圖表；

圖2B是對于具有蔗糖的配方來說，F(xiàn)L1強度和FL2強度的熒光強度散射圖表；

圖2C是對于具有非離子表面活性劑的配方來說，F(xiàn)L1強度和FL2強度的熒光強度散射圖表；

圖2D是對于本發(fā)明具有蔗糖和非離子表面活性劑的配方來說，F(xiàn)L1強度和FL2強度的熒光強度散射圖表；

圖3A是對于不具有蔗糖或表面活性劑的對照配方來說，硅油液滴的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表；

圖3B是對于具有蔗糖的配方來說，硅油液滴的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表；

圖3C是對于具有非離子表面活性劑的配方來說，硅油液滴的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表；

圖3D是對于本發(fā)明具有非離子表面活性劑的配方來說，硅油液滴的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表；

圖4A是對于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含mAb和硅油的配方來說，作為時間的函數(shù)，光遮蔽(obscuration)的圖表；

圖4B是對于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及本發(fā)明含蔗糖、非離子表面活性劑、mAb和硅油的配方來說，作為時間的函數(shù)，光遮蔽的圖表；

圖5A是對于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含mAb和硅油的配方來說，作為時間的函數(shù)，mAb與硅油吸附/聚集的圖表；

圖5B是對于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含蔗糖、非離子表面活性劑、mAb和硅油的配方來說，作為時間的函數(shù)，mAb與硅油吸附/聚集的圖表；

圖6是基于正面和側面光散射，硅油液滴和聚集體分布的假設圖表；

圖7是對于三種不同的硅油粘度的硅油乳液配方來說，作為時間的函數(shù)，光遮蔽的圖表；

圖8是對于由1000cSt的硅油制備的配方來說，硅油液滴的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表；

圖9是對于由12,500cSt的硅油制備的配方來說，硅油液滴的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表；

圖10是本發(fā)明制備和分析有機基聚硅氧烷溶液樣品的方法的流程圖；

圖11是對于Pacific Blue^TM染料和Nile Red染料來說，作為波長的函數(shù)，歸一化的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的圖表；

圖12A是對于未標記的硅油樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖12B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖12C是對于用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖12D是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖13A是對于完好球形的尺寸范圍來說，作為顆粒體積的函數(shù)，理論顆粒表面積的圖表；

圖13B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，作為顆粒體積的函數(shù)，顆粒表面積的圖表；

圖14A是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖14B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖15A是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖15B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖16A是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖16B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和150mM鹽標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖16C是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和0.5M蔗糖標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖16D是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品；本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料、0.5M蔗糖、150mM鹽和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖17A是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，以及用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，在10μs的窗延長期(window extension)下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖17B是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，在10μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；

圖17C是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，以及用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，在2μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表；和

圖17D是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，在2μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。

具體實施方案

除了在操作例中以外，或者除非另有說明，在說明書和權利要求中所使用的表達成分用量、反應條件等等的所有數(shù)值要理解為在所有情況下用術語“約”修飾。因此，除非有相反的說明，在下述說明書和所附權利要求中列出的數(shù)值參數(shù)是近似值，它可隨本發(fā)明尋求獲得的所需性能而變化，最起碼，且沒有嘗試限制本申請范圍到權利要求等價的范圍上，每一數(shù)值參數(shù)至少應當鑒于所報道的有效數(shù)字和通過采用常見的近似技術來解釋。

盡管列出本發(fā)明寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實施例中列出的數(shù)值盡可能精確地報道。然而，任何數(shù)值固有地含有一些誤差，這些誤差必然來自于在它們各自的試驗測量中出現(xiàn)的標準偏差。此外，當此處列出改變范圍的數(shù)值范圍時，認為可使用包括所引證數(shù)值的這些數(shù)值的任何結合。

此外，應當理解，此處引證的任何數(shù)值范圍擬包括此處提出的所有子范圍。例如，范圍“1－10”擬包括在所引證的最小值1和引證的最大值10之間的所有子范圍且包括端值，亦即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。

盡管不希望束縛于任何理論，但蛋白質顆粒的形成可來自于在外來物質的納米顆粒和微粒表面上蛋白質聚集體的非均相成核。這些粒狀污染物可包括來自小瓶填充泵的金屬或有機硅(Silicone)碎片，在玻璃注射器的制備過程中產(chǎn)生的鎢微粒，和高溫去熱解(depyrogenation)工序導致的玻璃納米顆粒碎片。在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明的方法可與制備其表面用硅油或有機基聚硅氧烷涂布的預填充的注射器的方法結合使用。為確保塞體當注射產(chǎn)品時光滑、自由行進通過注射器筒體，硅油是所需要的。在硅油處理過的預填充的注射器(它可通過硅油微液滴成核)內(nèi)形成蛋白質顆粒也可能是所擔心的。盡管這種顆粒和可能來自于它們的蛋白質聚集體是普遍存在的，但在文獻中基本上沒有解決該問題的系統(tǒng)表征和掌控它的機理。在沒有這種洞察力的情況下，工業(yè)上繼續(xù)受蛋白質聚集和所致產(chǎn)品的損失、增加的成本以及對患者安全風險的困擾。

可通過使用熱動力學穩(wěn)定劑(例如蔗糖)，抑制均一的蛋白質聚集，其中所述熱動力學穩(wěn)定劑將使天然狀態(tài)的群組(ensemble)遠離結構膨脹的保形并朝向結構最緊湊的物種偏離。穩(wěn)定劑，例如蔗糖增加蛋白質的熱動力學穩(wěn)定性，因為它們優(yōu)先從蛋白質分子表面上排除。優(yōu)先排除的同時蛋白質的化學勢增加，這兩個因素的大小與暴露于溶劑下的蛋白質的表面積直接成正比且與暴露殘渣的側鏈的化學性能無關。優(yōu)先排除溶質將增加在天然狀態(tài)的群組內(nèi)最緊湊的天然狀態(tài)與充分展開的狀態(tài)或結構膨脹的物種之間的自由能壁壘，因為后者具有較大的表面積，因此有較大的化學勢增加。因此，蔗糖使平衡偏離結構膨脹的聚集競爭物種。

除了在蛋白質分子群內(nèi)物種分布的熱動力學調節(jié)以外，在溶液內(nèi)蛋白質-蛋白質的相互作用能是蛋白質聚集動力學的重要決定性因素。蛋白質的部分展開本身不足以引起聚集。它們還必須依照某一裝配反應，在該反應中兩個或更多蛋白質分子聚集。通過蛋白質-蛋白質的分子間能量，調節(jié)這一方法的動力學，這反過來可通過改變?nèi)芤簵l件來變更。這種“膠態(tài)”穩(wěn)定性可涉及二級滲透的維里系數(shù)B22。通過蛋白質分子之間的電荷-電荷相互作用，大大地影響這一參數(shù)。因此，溶液pH和離子濃度的變化會改變蛋白質-蛋白質的相互作用。

可使用表面積等于顆粒體積^2/3的完美液滴的理論模型，估計在有機基聚硅氧烷顆粒表面上粘附的含蛋白質的材料的表面積。參見，J.H.Jett等人，“Quantitation of Cell Surface Antigen Density by Flow Cytometry”，4^th Annual Symposium of Flow Cytometry,Voss,Norway(1979年6月4日)(1979年1月1日公布)(摘要)。通過相關測量曲線的斜率，推導在光學背景存在下，與熒光標記的有機基聚硅氧烷表面有關的熒光標記的蛋白質的檢測證明，其中作為具有完美球形的體積的函數(shù)，所述斜率值接近于表面積的2/3次方(10^2/3)的理論值。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供在含有機基聚硅氧烷的懸浮液中含蛋白質的材料聚集的評價方法，該方法包括：(a)提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的含水懸浮液(或乳液)；(b)使用熒光活化的顆粒分類(sorting)，測量熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質材料的相對顆粒熒光強度；和(c)比較熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質材料的相對強度。

此處所使用的“含蛋白質的材料”是指含至少一種蛋白質的材料。此處所使用的“蛋白質”是大的有機化合物，它包括在線型鏈內(nèi)排列且通過相鄰氨基酸殘基上的羧基和氨基之間的肽鍵連接在一起的氨基酸，例如纖維蛋白、球蛋白和蛋白質絡合物。在本發(fā)明中使用的合適的含蛋白質的材料的非限定性實例包括單克隆抗體(mAb或moAb)、單特異抗體(它們是相同的)，因為它們通過一類免疫細胞產(chǎn)生，所述免疫細胞全部是單一母細胞的克隆。合適的單克隆抗體的非限定性實例包括infliximab、basiliximab、阿昔單抗、daclizumab、gemtuzumab、alemtuzumab、rituximab、palivizumab、trastuzumab和etanercept。合適的含蛋白質的材料的其它非限定性實例包括粒細胞克隆刺激因子(例如，Neupogen^TM)、紅細胞生成素(例如，Recormon^TM和Eprex^TM)，干擾素(例如，Avonex^TM和Rebif^TM)和類風濕關節(jié)炎治療劑(例如，Enbrel^TM、Humira^TM和Orencia^TM)。含蛋白質的材料被標記或者具有當暴露于紫外或紅外光下時能發(fā)熒光的熒光部分固定到其上，正如以下詳細地描述的。

