本發(fā)明涉及一種三聚氰胺的檢測(cè)方法，尤其是涉及一種基于連接量子點(diǎn)和膠體金的Y型DNA結(jié)構(gòu)快速檢測(cè)三聚氰胺的方法。

背景技術(shù)：

2008年9月，我國爆發(fā)了三鹿嬰幼兒奶粉污染事件，導(dǎo)致食用受污染奶粉的嬰幼兒患上腎結(jié)石，原因是奶粉中摻雜了三聚氰胺，隨后液態(tài)奶、奶糖、雪糕等制品中相繼檢測(cè)出三聚氰胺，這次的食品安全事故引起了人們對(duì)于食品安全的極大恐慌，國家質(zhì)檢總局緊急在全國開展嬰幼兒奶粉中三聚氰胺含量的專項(xiàng)檢查，對(duì)其余109家乳品企業(yè)進(jìn)行了排查。結(jié)果顯示，有22家嬰幼兒奶粉生產(chǎn)企業(yè)的69批次產(chǎn)品檢出了含有不同程度的三聚氰胺。時(shí)隔6年，2014年8月廣東省潮州市含三聚氰胺的酸奶片事件又一次轟動(dòng)全國。為了促進(jìn)奶業(yè)健康、有序、可持續(xù)發(fā)展，保障人類身體健康，必須加大對(duì)食品中三聚氰胺的監(jiān)測(cè)力度。

三聚氰胺（2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪，Melamine，英文縮寫為 Mel），俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，其分子式為C₃H₆N₆，簡稱三胺。它是重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，主要用作生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂，還可作為甲醛清潔劑、減水劑、阻燃劑等。目前國際上通常采用凱氏定氮法測(cè)定食品中粗蛋白質(zhì)的含量，即以氮元素的含量乘以6.25計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)的含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.6%，而三聚氰胺的含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)66.6%，因此一些不法商家利用此原料，提高食品中的“蛋白質(zhì)含量”。根據(jù)新的牛奶國家標(biāo)準(zhǔn)（GB-2010）可知，蛋白質(zhì)的含量應(yīng)不低于2.8%。由于每1 kg牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4%的蛋白質(zhì)含量，而且用全氮測(cè)定法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量時(shí)根本不會(huì)區(qū)分這種偽蛋白氮，因此許多不法商家為了使牛奶中所含蛋白質(zhì)達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，就會(huì)非法添加三聚氰胺。三聚氰胺不能被人體代謝，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的健康和利益，尤其是兒童，服用三聚氰胺超標(biāo)的食品，會(huì)導(dǎo)致腎結(jié)石，更嚴(yán)重的會(huì)造成生殖系統(tǒng)的損害，如膀胱結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。食物及藥物管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：三聚氰胺每日可容忍攝入量為0.63 mg/(kg·bw)，這對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)提出了新要求。因此，急需一種快速、簡便，并能達(dá)到更高準(zhǔn)確度和靈敏度的檢測(cè)三聚氰胺的方法。

三聚氰胺的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有重量法、升華法等，這些方法只能實(shí)現(xiàn)食品中三聚氰胺原料的檢測(cè)；近幾年發(fā)展起來的方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），這些方法通常需要昂貴的儀器和高素質(zhì)的檢驗(yàn)人員，而且檢測(cè)成本較高，會(huì)浪費(fèi)大量人力、物力，這些因素限制了大型儀器檢測(cè)方法的大面積推廣和批量檢測(cè)，不適用于消費(fèi)者對(duì)蛋白食品的快速篩選和診斷，也不適合快速檢測(cè)。此外，一些快速檢測(cè)三聚氰胺的方法也被建立，主要有拉曼光譜法、酶聯(lián)免疫法，其中酶聯(lián)免疫法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，操作簡便，被廣泛應(yīng)用于食品中三聚氰胺殘留的檢測(cè)。但是也存在一些缺陷，主要是受到抗體的一些性質(zhì)的限制，比如抗體的制備依賴于細(xì)胞或活體，其制備麻煩、成本較高、靶目標(biāo)范圍較窄，這使得免疫分析法應(yīng)用范圍較小，同時(shí)，抗體因其生產(chǎn)制備工藝易產(chǎn)生批次差異，而且其保存、應(yīng)用條件相對(duì)苛刻，這些不穩(wěn)定的因素也影響著酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)的精確性。近年來出現(xiàn)的核酸適配體在很大程度上彌補(bǔ)了以上不足。核酸適配體（aptamer）作為一段人工設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列，擁有和抗體一樣高特異性識(shí)別靶目標(biāo)物的能力。它作為一類新型識(shí)別分子探針，具有特異性高、親和力強(qiáng)、易于生產(chǎn)和保存等一系列優(yōu)越特性，已被認(rèn)可為“化學(xué)抗體”，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注和應(yīng)用。同時(shí)伴隨納米技術(shù)的不斷發(fā)展，多種多樣的功能化納米材料作為新型信號(hào)標(biāo)記物不斷涌現(xiàn)，在食品檢測(cè)領(lǐng)域中引起了廣泛的關(guān)注。其中，量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是一種熒光半導(dǎo)體納米晶體，具有高熒光發(fā)射、寬的斯托克斯位移、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)、生物相容性好、易修飾等優(yōu)點(diǎn)，為發(fā)展具有新型信號(hào)放大效應(yīng)的食品檢測(cè)方法提供了契機(jī)。

