本發(fā)明公開了一種膠體金檢測試紙及其制備方法，特別涉及一種西地那非膠體金檢測試紙及其制備方法。
背景技術：
西地那非等PDE-5抑制劑屬于處方藥，有明確的適應癥、禁忌癥及副作用，某些病人不能服用?；颊呷粼诓恢榈那闆r下攝入，容易引起嚴重的不良反應，甚至導致死亡。由于PDE-5型抑制劑在治療ED方面的巨大成功，而且該藥品的價格非常昂貴，更由于其合成方法相對簡單，使得補腎壯陽類中成藥和保健食品中非法添加PDE-5型抑制劑的情況出現(xiàn)并成為一種普遍現(xiàn)象。
目前，在中成藥及保健食品中是否摻雜西地那非的檢測方法主要有以下幾種方法：薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法和理化篩查方法。前三者均需經過復雜的提取過程和借用儀器分析，對檢測人員的專業(yè)技術要求較高，不適合基層人員現(xiàn)場操作。而理化篩查法雖然操作步驟較少但操作要求比較嚴格，靈敏度低且容易出現(xiàn)誤判現(xiàn)象。針對上述不足，本發(fā)明提供了一種使用方便，快速簡便，靈敏度高的檢測保健食品或中成藥中非法添加西地那非的膠體金檢測卡。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便，快速簡便，靈敏度高的檢測保健食品或中成藥中非法添加西地那非的快速篩查方法及其所用檢測卡。
本發(fā)明提供了一種西地那非膠體金檢測試紙的制備方法，其具體制備過程是：
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為25～35nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至6～6.8，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至質量終濃度為0.2～0.5％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為6.2～7、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為0.1～1％BSA、0.05～0.2％吐溫-80、0.1～1％聚乙烯吡咯烷酮；
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
本發(fā)明的技術方案提供了一種制備膠體金試紙及其制備方法，該膠體金試紙檢測靈敏，準確度高，結果容易觀察，可實現(xiàn)對大批量樣品的快速篩查，大大降低檢測成本，減少工作量，在食品藥品監(jiān)管中具有實際意義。
具體實施方式
下面結合具體實施方式，對本發(fā)明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權利要求范圍內所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權利要求保護范圍內。
實施例1西地那非膠體金檢測試紙的制備(1)
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為30nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至6.8，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至終濃度為0.2％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用，緩沖液中含有質量終濃度為1％的吐溫-80；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為7.0、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為1％BSA、0.2％吐溫-80、1％聚乙烯吡咯烷酮。
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
實施例2西地那非膠體金檢測試紙的制備(2)
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為35nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至6.3，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至終濃度為0.2％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用，緩沖液中含有質量終濃度為0.05％的吐溫-80；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為6.8、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為0.5％BSA、0.1％吐溫-80、0.5％聚乙烯吡咯烷酮。
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
實施例3西地那非膠體金檢測試紙的制備(3)
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為25nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至6.4，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至終濃度為0.5％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用，緩沖液中含有質量終濃度為0.1％的吐溫-80；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為6.5、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為0.2％BSA、0.05％吐溫-80、0.2％聚乙烯吡咯烷酮。
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
實施例4西地那非膠體金檢測試紙的制備(4)
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為25nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至6，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至終濃度為0.4％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用，緩沖液中含有質量終濃度為0.2％的吐溫-80；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為6.2、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為0.1％BSA、0.1％吐溫-80、0.4％聚乙烯吡咯烷酮。
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
實施例5西地那非膠體金檢測試紙的制備(5)
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為30nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至6.8，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至終濃度為0.5％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用，緩沖液中含有質量終濃度為0.5％的吐溫-80；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為7.0、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為0.4％BSA、0.2％吐溫-80、0.1％聚乙烯吡咯烷酮。
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
實施例6西地那非膠體金檢測試紙的制備(6)
(1)膠體金顆粒的制備：利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為30nm的膠體金顆粒；
(2)金標記抗體的制備：將制備好的膠體金溶液調節(jié)PH至7.5，再用雙蒸水或PBS稀釋標記抗體至濃度為1mg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持攪拌10-15min，加入BSA至終濃度為0.2％，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4℃，4000r/min離心30min，利用0.2M磷酸緩沖液重懸洗滌，再離心，重復2次，濃縮備用，緩沖液中含有質量終濃度為1％的吐溫-80；
(3)金標結合物墊的制備：使用噴膜儀將金標記的標記抗體噴于處理好的金標結合物墊上并真空冷凍干燥備用；
(4)包被硝酸纖維素膜：將捕捉抗體和抗抗體使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質控區(qū)，干燥備用；
(5)樣品處理墊的制備：利用pH為7.5、摩爾濃度為0.2M的磷酸緩沖液浸泡玻璃纖維樣品墊，過夜干燥，切割備用；緩沖液中，含有質量終濃度為1％BSA、0.2％吐溫-80、1％聚乙烯吡咯烷酮。
(6)試紙的組裝：按樣品墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝。
實施例7西地那非膠體金檢測試紙的檢測范圍
將實施例1～6的制備方法制備得到的膠體金試紙，分別檢測濃度為100μg/ml的西地那非、伐地那非、紅地那非、他達拉非。檢測結果如下，其中+表示檢測結果為陽性，-表示檢測結果為陰性：
膠體金檢測的實驗結果
實施例8西地那非膠體金檢測試紙檢測的靈敏度
將實施例1的實施方案制備的膠體金檢測試紙條檢測其靈敏度：將西地那非溶解，制備成0.5mg/mL的溶液，每10倍梯度稀釋，檢測膠體金檢測試紙的檢測靈敏度。檢測結果表明，按照實施例1的實施方案制備的膠體金檢測試紙條，最小可檢測到的濃度為0.5ppb。