在一些非限定性實施方案中，含蛋白質的材料在溶液內(nèi)的存在濃度為約20－約600μg/ml，或約100－約300μg/ml，基于水溶液的總體積。

有機基聚硅氧烷可以是任何有機基聚硅氧烷或硅油，例如涂布醫(yī)療制品，例如注射器筒體表面可使用的那些。在一些非限定性實施方案中，在任何固化步驟之前，有機基聚硅氧烷的粘度范圍為約100－約1,000,000厘沲(cSt)，或者約1,000cSt－約100,000cSt，或約1,000cSt－約15,000cSt，或約12,500cSt。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷包括烷基取代的有機基聚硅氧烷，例如用下述結構式(I)表示：

其中R是烷基和Z是約30－約4500。在一些非限定性實施方案中，式(I)的有機基聚硅氧烷可用下述結構式(II)表示：

其中Z可以如上所述，或者例如可以是約300－約2000，約300－約1800，或約300－約1350。在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷，例如DOW360聚二甲基硅氧烷或NUSIL聚二甲基硅氧烷，其粘度范圍為約100－約1,000,000cSt。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷包括一個或更多個可固化或反應性官能團，例如烯基。每一烯基可獨立地選自乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基和癸烯基。本領域的技術人員要理解有機基聚硅氧烷可包括一個或更多個前述任何類型的烯基及其混合物。在一些實施方案中，至少一個烯基是乙烯基。更高級的烯基或乙烯基含量提供更加有效的交聯(lián)。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷可以用下述結構式(III)或(IV)表示：

其中R是烷基、鹵代烷基、芳基、鹵代芳基、環(huán)烷基、硅雜環(huán)戊基、芳烷基，及其混合物，X是約60－約1000，優(yōu)選約200－約320，和y是約3－約25。還考慮共聚物和這些聚合物的混合物。

有用的乙烯基官能的有機基聚硅氧烷的非限定性實例包括：乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷；三甲基甲硅烷氧基封端的乙烯基甲基，二甲基聚硅氧烷共聚物；乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的乙烯基甲基，二甲基聚硅氧烷共聚物；二乙烯基甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷；乙烯基，正丁基甲基封端的聚二甲基硅氧烷；和乙烯基苯基甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷。

在一些實施方案中，可使用選自式II、III和/或IV中的那些硅氧烷聚合物的混合物。例如，該混合物可包括兩種不同分子量的乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷聚合物，其中聚合物之一的平均分子量為約1000－約25,000，和優(yōu)選約16,000，和另一聚合物的平均分子量為約30,000－約71,000，和優(yōu)選約38,000。一般地，較低分子量的硅氧烷的存在量可以是這一混合物的約20％－約80％，例如約60wt％；和較高分子量的硅氧烷的存在量可以是這一混合物的約80％－約20％，例如約40wt％。

合適的乙烯基官能的有機基聚硅氧烷的另一非限定性實例是三甲基甲硅烷氧基封端的(7.0－8.0％乙烯基甲基硅氧烷)-二甲基硅氧烷共聚物，例如VDT-731乙烯基甲基硅氧烷共聚物，其商購于Gelest Inc.,of Morrisville,PA。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷可包括至少兩個極性基團。每一極性基團可獨立地選自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、氨基、亞氨基、羥基、環(huán)氧基、酯、烷氧基、異氰酸酯基、酚基、聚氨酯低聚物、聚酰胺低聚物、聚酯低聚物、聚醚低聚物、多元醇的基團和羧丙基。本領域的技術人員要理解有機基聚硅氧烷可包括任何上述極性基團中的一種或更多種及其混合物。在一些非限定性實施方案中，極性基團是丙烯酸酯基，例如丙烯酰氧基丙基。在其他實施方案中，極性基團是甲基丙烯酸酯基，例如甲基丙烯酰氧基丙基。具有極性基團的有機基聚硅氧烷可進一步包括一個或更多個烷基和/或芳基，例如甲基、乙基或苯基。

這種有機基聚硅氧烷的非限定性實例包括[15-20％(丙烯酰氧基丙基)甲基硅氧烷]-二甲基硅氧烷共聚物，例如UMS-182丙烯酸酯官能的硅氧烷，其獲自Gelest,Inc.of Morrisville,PA，和PC970丙烯酸酯化有機硅聚合物，其獲自Rhodia-Silicones。

在一些非限定性實施方案中，這種有機基聚硅氧烷可用下式(V)表示：

其中R₁選自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、氨基、亞氨基、羥基、環(huán)氧基、酯、烷氧基、異氰酸酯、酚基、聚氨酯低聚物、聚酰胺低聚物、聚酯低聚物、聚醚低聚物、多元醇的基團、羧丙基和氟基；和R₂是烷基，n的范圍為2－4，和x是足以得到潤滑劑粘度為約100－1,000,000cSt的整數(shù)。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷可進一步包括一個或更多個氟基，例如－F或氟代烷基，例如三氟甲基。其他有用的有機基聚硅氧烷包括聚氟代烷基甲基硅氧烷和氟代烷基，二甲基硅氧烷共聚物。

在一些非限定性實施方案中，組合物可進一步包括一種或更多種環(huán)狀硅氧烷，例如八甲基環(huán)四硅氧烷和/或十甲基環(huán)五硅氧烷。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷可用下述結構式(VI)表示：

其中R是鹵代烷基、芳基(例如苯基)、鹵代芳基、環(huán)烷基、硅雜環(huán)戊基、芳烷基及其混合物，和Z是約20－約1800。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷包括至少兩個側掛的氫基。含至少兩個側掛氫基的合適的有機基聚硅氧烷的非限定性實例包括沿著聚合物主鏈具有多個側掛氫基或多個端基氫基的有機基聚硅氧烷。在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷可用下述結構式(VII)表示：

其中p為約8－約125，例如約30。在其他非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷可用下述結構式(VIII)表示：

HMe₂SiO(Me₂SiO)_pSiMe₂H (VIII)

其中p為約140－約170，例如約150－約160?？墒褂煤瑑煞N不同分子量材料的這些聚合物的混合物。例如，可混合使用占該混合物約2％－約5wt％平均分子量為約400－約7500，例如約1900的三甲基甲硅烷氧基封端的聚甲基氫硅氧烷與為約98％－95％平均分子量為約400－約37,000和優(yōu)選約12,000的二甲基氫甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷的混合物。含至少兩個側掛氫基的有用的有機基聚硅氧烷的非限定性實例包括二甲基氫封端的聚二甲基硅氧烷；甲基氫，二甲基聚硅氧烷共聚物；二甲基氫甲硅烷氧基封端的甲基辛基二甲基聚硅氧烷共聚物；和甲基氫，苯基甲基硅氧烷共聚物。

在一些非限定性實施方案中，組合物包括羥基官能的硅氧烷，例如含至少兩個羥基的羥基官能的硅氧烷，例如：

其中R₂是烷基，n的范圍為0－4，和x是足以得到潤滑劑粘度為約100－1,000,000cSt的整數(shù)。在一些非限定性實施方案中，作為官能度的結果，具有濕固化特征的可濕固化的硅氧烷包括具有例如下述官能團：烷氧基、芳氧基、肟、環(huán)氧基、-OOCR、N,N-二烷基氨基、N,N-二烷基氨氧基、N-烷基酰胺基、-O-NH-C(O)-R、-O-C(＝NCH₃)-NH-CH₃和-O-C(CH₃)＝CH₂的硅氧烷，其中R是H或烴基。此處所使用的“可濕固化”是指硅氧烷在大氣濕氣存在下，在環(huán)境條件下是可固化的。

可在本發(fā)明中使用以上所述的任何有機基聚硅氧烷的混合物。

在一些非限定性實施方案中，有機基聚硅氧烷占溶液的約0.001－約1wt％。

含蛋白質的材料和有機基聚硅氧烷各自用在不同的基本上不重疊的波長的光下發(fā)熒光的熒光部分來標記。此外，若存在多于一類的含蛋白質的材料和/或多于一類的有機基聚硅氧烷，則每一種不同類型的含蛋白質的材料和/或每一種不同類型的有機基聚硅氧烷可用在不同的基本上不重疊的波長的光下發(fā)熒光的熒光部分來標記。

此處所使用的“不同類型”的含蛋白質的材料是指化學不同的含蛋白質的材料，例如第一種含蛋白質的材料具有至少一個與第二類含蛋白質的材料不同的原子或不同的原子結構。類似地，此處所使用的“不同類型”的有機基聚硅氧烷是指化學不同的有機基聚硅氧烷，例如第一有機基聚硅氧烷具有至少一個與第二類有機基聚硅氧烷不同的原子或不同的原子結構。

為了激發(fā)和/或發(fā)射特征，選擇標記含蛋白質的材料和有機基聚硅氧烷所使用的各熒光部分，最小化光學背景貢獻，所述光學背景貢獻可來自于在測量其他熒光部分所使用的檢測儀內(nèi)出現(xiàn)的一種熒光部分的光譜發(fā)射。

當?shù)谝粺晒獠糠趾偷诙晒獠糠指髯员┞队谟杉す馄靼l(fā)射的相同波長的光下時，用在第一波長范圍內(nèi)發(fā)光的第一熒光部分來標記有機基聚硅氧烷，和用在第二波長范圍內(nèi)發(fā)光的第二熒光部分來標記含蛋白質的材料，其中第一波長范圍基本上不與第二波長范圍重疊。

