本發(fā)明涉及一種制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法，用于檢測(cè)胃癌病人血清中的VEGF-C蛋白的濃度?？捎米鳈z測(cè)腦梗死等腦損傷疾的輔助診斷。屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
無(wú)論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在欠發(fā)達(dá)國(guó)家，癌癥是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，隨著全球范圍內(nèi)的人口增長(zhǎng)和老齡化，以及日益增加的患病因素(包括吸煙，體重超重，缺乏體力活動(dòng)，城市化和經(jīng)濟(jì)發(fā)展相關(guān)的生育模式的變化)，癌癥的發(fā)生率和死亡人數(shù)一直在增加，癌癥的治療和預(yù)防研究刻不容緩。在我國(guó)，因肺和支氣管、胃、肝、食道、結(jié)腸發(fā)生的癌癥導(dǎo)致死亡的人數(shù)占所有癌癥死亡總數(shù)的約四分之三。2015年相關(guān)數(shù)據(jù)分析顯示，有新發(fā)浸潤(rùn)性癌病例數(shù)429.2萬(wàn)，相當(dāng)于平均每天新發(fā)12000例癌癥，有281.4萬(wàn)癌癥死亡病例，相當(dāng)于平均每天7500人死于癌癥。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)新生血管生成的一個(gè)非常重要的生長(zhǎng)因子，在腫瘤以及炎癥性疾病的血管生成中發(fā)揮著重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的VEGF家族成員有六個(gè)即為VEGFA，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF E，其分子量從35至44kDa不等，每個(gè)成員特異性地與三個(gè)“血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體”(VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3)的特定組合相結(jié)合。
VEGF-C由419個(gè)氨基酸構(gòu)成，屬分泌性多肽，經(jīng)蛋白水解加工后，形成以二硫鍵鏈接的同源二聚體，與其對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合后而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)。在正常人組織中，VEGF-C是一種特異性促淋巴管生成因子，VEGFR-3只限于淋巴內(nèi)皮上，而它的另一受體VEGFR-2則在血管內(nèi)皮和淋巴內(nèi)皮均有表達(dá)。胃癌基質(zhì)中常見(jiàn)新生和擴(kuò)大的淋巴管，腫瘤細(xì)胞侵入的淋巴管多為癌周的毛細(xì)淋巴管，這些淋巴管缺乏完整的基膜，內(nèi)皮細(xì)胞連接松散有利于癌細(xì)胞的進(jìn)入，VEGF-C可介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，因此在胃癌患者的血清中VEGF-C的含量明顯升高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法。
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
一種制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法，其特征在于：包括VEGF-C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，VEGF-C系列質(zhì)控品溶液，酶標(biāo)VEGF-C抗體溶液，酶標(biāo)抗體稀釋液，樣本稀釋液，鏈酶親和素-HRP，化學(xué)發(fā)光液A液，化學(xué)發(fā)光液B液，濃縮洗滌液，包被溶液，封閉溶液；
所述VEGF-C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液：以常規(guī)方法將VEGF-C純品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度分別為0、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL的VEGF-C標(biāo)準(zhǔn)溶液；
所述VEGF-C系列質(zhì)控品溶液：將VEGF-C純品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度分別為：400±80ng/mL、200±40ng/mL；
所述酶標(biāo)VEGF-C抗體溶液：用VEGF-C抗體與生物素偶聯(lián)制備，將所得VEGF-C抗體用酶標(biāo)VEGF-C稀釋液稀釋成1:4000的工作濃度；
所述酶標(biāo)抗體稀釋液：為含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，磷酸鹽緩沖液是每升含有20g BSA，50g蔗糖，16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液；
所述樣本稀釋液：為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，磷酸鹽緩沖液是每升含有16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液；
所述化學(xué)發(fā)光液：化學(xué)發(fā)光液A液為魯米諾含量為0.01M、對(duì)甲苯酚含量為0.001M，pH＝8.8的三羥甲基氨基甲烷溶液，化學(xué)發(fā)光液B液為每100mL溶液含檸檬酸2.1g，無(wú)水Na2HPO4 2.82g，0.75％的過(guò)氧化氫脲0.64mL的水溶液；
所述濃縮洗滌液：按體積分?jǐn)?shù)0.05％將吐溫-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中；
所述包被溶液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH＝9.5；
所述封閉溶液：10g BSA溶于1L洗滌溶液中，再加入重量比為5‰的NaN3。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種一種制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法，其特征在于：試劑具體操作方法是：
(1).化學(xué)發(fā)光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)2次。
(2).VEGF-C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，VEGF-C系列質(zhì)控品溶液，酶標(biāo)VEGF-C抗體溶液各20μl分別加入化學(xué)發(fā)光板微孔中，再加入樣本稀釋液80μl，震蕩混勻后，用封板膜封板，37℃水浴20分鐘。
(3).甩去化學(xué)發(fā)光板孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)此操作5次。
(4).加入生物素標(biāo)記抗體，每孔100μl，用封板膜封板，37℃水浴30分鐘。
(5).甩去孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)此操作5次。
(6).每孔加入100μl的鏈酶親和素-HRP，用封板膜封板，37℃水浴30分鐘。
(7).甩去孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)此操作5次。
(8).每孔分別加入50μl化學(xué)發(fā)光液A液和50μl化學(xué)發(fā)光液B液，立刻置于化學(xué)發(fā)光儀器中讀數(shù)。
前述的一種一種制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法，其特征在于：VEGF-C抗體置于設(shè)定的包被溶液中，以設(shè)定的濃度，在37℃恒溫箱中反應(yīng)包被。
前述的一種一種制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法，其特征在于：化學(xué)發(fā)光板的微孔包被好后用封閉溶液封閉。
本發(fā)明所達(dá)到的有益效果：本發(fā)明主要是利用抗體與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來(lái)實(shí)現(xiàn)的。化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏性和免疫分析法的高特異性。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，樣品中VEGF-C含量越高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越強(qiáng)；反之，樣品中VEGF-C含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越弱。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)具有高靈敏度、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的ELISA法比較，操作時(shí)間大幅度減少。可用作檢測(cè)胃癌的輔助診斷。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑的應(yīng)用方法，