此處所使用的“基本上不重疊”是指選擇各熒光染料，以便當通過相同的激光器激發(fā)時，其發(fā)射光譜具有最小或不具有顯著的重疊。在一些非限定性實施方案中，“基本上不重疊”可以是指基于第一波長范圍和第二波長范圍的全部結合的歸一化波長范圍，第一波長范圍與第二波長范圍重疊小于5％，或者小于2％，或者小于1％。例如，當暴露于405nm的紫外激光器下時，可用發(fā)射在450nm－650nm范圍內(nèi)不可檢測水平的光的Nile Red熒光部分來標記有機基聚硅氧烷，和用發(fā)射在340nm－450nm范圍內(nèi)的光的Pacific Blue染料標記含蛋白質的材料。

通過最小化來自用不同熒光部分標記的其他材料的光學背景貢獻，這一方法將最大化小量第一熒光標記材料的檢測靈敏度。例如，可通過最小化來自熒光標記的有機基聚硅氧烷的光學背景貢獻，提高小量標記蛋白質的檢測靈敏度。若存在未與周圍緩沖液內(nèi)殘留的油滴結合(associated with)的任何游離的標記蛋白質，則這對于檢測靈敏度來說是理想的。

現(xiàn)參考單一類型的含蛋白質的材料和單一類型的有機基聚硅氧烷，討論含蛋白質的材料和有機基聚硅氧烷的標記，但本領域的技術人員要理解使用在顯著不同波長下發(fā)熒光的部分的相同概念可用于多種含蛋白質的材料和多種有機基聚硅氧烷上。在一些非限定性實施方案中，與蛋白質共軛的熒光部分可選自用紫外(405nm)、藍(488nm)或紅(635nm)激光器激發(fā)的部分，只要發(fā)射帶基本上沒有與以上所述的標記有機基聚硅氧烷所選的其他熒光部分或染料的那些重疊即可。

例如，如圖11所示，可使用Nile Red標記有機基聚硅氧烷并在寬的范圍(450nm－650nm，其最大值在559nm附近)內(nèi)或575nm－750nm范圍激發(fā)或發(fā)射，以及它們可與藍色或綠色激光器一起使用。若使用Nile Red標記油，則希望選擇在不同的光譜區(qū)域內(nèi)激發(fā)并發(fā)射的蛋白質用標記物，和使用具有空間分離的激光器的流式細胞計體系進行測量，以獲得最優(yōu)化靈敏度。當用Nile Red標記有機基聚硅氧烷時，標記含蛋白質的材料適合使用的熒光部分的非限定性實例包括基于6,8-二氟-7-羥基香豆素熒光團的Pacific Blue^TM染料(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，它在340nm－450nm的特定范圍內(nèi)，且最大值在403nm附近處激發(fā)，且可與紫外激光器一起使用；BD Horizon^TM V450(Becton Dickinson)，它在特定范圍內(nèi)(340nm－450nm，且最大值在403nm附近處)激發(fā)且可與紫外激光器一起使用；Cyan Fluorescent Protein(CFP)，它在350nm－495nm的特定范圍內(nèi)且最大值在435nm附近處激發(fā)且可與紫外激光器一起使用；從Anemonia Majano處得到的AmCyan 108kDa蛋白質(Becton Dickinson)，它在特定范圍內(nèi)(360nm－500nm，且最大值在458nm附近處)激發(fā)且可與紫外激光器一起使用；525(Invitrogen Corporation)，它在<300nm到520nm的特定范圍內(nèi)激發(fā)且可與紫外激光器一起使用；和545(Invitrogen Corporation)，它在<300nm到540nm的特定范圍內(nèi)激發(fā)且可與紫外激光器一起使用。或者，可使用Nile Red標記含蛋白質的材料和可使用以上所述的其他染料之一標記有機基聚硅氧烷。

或者，可通過本領域技術人員公知的各種方式，使用各種親脂染料，例如1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)、雙十八烷基-吲哚碳菁(indocarbocyanine)(DiL)、3,3`-雙十八烷基氧基碳菁(carbocyanine)高氯酸鹽(DiO)、DiIC18(5)(DiD)、1,1`-雙十八烷基-3,3,3`,3`-四甲基吲哚三碳菁(indotricarbocyanine)碘化物(DiR)或任何其他親脂染料標記有機基聚硅氧烷，具體地利用各種激光器和熒光光譜區(qū)域，它們將最小化影響使用光譜其他區(qū)域檢測熒光標記的蛋白質所要求的任何同時的高靈敏度測量。例如，若使用DiD標記有機基聚硅氧烷(在670nm附近處，紅色激光器激發(fā)和發(fā)射)，則所有激發(fā)和發(fā)射范圍都在可用于檢測一種或更多種熒光標記的蛋白質的那些范圍之下，從而在標記含蛋白質的材料所使用的發(fā)射光譜沒有顯著重疊的情況下，使得能使用UV、紫外、藍色或綠色激光器激發(fā)的熒光染料。

在一些實施方案中，熒光部分可選自在綠色范圍內(nèi)(525-585nm)的發(fā)熒光的部分(通常標記的FL1)，例如FITC異硫氰酸熒光素、Alexa Fluor 488、DyLight 488、GFP Green熒光蛋白質、CFDA-SE二乙酸羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯，PI Phosphoinositide；在橙色范圍內(nèi)(通常FL2)發(fā)熒光的部分，例如PE R-Phycoerythrine；在紅色范圍內(nèi)(通常FL3)發(fā)熒光的部分，PerCP Peridinin Chlorophyll Protein、PE-Cy5R-Phycoerythrin Cyanine 5、PE-Alexa Fluor 700、PE-Cy5.5R-Phycoerythrin Cyanine 5.5；在遠紅外范圍內(nèi)(通常FL4)發(fā)熒光的部分：PE-Alexa Fluor 750、PE-Cy 7；使用紅色二極管激光器(635nm)發(fā)熒光的部分。

對于掃描的顆粒來說，可使用來自紫外激光器(405nm)、藍色激光器(488nm)、綠色激光器(532nm)、黃色激光器(561nm)和紅色激光器(635nm)激發(fā)的熒光染料的正面光散射(FSC，小角光散射)和側面光散射(SSC，90°光散射)熒光。在一些非限定性實施方案中，根據(jù)文獻公知的方案(MP 00143,Amine-Reactive Probes,Invitrogen Corporation)，可用Alexa488染料(Invitrogen Corporation，Carlsbad,CA)化學標記含蛋白質的材料。在其他非限定性實施方案中，根據(jù)本領域技術人員公知的方法，例如可通過使用獲自Invitrogen的合適的商業(yè)操作盒，用Pacific Blue^TM染料化學標記含蛋白質的材料。為了標記有機基聚硅氧烷，可將Nile Red染料以5mg/ml溶解在有機基聚硅氧烷內(nèi)。Nile Red，9-二乙基氨基-5-苯并吩嗪-5-酮是極其疏水的染料，其熒光在水中被充分地猝滅。

Pacific Blue^TM染料在404nm處具有激發(fā)最大值，和在455nm處具有發(fā)射最大值，和Nile Red染料在559nm處具有激發(fā)最大值，和在637nm處具有發(fā)射最大值。Nile Red在紫外激光器波長處基本上不激發(fā)，這將最小化來自測量蛋白質顆粒所使用的檢測儀內(nèi)有機基聚硅氧烷的光學背景。相反，當顆粒橫穿藍色激光器時，Pacific Blue^TM染料沒有激發(fā)，從而最小化信號溢出到Nile Red檢測儀內(nèi)?？刹捎肂D FACScan^TM流式細胞計分析儀或多激光器BD FACSCanto^TM流式細胞計分析儀或BD^TMLSR II流式細胞計(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ)，掃描具有化學標記的mAb和染色的有機基聚硅氧烷的懸浮液。

流式細胞法是計數(shù)、檢測和分類在流體物流內(nèi)懸浮的微觀顆粒的分析方法。它允許同時多參數(shù)分析流經(jīng)光學和/或電學檢測裝置的單一顆粒的物理和/或化學特征。在流式細胞計中，一個或更多個單色光光束(通常激光器光)聚焦在流體動力學聚焦的含樣品的流體物流上。校準多個檢測儀到其中物流流經(jīng)光束的點；其中一個與主要光束在一條直線上(Forward Scatter或FSC)和數(shù)個與其(Side Scatter或SSC)和一個或更多個熒光檢測儀垂直。根據(jù)Mie理論，流經(jīng)緊密聚焦的光束的每一懸浮顆粒在各方向上散射光，和可使固定到顆粒上的熒光標記物激發(fā)，在比光源低的頻率下發(fā)光。通過檢測儀，檢測散射和熒光的這一組合。通過分析在每一檢測儀處亮度的波動(每一亮度針對各熒光發(fā)射峰)，可得到關于每一單獨顆粒的物理和化學結構的各類信息。FSC通常與粒度和折射特征很好地相關，且SSC取決于顆粒的尺寸和內(nèi)部復雜度(即細胞核的形狀，顆粒的含量和類型或顆粒粗糙度)。一些流式細胞計形成每一顆粒熒光的圖形，散射光并透射光。

流式細胞計每秒能分析數(shù)千種顆粒，和多激光器FACS細胞分類器，例如BD FACSAria^TM II和BD^TM Influx分類平臺(platform)可活躍地分離并分開具有特定性能的顆粒。流式細胞計包括攜帶并校準細胞的流動池-液體物流(溶液)，以便它們使單一file通過光束以供傳感(sensing)；一種或更多種光源，例如汞或氙燈、高功率水冷激光器(氬氣、氪氣、染料激光器)、低功率空氣冷卻激光器(氬氣(488nm)、紅-HeNe(633nm)、綠色-HeNe、HeCd(UV))或二極管激光器(藍色、綠色、紅色、紫外)；產(chǎn)生FSC和SSC以及熒光信號的多檢測儀，Analog to Digital Conversion(ADC)體系，線性或對數(shù)放大體系，和信號分析用計算機?？梢砸詥我粎?shù)直方圖(histogram)形式，以二維點圖(散射圖、密度或輪廓圖)形式或甚至以三維等角顯示形式，標出通過流式細胞計生成的數(shù)據(jù)。可畫出感興趣的圖形區(qū)域，確定感興趣的群落，和通常通過暗含的Boolean AND邏輯圖，以多層門樹(hierarchal gate tree)形式結合，其中術語“門”是指在感興趣的顆粒駐留在其內(nèi)的一個或更多個結合的感興趣的區(qū)域。當數(shù)據(jù)具有最多40或50的大的動態(tài)范圍時，常常以對數(shù)標度作圖。由于不同的熒光染料的發(fā)射光譜重疊，因此，可電學以及計算補償來自檢測儀的信號。然而，盡管這一方法再校準群的中值，但來自起始測量中的光子統(tǒng)計的效果保留，從而導致顯著再校準的群內(nèi)“擴散(spread)”(即，其中來自其他熒光信號的背景貢獻顯著)。典型地，采用軟件，例如BD FACSDiva Software獲得數(shù)據(jù)后，再分析使用流式細胞計獲得的數(shù)據(jù)。

熒光活化的細胞(cell)分類或顆粒分類是流式細胞法的專門類型。它提供顆粒的非均相混合物分類成兩種或更多種容器內(nèi)的方法，其中基于每一細胞的特定的光散射和熒光特征，一次一個細胞。它記錄來自單獨細胞的熒光信號，且物理分離特別感興趣的細胞?？s寫FACS由Becton Dickinson市售并擁有。

顆粒懸浮液夾帶在窄的快速流動的液體物流中心內(nèi)。布局流動，以便相對于其直徑，在顆粒之間平均存在大的分離(Poisson分布)。振動機理引起顆粒物流分成單獨的液滴。調節(jié)該體系，以便大于一個顆粒在一個液滴內(nèi)的可能性低。在物流破碎成液滴之前，流體立即流經(jīng)一個或更多個激光器的交叉點處，在此測量感興趣的每一顆粒的熒光特征。若要收集顆粒，則在一個或更多個液滴形成和從物流中破碎的時間段期間，施加電荷到流動細胞上。這些荷電的液滴然后下落經(jīng)過靜電偏離體系，基于施加到液滴上的電荷，使液滴轉向到目標容器內(nèi)。

通過使用例如熒光活化的顆粒掃描裝置或FACS^TM流式細胞計之類的裝置，可使用熒光活化的顆粒分類，測定熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度。可將熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度相比較，并可測定與有機基聚硅氧烷聚集或附聚在一起的含蛋白質的材料量。含蛋白質的材料與有機基聚硅氧烷的“聚集”包括含蛋白質的材料吸附到有機基聚硅氧烷上以及通過有機基聚硅氧烷成核，聚集含蛋白質的材料，且包括有機基聚硅氧烷和含蛋白質的材料之間的任何不可逆的締合。

可通過熒光活化的顆粒掃描，分析每一溶液，測定顆粒組成?？墒褂脽晒饣罨念w粒掃描，分析粒度、形貌和相對顆粒熒光。其他有用的分析包括測定懸浮液的濁度，硅油液滴數(shù)量濃度和硅油液滴尺寸分布?？墒褂肞erkinElmer Lambda 35分光光度計(Wellesley,MA)，測定光學密度。在簡單且溫和攪拌使液滴聚集體解絮凝時，可作為時間和配制條件的函數(shù)，在660nm處測量硅油懸浮液的光學密度。在含水濾液中，可測量含蛋白質的材料在280nm處的吸光度，以測定mAb濃度?；蛘?，可采用Coomassie染料結合分析(Coomassie Plus^TM Better Bradford Assay Kit,Pierce Biotechnology,Rockford,IL)，測量含蛋白質的材料的濃度。

可使用Coulter LS230激光衍射粒度分析儀(Beckman Coulter,Fullerton,CA)，測量硅油液滴尺寸分布?？蓽y量相對尺寸分布?？稍诰罅⒓?，和在懸浮液制備之后最多2周，作為時間的函數(shù)，測量懸浮液的相對尺寸分布。根據(jù)硅油液滴的相對尺寸分布和數(shù)量濃度，可估計總的硅油表面積。

在一些非限定性實施方案中，可使用FRET(熒光共振能轉移或Forster共振能轉移)，測定熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度，其中供體熒光部分固定到油上和受體熒光部分固定到蛋白質上。通過使用FRET技術，不會發(fā)生來自受體的發(fā)射，除非它與油表面極其靠近地接觸，這可使得能更加精確地測量。處于激發(fā)態(tài)下的供體生色團可通過非輻射的長范圍偶極-偶極偶聯(lián)機理，在鄰近處(典型地<10nm)轉移能量到受體生色團上。為了監(jiān)控兩個分子之間的絡合物形成，它們之一用供體標記和另一個用受體標記，和混合這些熒光染料標記的分子。當分子解離時，一旦供體激發(fā)，則檢測供體發(fā)射。另一方面，當由于兩個分子之間的相互作用導致供體和受體鄰近(1-10nm)時，主要觀察到受體發(fā)射，因為從供體到受體存在分子間FRET。

在一些非限定性實施方案中，含水懸浮液進一步包括至少一種非離子表面活性劑。該非離子表面活性劑可降低硅油的聚結速度。因此，當非離子表面活性劑存在時，懸浮油滴更長時間地保持在溶液內(nèi)。

合適的非離子表面活性劑的非限定性實例包括炔類二元醇，烷醇酰胺，烷醇胺，烷基酚類，脂肪酸，脂肪醇，脂肪酯，甘油酯，單十二烷基醚，酚類衍生物，泊洛沙姆、poloxamine、聚氧乙烯?；?、聚氧乙烯二醇十二烷基醚、山梨醇、脫水山梨醇衍生物及其混合物。在一些非限定性實施方案中，非離子表面活性劑是選自脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯及其混合物中的脫水山梨醇衍生物。在一些非限定性實施方案中，非離子表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，例如Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯，也稱為Polysorbate 20。其他有用的聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯包括Polysorbate21、Polysorbate40、Polysorbate60、Polysorbate61、Polysorbate65、Polysorbate80、Polysorbate81、Polysorbate85或Polysorbate120。

在溶液內(nèi)非離子表面活性劑的用量范圍可以是約0.001－約0.5wt％，基于水溶液的總重量。

在一些非限定性實施方案中，含水懸浮液進一步包括至少一種糖。糖可提高有機基聚硅氧烷聚結的速度，以便可獲得較少的有機基聚硅氧烷表面積吸引含蛋白質的材料。合適的糖類包括單糖、二糖、三糖、低聚糖及其混合物。合適的糖類的非限定性實例包括蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖及其混合物。

溶液內(nèi)糖的用量范圍可以是約0.005-約10wt％，基于水溶液的總重量。

糖和非離子表面活性劑的結合存在可進一步降低含蛋白質的材料的聚集。在一些非限定性實施方案中，該溶液可包括至少一種糖和至少一種非離子表面活性劑，例如聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯和蔗糖，其用量或濃度例如如上所述。

在一些非限定性實施方案中，該方法進一步包括提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的多種含水懸浮液，其中每一含水懸浮液進一步包括選自非離子表面活性劑和糖類中的至少一種聚集抑制劑，其中至少一種聚集抑制劑的濃度在每一含水懸浮液內(nèi)不同，從而使用熒光活化的顆粒分類，測量每一含水懸浮液內(nèi)熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度；并針對每一含水懸浮液，比較熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度。

在一些非限定性實施方案中，該方法進一步包括提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的多種含水懸浮液，其中每一含水懸浮液進一步包括選自非離子表面活性劑和糖類中的至少一種聚集抑制劑，其中至少一種聚集抑制劑在每一含水懸浮液內(nèi)不同，從而使用熒光活化的顆粒分類，測量每一含水懸浮液內(nèi)熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度；并針對每一含水懸浮液，比較熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度。在每一溶液內(nèi)聚集抑制劑化學不同或者類型不同，例如是不同的糖類和/或不同的非離子表面活性劑。

參考圖10，示出了本發(fā)明制備和分析有機基聚硅氧烷溶液樣品的方法的流程圖?？扇缟纤鲆约耙韵聦嵤├鼳中詳細地描述的，制備并分析該溶液。

在一些非限定性實施方案中，該方法進一步包括針對每一含水懸浮液，基于熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度的比較，選擇至少一種聚集抑制劑以供在包括含蛋白質的材料的懸浮液中使用。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供在含有機基聚硅氧烷的懸浮液內(nèi)抑制含蛋白質的材料聚集的方法，該方法包括：(a)提供熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的多種含水懸浮液，其中每一含水懸浮液進一步包括選自非離子表面活性劑和糖類中的至少一種聚集抑制劑，其中(i)至少一種聚集抑制劑在每一含水懸浮液內(nèi)不同，或者(ii)聚集抑制劑的用量在每一含水懸浮液內(nèi)不同；(b)使用熒光活化的顆粒分類，測量在每一含水懸浮液內(nèi)，熒光標記的有機基聚硅氧烷和熒光標記的含蛋白質的材料的相對顆粒熒光強度；(c)針對每一含水懸浮液，將熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度相對比；和(d)針對每一含水懸浮液，基于熒光標記的有機基聚硅氧烷的相對強度與熒光標記的含蛋白質的材料的相對強度的比較，選擇至少一種聚集抑制劑以供在包括含蛋白質的材料的懸浮液中使用。