1.包被有抗VEGF-C抗體的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化學(xué)發(fā)光板，抗體包被濃度為5.0μg/mL。
2.VEGF-C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。濃度分別為：0、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL。
3.VEGF-C系列質(zhì)控品溶液濃度分別為：400±80ng/mL、200±40ng/mL。
4.樣本稀釋液。為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4。
5.酶標(biāo)VEGF-C抗體。由VEGF-C抗體與生物素偶聯(lián)制備得到。
6.鏈親和素-HRP。
7.化學(xué)發(fā)光液?；瘜W(xué)發(fā)光液分為A、B液。A液為化學(xué)發(fā)光底物-魯米諾和發(fā)光增強(qiáng)劑-對(duì)甲苯酚溶液，B液為過(guò)氧化氫脲溶液。
8.濃縮洗滌液。濃縮洗滌液具體為含有吐溫-20(Tween-20)緩沖液的20倍濃縮磷酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中洗滌化學(xué)發(fā)光板
本發(fā)明試劑盒中涉及的VEGF-C標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣本稀釋液、化學(xué)發(fā)光溶液及洗滌溶液及其配方對(duì)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：
1.VEGF-C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液：以常規(guī)方法將VEGF-C純品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度分別為0、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL的VEGF-C標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.VEGF-C系列質(zhì)控品溶液：以常規(guī)方法將VEGF-C純品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度分別為：400±80ng/mL、200±40ng/mL。
3.酶標(biāo)VEGF-C抗體溶液：用VEGF-C抗體與生物素偶聯(lián)制備，將所得VEGF-C抗體用酶標(biāo)VEGF-C稀釋液稀釋成1:4000的工作濃度。
4.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：為含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有20g BSA，50g蔗糖，16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液。
5.酶標(biāo)抗體稀釋液：為含有BSA的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有20gBSA，16gNaCl，0.4gKCl，0.4gKH2PO4，5.8gNa2HPO4的水溶液。
6.樣本稀釋液：為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有16g NaCl，0.4g KCl，0.4gKH2PO4，5.8gNa2HPO4的水溶液。
7.化學(xué)發(fā)光液：A液為魯米諾含量為0.01M、對(duì)甲苯酚含量為0.001M，pH＝8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為每100mL溶液含檸檬酸2.1g，無(wú)水Na2HPO4 2.82g，0.75％的過(guò)氧化氫脲0.64mL的水溶液。
8.濃縮洗滌液：按體積分?jǐn)?shù)0.05％將吐溫-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中。
9.包被溶液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH＝9.5。
10.封閉溶液10g BSA溶于1L洗滌溶液中，再加入重量比為5‰的NaN3。
本發(fā)明中包被化學(xué)發(fā)光板采用將抗VEGF-C抗體置于設(shè)定的包被溶液中，以設(shè)定的濃度，在37℃恒溫箱中反應(yīng)包被。
本發(fā)明采用的是pH＝9.5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。本發(fā)明中微孔板中所包被的抗VEGF-C抗體在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上，可以經(jīng)受多次洗板，采用的抗體包被濃度為5.0μg/mL。包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優(yōu)選BSA，需加入NaN3防止變質(zhì)。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)操作方法：
1.化學(xué)發(fā)光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)2次。
2.將VEGF-C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，VEGF-C系列質(zhì)控品溶液，酶標(biāo)VEGF-C抗體各20μl分別加入化學(xué)發(fā)光板微孔中，再加入樣本稀釋液80μl，震蕩混勻后，用封板膜封板，37℃水浴20分鐘。
3.甩去化學(xué)發(fā)光板孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)此操作5次。
4.加入生物素標(biāo)記抗體，每孔100μl，用封板膜封板，37℃水浴30分鐘。
5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)此操作5次。
6.每孔加入100μl的鏈酶親和素-HRP，用封板膜封板，37℃水浴30分鐘。
7.甩去孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，重復(fù)此操作5次。
8.每孔分別加入50μl化學(xué)發(fā)光液A液和50μl化學(xué)發(fā)光液B液，立刻置于化學(xué)發(fā)光儀器中讀數(shù)。
本發(fā)明理化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
1.最低檢測(cè)線
用零濃度校準(zhǔn)品作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定20次，得出20次測(cè)量結(jié)果的發(fā)光值(RLU值)，計(jì)算其平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，得出M+2SD所對(duì)應(yīng)的RLU值，根據(jù)試劑盒所用校準(zhǔn)品的定標(biāo)曲線方程，將M+2SD所對(duì)應(yīng)的RLU值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為檢測(cè)限。
2.準(zhǔn)確度
取準(zhǔn)確度參考品作為樣本進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)測(cè)量3次后，其平均結(jié)果記為M，根據(jù)公式(1)計(jì)算測(cè)量濃度的相對(duì)偏差。
B＝(M-T)/T×100％·公式(1)
式中：
B—相對(duì)偏差；
M—測(cè)量濃度3次結(jié)果的平均值；
T—準(zhǔn)確度參考品的濃度。
3.重復(fù)性
用兩個(gè)濃度水平的樣本各重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算10次測(cè)量濃度結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式(2)得出變異系數(shù)CV。
CV＝SD/M×100％·公式(2)
式中：
CV—變異系數(shù)；
SD—10次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差；
M—10次測(cè)量結(jié)果的平均值。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。