通過一種或更多種上述方法，可測定在醫(yī)療制品中使用的糖和非離子表面活性劑的合適結合物(及其合適濃度)，所述醫(yī)療制品在與包括含蛋白質的材料的溶液接觸的表面上使用了有機基聚硅氧烷涂層。

在一些非限定性實施方案中，本發(fā)明提供醫(yī)療制品，它包括(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的內(nèi)表面在其上具有由含有機基聚硅氧烷的組合物制備的涂層；和(b)包括(i)至少一種含蛋白質的材料，(ii)至少一種非離子表面活性劑與(iii)至少一種糖的溶液。

此處所使用的“醫(yī)療制品”是指可用于醫(yī)藥治療的制品或裝置。醫(yī)療制品的非限定性實例包括注射器組件、藥物操作盒、無針注射器、液體分配器件和液體計量器件。在一些實施方案中，醫(yī)療制品是含注射器腔室或筒體的注射器組件(以供接收例如包括含蛋白質的材料的溶液)和密封元件。

可由玻璃、金屬、陶瓷、塑料、橡膠或其結合物形成腔室。在一些非限定性實施方案中，由一種或更多種烯烴聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯、聚(1-丁烯)、聚(2-甲基-1-戊烯)和/或環(huán)狀聚烯烴制備腔室。例如聚烯烴可以是脂族單烯烴的均聚物或共聚物，脂族單烯烴優(yōu)選具有約2－約6個碳原子，例如聚丙烯。在一些非限定性實施方案中，聚烯烴可以是基本上線型，但任選地可含有側鏈，例如在常規(guī)低密度聚乙烯中所出現(xiàn)的。在一些非限定性實施方案中，聚烯烴為至少50％全同立構。在其他實施方案中，聚烯烴在結構中有至少約90％全同立構。在一些非限定性實施方案中，可使用間同立構聚合物。在一些實施方案中，可使用環(huán)狀聚烯烴。合適的環(huán)狀聚烯烴的非限定性實例包括降冰片烯聚合物，例如在美國專利中所公開的Nos.6,525,144、6,511,756、5,599,882和5,034,482(均為Nippon Zeon)，7,037,993、6,995,226、6,908,970、6,653,424和6,486,264(均為Zeon Corp.)，7,026,401和6,951,898(Ttcona)，6,063,886(Mitsui Chemicals)，5,866,662，5,856,414，5,623,039和5,610,253(Hoechst)，5,854,349和5,650,471(Mitsui Petrochemical and Hoechst)以及在"Polycyclic olefins"中所描述的，process Economics Program(July 1998)SRI Consulting，前述每一篇在此通過參考并入。合適的環(huán)狀聚烯烴的非限定性實例包括獲自Mitsui Petrochemical的Apel^TM環(huán)狀聚烯烴，獲自Ticona Engineering Polymers的Topas^TM環(huán)狀聚烯烴，獲自Zeon Corporation的Zeonor^TM或Zeonex^TM環(huán)狀聚烯烴，以及獲自Promerus LLC的環(huán)狀聚烯烴。

聚烯烴可含有小量，通常約0.1－10％通過與合適單體共聚，引入到組合物內(nèi)的額外的聚合物?？商砑舆@種共聚物到組合物中，以提高最終組合物的其他特征，且這種聚合物可以是例如聚丙烯酸酯，聚苯乙烯和類似物。

在一些非限定性實施方案中，腔室可由聚烯烴組合物構造，所述聚烯烴組合物包括輻射穩(wěn)定添加劑，以賦予容器輻射穩(wěn)定性，例如有助于容器輻射穩(wěn)定性的遷移(mobilizing)添加劑，例如在轉讓給Becton,Dickinson and Company的美國專利Nos.4959402和4994552中所公開的那些，在此通過參考并入。

與腔室接觸的醫(yī)療制品中的其他組件是密封元件。密封元件可由任何彈性或塑性材料形成。在醫(yī)療器件和藥物包裝中，在許多重要和關鍵的應用中使用彈性體。作為一組材料，它們獨特的特征，例如撓性、回彈性、延伸性和可密封性證明尤其非常適合于例如導管、注射器尖端、藥物小瓶制品、管道、手套和軟管之類的產(chǎn)品。典型地在醫(yī)療應用中使用三種主要的合成熱固性彈性體：聚異戊二烯橡膠、硅橡膠和丁基橡膠。在這三種橡膠當中，丁基橡膠是制品最常見的選擇，因為它具有高的清潔度和抗?jié)B透性，這使得橡膠能保護對氧氣和水敏感的藥物。

可用于本發(fā)明方法的合適的丁基橡膠包括異丁烯(約97－98％)和異戊二烯(約2－3％)的共聚物?？捎寐然蜾鍋睇u化丁基橡膠。合適的丁基橡膠硫化膠可提供由其形成的制品良好的耐磨蝕性，優(yōu)良的不透氣性，高的介電常數(shù)，優(yōu)良的抗老化和陽光性，和優(yōu)異的振動吸收和振動阻尼質量。合適的橡膠塞體的非限定性實例包括獲自于West Pharmaceuticals,American Gasket Rubber,Stelmi,and Helvoet Rubber&Plastic Technologies BV的那些。

其他有用的彈性體共聚物沒有限制地包括熱塑性彈性體，熱塑性硫化膠，苯乙烯類共聚物，例如苯乙烯-丁二烯(SBR或SBS)共聚物，苯乙烯-異戊二烯(SIS)嵌段聚合物或苯乙烯-異戊二烯/丁二烯(SIBS)，其中在苯乙烯嵌段共聚物內(nèi)苯乙烯的含量范圍為約10％－約70％，和優(yōu)選約20％－約50％。合適的苯乙烯-丁二烯塞體的非限定性實例獲自Firestone Polymers,Dow,Reichhold,Kokoku Rubber Inc.,和Chemix Ltd。其他合適的熱塑性彈性體獲自例如GLS,Tecknor Apex,AES,Mitsubishi和Solvay Engineered Polymers。彈性體組合物可沒有限制地包括抗氧化劑和/或無機增強劑，以保護彈性體組合物的穩(wěn)定性。

在一些實施方案中，密封元件可以是例如塞體、O形環(huán)、活塞尖端或柱塞。注射器的活塞尖端或柱塞典型地由可壓縮的回彈材料，例如橡膠制成，因為橡膠能在活塞和注射器的內(nèi)殼之間提供密封。注射器活塞，例如在患者的護理和治療中所使用的其他設備必須滿足高性能標準，例如能在活塞和注射器的筒體之間提供緊密的密封的能力。

將有機基聚硅氧烷涂層施加到腔室和/或密封元件的至少一部分滑動表面上。在一些實施方案中，用以下所述的涂層涂布腔室，和密封元件未涂布或者用聚二甲基硅氧烷涂層涂布。在其他實施方案中，密封元件用以下所述的涂層涂布，和腔室未涂布或者用聚二甲基硅氧烷涂層涂布。在其他實施方案中，腔室和密封元件二者均用以下所述的涂層涂布。

用由含一種或更多種有機基聚硅氧烷的組合物制備的涂層涂布腔室和/或密封元件?？赏ㄟ^任何合適的方法，例如浸涂、刷涂、噴涂和類似方法，實現(xiàn)施加涂層到腔室的內(nèi)表面或者密封元件的外表面上?？杉兇獾厥┘咏M合物，或者可在溶劑，例如低分子量有機硅、無毒氯化或氟化烴，例如1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷，氟利昂或常規(guī)的烴溶劑，例如烷烴、甲苯、石油醚和其中認為毒性不嚴重的類似物內(nèi)施加組合物。隨后通過蒸發(fā)除去溶劑。涂層可以是任何方便的厚度，和在實踐中，厚度由例如所施加的量，潤滑劑的粘度，和施加溫度之類的因素決定。由于經(jīng)濟原因，優(yōu)選以實踐中盡可能薄的形式施加涂層，因為較厚的涂層沒有實現(xiàn)顯著的優(yōu)勢。涂層的確切厚度不是關鍵的和非常薄的涂層，即1或2微米的涂層顯示出有效的潤滑性能。盡管對于可操作性來說不是必須的，但希望涂層的厚度基本上均勻。涂層在施加之后，可以部分或全部交聯(lián)，或者部分交聯(lián)固定到基底上，然后在隨后的時間段內(nèi)充分交聯(lián)。

可對涂布的腔室和/或涂布的密封元件進行氧化處理，例如等離子體處理?？稍谌魏纬Ｒ姷恼婵栈虼髿鈮旱入x子體發(fā)生設備內(nèi)進行等離子體處理?？墒褂萌魏魏线m的電離等離子體，例如通過輝光放電或電暈放電生成的等離子體?？捎筛鞣N氣體或其混合物生成等離子體。常用氣體包括空氣、氫氣、氦氣、氨氣、氮氣、氧氣、氖氣、氬氣、氪氣和氙氣?？墒褂萌魏螝怏w壓力，例如大氣壓或5mm Hg或以下，例如約0.1－約1.0mm Hg。在一些實施方案中，例如大氣壓氧化方法，電離等離子體直接從小的端口引入到腔室內(nèi)或者通過隨后由密封元件密封的開口引入。涂布的密封元件的外表面可類似于電流電暈或等離子體處理方法，直接處理。在其他實施方案，例如真空基設備內(nèi)，可在涂布的密封元件或者涂布的腔室周圍激發(fā)等離子體，并允許等離子體擴散到腔室和密封元件特征內(nèi)?；蛘?，可在敞開的腔室內(nèi)，通過合適地控制電極位置，激發(fā)等離子體。在氧化處理之后，處理過的腔室和/或處理過的密封元件可用同位素(例如γ輻射線)、電子束或紫外輻射線進行熱處理或者輻照?；蛘撸山柚嫦浠蛘呱漕l(RF)，熱處理已處理過的腔室和/或處理過的密封元件。在烘箱交聯(lián)的情況下，溫度范圍可以是約120℃－約140℃，和在烘箱內(nèi)的停留時間通常為約30－約40秒，這取決于精確的配方。若使用RF技術，則線圈應當傳導足夠的熱量，以獲得約150℃－約200℃的基底表面溫度。在這些溫度下，固化要求僅僅約2－約4秒。

在一些實施方案中，通過用同位素、電子束或紫外輻射線，至少部分交聯(lián)涂層。這一技術的優(yōu)點同樣是可用于醫(yī)療應用上的滅菌。電離輻射形式的輻射滅菌常常用于醫(yī)院的醫(yī)療器件，例如導管、外科物品和關鍵的護理工具上。γ輻射線通過氧化生物組織產(chǎn)生殺微生物效果，因此提供簡單、快速和有效的滅菌方法。使用或者來自于Co-60(⁶⁰Co)同位素源或者來自于機器發(fā)生的加速電子源的γ射線。當待滅菌的材料在暴露的⁶⁰Co源周圍移動確定的時間段時，實現(xiàn)充分的暴露。醫(yī)療制品滅菌最常用的劑量是約5－約100kGy，例如5－50kGy。

在一些實施方案中，可在以上所述的交聯(lián)的有機基聚硅氧烷涂層上施加厚度為約0.3－10，優(yōu)選約0.8－4.0μm的表面潤滑劑層。表面潤滑劑可以是粘度為約100－1,000,000；100－60,000；或優(yōu)選約1000－12,500cSt的常規(guī)的硅油(有機基聚硅氧烷)?？赏ㄟ^以上所述的任何常規(guī)的方法，施加表面潤滑劑層。施加表面潤滑劑的優(yōu)選方法是通過噴涂表面潤滑劑在溶劑，例如氯仿、二氯甲烷或優(yōu)選氟氯烴，例如FREON^TM TF內(nèi)的約4wt％的溶液或者在其內(nèi)浸涂注射器筒體。表面潤滑劑可任選地通過氧化處理和/或輻射輕度交聯(lián)。

在其中腔室和密封元件二者均用有機基聚硅氧烷涂布的一些實施方案中，涂布腔室的有機基聚硅氧烷的粘度可以大于涂布密封元件的有機基聚硅氧烷的粘度。例如，涂布腔室的有機基聚硅氧烷的粘度可以是12,500cSt，而涂布密封元件的有機基聚硅氧烷的粘度可以是1000cSt。在其他實施方案中，涂布腔室的有機基聚硅氧烷的粘度可以等于或小于涂布密封元件的有機基聚硅氧烷的粘度。例如，涂布腔室的有機基聚硅氧烷的粘度可以是12,500cSt，而涂布密封元件的有機基聚硅氧烷的粘度可以是100,000cSt。

在一些實施方案中，對涂布的制品進行滅菌處理。當今可獲得許多滅菌技術使醫(yī)療器件滅菌，消滅活的有機物，例如細菌、酵母、霉菌和病毒。醫(yī)療器件所使用的常用的滅菌技術包括高壓釜、環(huán)氧乙烷(EtO)或γ輻射線，以及最近引入的牽涉低溫氣體等離子體和氣相滅菌劑的體系。

醫(yī)療制品的腔室至少部分用含下述的溶液填充，所述溶液包括：(i)至少一種含蛋白質的材料；(ii)至少一種非離子表面活性劑；和(iii)至少一種糖。以上詳細地描述了該溶液的組分和用量。一般地，可在填充腔室之前，過濾該溶液，例如通過經(jīng)0.22微米的過濾器過濾，并在本領域技術人員眾所周知的無菌條件下，分配到無菌腔室內(nèi)。

下述實施例更特別地描述了本發(fā)明，這些實施例僅僅闡述本發(fā)明，因為在其內(nèi)的許多改性和變化對本領域的技術人員來說是顯而易見的。

實施例

實施例A

這一實施例研究了蔗糖和非離子表面活性劑(20聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑)對traztuzumab單克隆抗體(mAb)聚集和對硅油液滴特征的影響。在這一研究中，沒有嘗試區(qū)分mAb對硅油的吸收與因硅油成核導致的mAb聚集。相反，在硅油和mAb之間任何不可逆的締合簡稱為“聚集”。

在這一研究中分析四個配方，如表1詳述。通過熒光活化的顆粒掃描，分析每一配方，測定顆粒組成。對于這些配方子組來說，進行比較充分的分析。測量懸浮液濁度、硅油液滴數(shù)量濃度和硅油液滴尺寸分布。在過濾之后，在含水濾液中測量traztuzumab的濃度。

通過深入滲析(Pierce Slide-A-Lyzer,3500MWCO)，在10mM乙酸鈉，pH5.0內(nèi)交換重組人類單克隆抗體(rhmAb)(trastuzumab,Genentech,Inc.)的溶液?；旌虾线m體積的蔗糖和/或polysorbate 20(Tween 20)的單獨的溶液與純化的溶液成最終1mg/ml的mAb濃度。如合適的結果部分所述，系統(tǒng)地變化配方添加劑(蔗糖、NaCl和表面活性劑)的濃度。所有化學品為試劑級或更高。

表1

通過高壓均化，生成醫(yī)療級硅油(約0.5％v/v)在含水緩沖液(10mM乙酸鈉，pH5.0)內(nèi)的懸浮液。添加聚二甲基硅氧烷醫(yī)療流體(Dow Corning 360,1000cSt)到含水緩沖液中，并一次通過高壓均化器(商購于Avestin,Inc.的Emulsiflex C5Homogenizer)。在均化之后立即通過混合含配方添加劑的mAb溶液與硅油在緩沖液內(nèi)的懸浮液，生成分析用最終懸浮液。

在改變培育時間段之后，過濾懸浮液(Whatman Anotop 10,0.02μm注射器過濾器)，分離水相和油相。就在過濾之前，保持懸浮液約2分鐘，允許油滴在過濾器膜附近沉降。作為測試相分離程度的對照，在用Nile Red染料標記硅油之后，測量含水硝酸鹽的熒光。在628nm處不顯著的熒光測量證明充分地分離。

采用PerkinElmer Lambda 35分光光度計(Wellesley,MA)，測量兩類樣品的光學密度。在簡單并溫和地攪拌，使液滴聚集體解絮凝之后，在660nm處，作為時間和配制條件的函數(shù)，測量均勻的硅油懸浮液的光學密度。在含水濾液內(nèi)，測量在280nm處的mAb吸收度，以測定mAb的濃度。或者，采用Coomassie染料結合分析(Coomassie Plus^TM Better Bradford Assay Kit,Pierce Biotechnology,Rockford,IL)，測量mAb濃度。

使用Coulter LS230激光衍射粒度分析儀(Beckman Coulter,Fullerton,CA)，測量硅油的液滴尺寸分布。在均化之后立即，和在懸浮液制備之后最多2周，作為時間的函數(shù)，測量懸浮液的相對尺寸分布。根據(jù)硅油液滴的相對尺寸分布和數(shù)量濃度，估計總的硅油表面積。

可使用熒光活化的顆粒掃描分析粒度、形貌和相對顆粒熒光。通過該技術分析僅僅閾值尺寸(>1μm直徑)顆粒。對于掃描顆粒來說，測量正面光散射(FSC,180°光散射)、側光散射(SSC，90°光散射)、綠色熒光強度(FLl,525-585nm)和紅色熒光強度(FL2,585-600nm)根據(jù)文獻公知的工序(MP 00143,Amine-Reactive Probes,Invitrogen Corporation)，采用Alexa488染料(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，化學標記trastuzumab分子。為了標記硅油，將Nile Red染料以5mg/ml溶解在硅油內(nèi)。Nile Red，9-二乙基氨基-5-苯并吩嗪-5-酮是極端疏水的染料，其熒光在水中被充分地猝滅。Alexa488染料的發(fā)射最大值為519nm，和Nile Red染料的發(fā)射最大值為628nm。采用BD FACScan^TM流式細胞計分析儀(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ)，掃描具有化學標記的mAb和染色的硅油的懸浮液。

trastuzumab與硅油液滴在懸浮液內(nèi)相互作用的程度取決于配制環(huán)境和培育時間。圖1A和1B示出了mAb與硅油的締合。符號是通過起始mAb濃度和濾液內(nèi)mAb濃度之差測量的三個同樣的樣品的算術平均。誤差柱(bar)代表±1標準偏差。在所有系列中，mAb濃度為1mg/ml。在兩個圖片中，正方形表示具有0.5M蔗糖、mAb和硅油的配方。在圖1A中，三角形表示具有僅僅mAb和油的配方。在圖1B中，三角形表示具有0.5M蔗糖、0.005％Tween非離子表面活性劑、mAb和油的配方。

在懸浮、培育和過濾之后，在足夠長的培育時間下，具有蔗糖的配方含有比不具有蔗糖的那些配方更高的mAb濃度。因此，存在蔗糖會長時間降低mAb聚集，如圖1A所示。圖1B比較了在圖片1A中所示的具有蔗糖的配方與含有蔗糖和非離子表面活性劑的配方。添加非離子表面活性劑進一步降低mAb與硅油締合。

通過測量含標記的mAb和標記的硅油的顆粒的熒光強度，可更好地理解配方添加劑對mAb聚集的影響。圖2A－2D示出了兩個波長帶的熒光強度散射圖表。在圖2A－2D中，F(xiàn)L1強度與Alexafluor 488標記的mAb濃度直接成正比。FL2熒光強度與Nile Red標記的硅油體積直接成正比。FL1和FL2強度大致與粒度成比例，從而包括大于1個數(shù)量級的尺寸范圍。優(yōu)化實驗設定值，以便在圖2A中，mAb和硅油的相對強度相當。對于所有其他配方來說，保持這些設定值(圖2B-2D)。因此，在圖片內(nèi)的趨勢和之間的比較是有意義的；絕對強度值是沒有意義的。坐標軸的單位是任意的。直方圖表示顆粒強度分布。直方圖的標度范圍為0－0.5。圖2A－2D描繪了具有1mg/ml mAb和硅油以及下述各種蔗糖與表面活性劑的各種結合物的配方：A沒有蔗糖也沒有表面活性劑；B：0.5M蔗糖；C0.005％Tween非離子表面活性劑；和D0.5M蔗糖和0.005％Tween非離子表面活性劑。

圖2A－2D各自相當于具有表1中相同字母的配方。因此，左面的兩個圖片(圖2A和2C)代表不具有蔗糖的配方。右面的兩個圖片(圖2B和2D)代表含有蔗糖的配方。從頂部到底部，圖片表示不含表面活性劑(圖2A和2B)和非離子表面活性劑(圖2C和2D)。

圖2A示出了含有僅僅mAb和硅油的配方的顆粒強渡。散射圖表在尺寸數(shù)量級方面是線性的(約1－10微米)，從而表明對于不同尺寸的顆粒來說，mAb濃度與硅油體積之比恒定。添加Tween非離子表面活性劑(圖2C)沒有顯著影響FL1或FL2強度。當引入蔗糖到配方中時(右面圖片)，熒光強度范圍大大地壓縮。而且，結合存在蔗糖和Tween非離子表面活性劑大大地降低mAb的聚集：大于一半的顆粒顯示可忽略不計的FL1強度(圖2D)。在圖2B中，多個數(shù)據(jù)趨勢表明兩個或更多個不同的顆粒群。

在散射圖表中與線性的偏離證明油滴尺寸增加，存在其中顆粒生長不是線性的狀況。反而對于基本上相同尺寸的顆粒，出現(xiàn)表面粗糙度差別。盡管不打算束縛于任何理論，但非線性、非球形顆粒生長的一種可行的解釋是，在沒有立即凝結的情況下，通過添加較小液滴，顆粒生長。這一“乳狀液(creaming)”效果產(chǎn)生多-液滴聚集的顆粒。熒光掃描允許測量當顆粒聚集時，抗體/油對顆粒的貢獻。

當顆粒尺寸增加時(相應于紅色和綠色強度增加)，抗體與油之比通常保持恒定。這支持了下述假設：較小的油滴結合，形成較大的多-液滴顆粒。當液滴聚集形成較大顆粒時，吸附到小的硅油液滴的表面上的抗體分子表明保持與硅油締合。

圖3A－3D是對于相同的四個配方A-D(參見表1)來說，硅油液滴在含有蔗糖與表面活性劑的各種結合物的含水mAb配方(1mg/ml)內(nèi)的側面光散射(90°光散射)對正面光散射(180°光散射)的散射圖表。正面光散射強度主要受粒度影響，而側面光散射強度受粒度和表面粗糙度影響。坐標軸單位是任意的。直方圖表示顆粒分布。直方圖的標度范圍為0－0.5。圖3A－3D描繪了具有蔗糖和表面活性劑的各種結合物的1mg/ml mAb和硅油的配方：A沒有蔗糖也沒有表面活性劑；B：0.5M蔗糖；C0.005％Tween非離子表面活性劑；和D0.5M蔗糖和0.005％Tween非離子表面活性劑。如圖3B和3D所示，添加蔗糖大大地降低平均粒度(x軸)和表面粗糙度(y-軸)。

圖4A和4B中描繪了硅油凝結的相對速度。圖4A和4B示出了在具有懸浮化的硅油的mAb配方內(nèi)光遮蔽的時間依賴性。在簡單旋轉解絮凝和破乳(decream)懸浮液之后，分析每一配方的樣品。歸一化每一配方的起始時間點到相同值。符號是三種同樣的樣品的算術平均和誤差柱代表±1的標準偏差。在圖4A和4B每一幅圖中，mAb的濃度為1mg/ml。在圖4A和4B中，正方形表示具有0.5M蔗糖、mAb和硅油的配方。在圖4A中，三角形表示具有僅僅mAb和油的配方。圖4A比較了有和無蔗糖的含mAb和硅油的配方。如圖4A所示，蔗糖提高硅油的凝結速度。在圖4B中，三角形表示具有0.5M蔗糖、0.005％Tween非離子表面活性劑、mAb和油的配方。圖4B比較了具有蔗糖的配方與具有蔗糖和非離子表面活性劑的配方。如圖4B所示，Tween非離子表面活性劑降低硅油的凝結速度。因此，當存在Tween非離子表面活性劑時，懸浮的油滴在溶液內(nèi)保持時間更長，和當存在蔗糖時，保持時間短。

在每一時間點處估計每一配方內(nèi)的硅油表面積之后，可計算表面積歸一化的mAb聚集(圖5A－5B)。圖5A－5B每一幅圖相當于圖1的相同圖片，不同在于改性導致硅油表面積不同。符號是在起始mAb濃度與濾液內(nèi)mAb濃度之差測量的三個同樣的樣品的算術平均。各差值除以配方-與時間-具體硅油表面積之和。誤差柱代表±1的標準偏差。在圖5A和5B每一幅圖中，mAb的濃度為1mg/ml。在所有圖片中，虛線表示單層覆蓋率的估計，和正方形表示具有0.5M蔗糖、mAb和硅油的配方。在圖5A中，三角形表示具有僅僅mAb和油的配方。在圖5B中，三角形表示具有0.5M蔗糖、0.005％Tween非離子表面活性劑、mAb和油的配方。通過歸一化硅油表面積，在蔗糖存在下足夠長的時間，mAb聚集實際上增加，如圖5A所示。在含有蔗糖和Tween非離子表面活性劑的配方中，mAb/油的締合水平保持低和相對恒定(圖5B)。

如上圖所示，配方添加劑可影響硅油液滴的凝結，mAb暴露于硅油下的水平和mAb聚集。而且，兩種或更多種配方添加劑的結合效果有時比各自單獨的效果更顯著。具體地，含有蔗糖與Tween非離子表面活性劑二者的配方有效地降低mAb與硅油的締合，和添加蔗糖到配方中會顯著改變硅油液滴的特征。

盡管不希望束縛于任何理論，但認為蔗糖降低mAb與硅油締合的機理是凝結驅動。在上述實施例中，蔗糖增加硅油凝結速度，如圖4A所示。當液滴凝結時，總的硅油表面積下降。由于在具有蔗糖的配方內(nèi)可獲得下降的表面積，因此在足夠長的時間內(nèi)mAb聚集速度下降(圖1A)。令人感興趣的是，蔗糖增加mAb/硅油締合的程度/硅油表面單位(圖5A)。甚至這樣，總的聚集速度因提高的凝結得到改進。因此，添加蔗糖到治療性mAb配方中不僅對mAb的穩(wěn)定，而且潛在地對降低其暴露于硅油表面是有益的。

添加Tween非離子表面活性劑到含蔗糖的配方中可進一步降低mAb/油的締合水平。這一效果在短時間內(nèi)特別明顯(圖4B)。令人感興趣的是，通過共同存在蔗糖，提高Tween非離子表面活性劑在抑制mAb/油締合中的有效性，如圖2C和2D所示。在不存在蔗糖的情況下，具有Tween非離子表面活性劑的配方的熒光強度散射圖表(圖2C)沒有顯著不同于不具有Tween非離子表面活性劑的配方(圖2A)。然而，當蔗糖和非離子表面活性劑均存在于配方內(nèi)時(圖2D)，mAb/油的締合下降得到提高。

蔗糖和Tween非離子表面活性劑一起防止mAb聚集的機理不同于單獨的蔗糖。根據(jù)圖4B，顯而易見的是，添加Tween非離子表面活性劑到含蔗糖的配方中將減慢油的凝結速度。根據(jù)液滴尺寸和數(shù)量濃度的測量，在均化之后最多2周，懸浮化的硅油表面積保持相對恒定。具有蔗糖和Tween非離子表面活性劑的配方抑制mAb聚集，從而與具有蔗糖但不具有Tween非離子表面活性劑的次最好的配方相比，顯示出幾乎2倍的聚集下降(圖5B)。

由于不具有mAb的硅油懸浮液的光散射點圖表幾乎與圖3和4所示的那些相同，因此，散射圖表曲線主要揭露關于硅油液滴特征，亦即絮凝和凝結的信息。受蔗糖驅動的硅油凝結和乳化速度的增加影響這些點狀圖表。與不具有蔗糖的配方相比，在具有蔗糖的配方中，液滴較小，具有較小的表面復雜度，和具有比較緊密的尺寸范圍。

在圖3中不具有蔗糖的配方中，限定(constrained)的數(shù)據(jù)趨勢是令人感興趣的。假設尺寸變化的完好光滑的球形顆粒產(chǎn)生線性趨勢，條件是優(yōu)化校正垂直的光散射。偏離線性的變化表明與球形形狀的偏離。盡管不希望束縛于任何理論，但認為在這一研究中觀察到的偏離來自于液滴絮凝，但沒有直接的凝結。因此，由較小球形液滴組成的大顆粒顯示出未與球形顆粒一起存在的表面復雜度。圖6是基于正面光和側面光散射的硅油液滴和聚集分布的假設圖表。線性趨勢(虛線)來自于變化直徑的球形液滴?？赏ㄟ^液滴聚集但沒有立即凝結，解釋在散射圖表曲線中與線性的偏離。

存在液滴始終一致的聚集(即沒有快速凝結的絮狀物)可解釋在這一研究中觀察到的其他現(xiàn)象。通過層狀流式光遮蔽(可能誘導解絮凝)測量的粒度分布一致地揭露了與通過熒光活化的顆粒掃描測量結果相比，液滴尺寸更加緊密的范圍。另外，在不具有蔗糖的許多配方中，mAb濃度與硅油體積之比在寬的粒度范圍內(nèi)相對恒定。在緩慢地凝結的情況下，一旦絮凝，則所吸附的mAb沒有必然從硅油表面排出(expel from)。然后mAb濃度可隨著硅油聚集體積而不是表面積線性增加。

可通過顆粒單獨的群落的存在，解釋在FL1相對于FL2散射圖表中的細分(divided)趨勢。在具有蔗糖的配方中出現(xiàn)這些趨勢(圖2B)。取決于配制條件，可存在數(shù)種顆粒群的結合：在不具有硅油的情況下，mAb聚集，在具有硅油核的情況下，mAb聚集，和在mAb吸附到液滴表面上的情況下，硅油液滴聚集。Mab聚集體的疏水袋(pocket)可使Nile Red染料從硅油中剝落?；蛘?，硅油液滴可充當mAb聚集的核。

在硅油存在下，含有蔗糖與Tween非離子表面活性劑的治療性mAb配方顯著降低mAb聚集。具有僅僅蔗糖的配方在較小的程度上降低mAb聚集，這可能由于硅油凝結速度增加所致。由于表明硅油污染誘導蛋白質聚集，因此對于暴露于硅油下的產(chǎn)品來說，降低蛋白質聚集的成功的配制策略可能是重要的。添加蔗糖到治療性蛋白質配方中可降低蛋白質暴露于硅油表面下。如上述實施例所示，含有蔗糖和非離子表面活性劑的配方可抑制硅油誘導的蛋白質聚集。

實施例B

在懸浮液內(nèi)，油粘度對油負載的影響

如表2所示，在有和無非離子表面活性劑的情況下，添加醫(yī)療級硅油到水溶液中。下表2中列出了在每一樣品內(nèi)，硅油的濃度和粘度。圖7通過在600nm處光學密度的測量，間接地示出了油粘度對油負載的影響。在600nm處的光學密度(OD₆₀₀)是懸浮化的油粘度的間接測量值。如圖7和表2所示，較低的油粘度反映較高的起始OD₆₀₀，這反過來允許較高的油負載。如圖8和9所示，對于所測試的樣品來說，不同粘度(1000cSt對12,500cSt)的聚二甲基硅氧烷的懸浮油滴的凝結行為不存在定性(qualitative)差別。

表2

實施例C

如以上實施例A所示，通過在硅油內(nèi)以5mg/ml溶解Nile Red染料，標記硅油。在該研究中所使用的單克隆抗體是標準的可商購的PacificMouse Anti-human CD4mAb(clone RPA-T4,Becton,Dickinson and Company)。Pacific染料的發(fā)射最大值為455nm。Nile Red染料的發(fā)射最大值為628nm，然而，在R-phycoerythrin(PE)常用的檢測儀內(nèi)出現(xiàn)顯著的Nile Red染料發(fā)射信號，且是這一實施例C的Nile Red標記的樣品所使用的發(fā)射檢測儀。如以上實施例A所示，制備具有Pacific標記的mAb和Nile Red標記的硅油的懸浮液，并采用BD ^TM LSR II Flow Cytometer分析儀(Becton,Dickinson and Company)，針對Pacific檢測(450/50BP濾光器)，采用紫外激光器激發(fā)(405nm)，和針對Nile Red檢測(585/42BP濾光器)，采用藍色激光器激發(fā)(488nm)，從而進行分析。使用脈沖區(qū)域，進行所有的熒光測量，以確保針對每一顆粒測量總的熒光。為了合適地表明在寬的動態(tài)范圍內(nèi)的熒光分布(40多)，并允許合適地顯示0和負值，在BD Diva Software中使用雙指數(shù)轉換(Logicle,DR Parks,WA Moore,Stanford University)。

標記的CD3抗體與硅油液滴在懸浮液內(nèi)相互作用的程度取決于配制環(huán)境和培育時間。圖12A－12D示出了mAb與未標記的硅油和用Nile Red標記的硅油二者的締合。在含有mAb的所有樣品中，mAb的濃度為2μg/ml。

現(xiàn)參考圖13A和13B，作為Nile Red信號的函數(shù)，來自標記的mAb的Pacific信號的斜率(圖13B)非常接近于作為體積的函數(shù)，表面積的理想理論值(圖13A)。理論上，對于完美的球形來說，表面積與體積的斜率為10^2/3(10^0.667)，和所觀察到的斜率為10^0.603，這與在油滴或顆粒外部上存在mAb的預期一致，這與在油顆粒的內(nèi)部捕獲或分布相反。若mAb以線性方式隨Nile Red標記的油滴一起分布，則在對數(shù)圖表上或者在雙指數(shù)顯示的對數(shù)部分上，斜率幾乎為1.0。

圖14A和14B示出了非離子表面活性劑對硅油顆粒與mAb顆粒相分離和硅油與mAb顆粒聚集的影響。圖14A是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。圖14B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。在數(shù)字基線校正之后，相對熒光值基本上合計為分數(shù)且表明信號強度，其中不具有可檢測信號的群具有接近于0的中心趨勢和一半的負值與一半的正值，雙指數(shù)轉換是歸一化轉換的變化，它允許基于最模糊的群(dimmest population)的變化、log的平穩(wěn)過渡(transition)和相當于標準對數(shù)標尺的大多數(shù)顯示范圍，在標尺的低端顯示0和負值。如圖14B所示，Tween非離子表面活性劑有效地抑制mAb/油締合。

圖15A和15B示出了非離子表面活性劑對硅油顆粒與mAb顆粒相分離和硅油與mAb顆粒聚集的影響。圖15A是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。圖15B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、在將標記的蛋白質暴露于油滴下之后添加的本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。如圖15B所示，Tween 非離子表面活性劑有效地抑制mAb/油締合。

圖16A－16D示出了非離子表面活性劑、鹽和糖對硅油顆粒與mAb顆粒相分離和硅油與mAb顆粒聚集的影響。圖16A是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品和本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。圖16B是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和150mM NaCl鹽標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。通過圖16A(不具有鹽的配方)和16B(具有鹽的配方)的比較表明，存在NaCl鹽沒有抑制mAb/油締合。

圖16C是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品、本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料和0.5M蔗糖標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。通過圖16A(不具有蔗糖的配方)和16C(具有蔗糖的配方)的比較表明，存在蔗糖沒有抑制mAb/油締合。

圖16D是對于用Nile Red染料標記的硅油樣品；本發(fā)明用Pacific Blue^TM染料、0.5M蔗糖、150mM鹽和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。通過圖16A(不具有鹽、蔗糖或非離子表面活性劑的配方)和16D(具有鹽、蔗糖和Tween非離子表面活性劑的配方)的比較表明，存在鹽、蔗糖和Tween非離子表面活性將抑制mAb/油締合。

在熒光活化的顆粒掃描中，電子脈沖窗是計時窗(窗門)，它允許信號在規(guī)定的時間框架內(nèi)加工。通常在數(shù)據(jù)獲取過程中，它在守恒的恒定值下設定(根據(jù)制造商關于特定儀器的說明，常常比最小要求的長數(shù)微秒)，以確保脈沖的完全一體化。對于有和無非離子表面活性劑的樣品來說，在10μs和2μs處評價降低時間到僅僅完全一體化信號所要求的時間對最終校正體系的影響(通過調節(jié)窗延長期)。圖17A是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，以及用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，在10μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。圖17B是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，在10μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。圖17C是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，以及用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體樣品來說，在2μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。圖17D是根據(jù)本發(fā)明，對于用Nile Red染料標記的硅油樣品，用Pacific Blue^TM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脫水山梨醇單月桂酸酯非離子表面活性劑標記的CD3抗體樣品來說，在2μs的窗延長期下測量的用Pacific Blue^TM染料標記的CD3抗體的相對熒光強度(y-軸)對Nile Red標記的硅油的相對熒光強度(x-軸)的圖表。通過圖17A和17C，以及圖17B和17D分別比較表明，降低窗延長期從10μs到2μs將降低這兩種染料尺寸變化的群系數(shù)(CV)。

參考本發(fā)明的特定實施方案的具體細節(jié)，描述了本發(fā)明。這些細節(jié)不打算視為限制本發(fā)明的范圍，除非它們包括在所附權利要求內(nèi)。