在核酸適配體熒光探針的設(shè)計(jì)中，量子點(diǎn)一般會(huì)與有機(jī)淬滅劑或染料分子聯(lián)用，通過適配體與目標(biāo)物結(jié)合后，所引起的核酸結(jié)構(gòu)改變來影響它們之間的能量轉(zhuǎn)移過程，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的輸出。目前，利用膠體金（gold nanoparticles，AuNPs）比色法檢測(cè)三聚氰胺的報(bào)道已經(jīng)很多，比色方法與單純依靠儀器檢測(cè)的傳統(tǒng)方法相比，其最大的優(yōu)勢(shì)是可以不需要借助儀器，只需要肉眼判斷即可判定三聚氰胺的存在，或者采用常用的分光光度計(jì)即可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。因此與傳統(tǒng)方法相比，以膠體金為基礎(chǔ)檢測(cè)三聚氰胺的比色方法具有省時(shí)省力便于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但是膠體金比色法的缺點(diǎn)也比較明顯。比色法受樣品基質(zhì)顏色干擾比較大，需要配合開發(fā)簡單方便的樣品前處理方法，減少樣品基質(zhì)的干擾。正如目前常用的膠體金試紙條一樣，比色法相對(duì)其他方法諸如熒光法而言，靈敏度偏低，對(duì)于一些低含量物質(zhì)的檢測(cè)，需要考慮引入信號(hào)放大等方式進(jìn)行高靈敏的檢測(cè)。目前，國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于將量子點(diǎn)與膠體金結(jié)合，再利用Y型DNA結(jié)構(gòu)對(duì)三聚氰胺進(jìn)行快速檢測(cè)的相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)的基于連接量子點(diǎn)和膠體金的Y型DNA結(jié)構(gòu)快速檢測(cè)三聚氰胺的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種基于連接量子點(diǎn)和膠體金的Y型DNA結(jié)構(gòu)快速檢測(cè)三聚氰胺的方法，包括以下步驟：

（1）CdSe QDs的制備

A．將390 mg硒粉和189 mg硼氫化鈉加入到4 mL超純水，將容器置于冰浴中反應(yīng)24 h，得到硒前驅(qū)體，將其避光放置于4℃冰箱中備用；

B．將570 mg 2.5水合氯化鎘完全溶解于148 mL超純水中，再加入0.5 mL巰基丙酸，用1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5，得到鎘前驅(qū)體；

C．先將制備的鎘前驅(qū)體置于三頸燒瓶中，在N₂保護(hù)下，向三頸燒瓶中迅速注入制備好的硒前驅(qū)體上清液2 mL，10 min后將反應(yīng)后的溶液快速轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，通過控制反應(yīng)溫度為180℃，反應(yīng)時(shí)間為220 min，得到粒徑為4-6 nm的CdSe QDs溶液；

（2）發(fā)夾探針兩端標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs

A．發(fā)夾探針A兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs：

將10 μL 5 μM的發(fā)夾探針A、3 μL 1mM 的三(2-羧乙基)膦（TCEP）和3 μL 1.5 M的醋酸緩沖液（AB）分別加入到潔凈的小玻璃瓶中，混勻，避光振蕩反應(yīng)1 h；然后加入200μL 膠體金溶液，混勻，振蕩反應(yīng)1 h；再加入20 μL 100 μM dATP（三磷酸脫氧腺苷）溶液，混勻，振蕩反應(yīng)1 h；再加入40 μL 0.1 M NaCl溶液，混勻，室溫反應(yīng)0.5 h，置于冰箱中4 ℃過夜；最后離心取沉淀，在沉淀中加入200 μL PBS緩沖液，混勻得到一端標(biāo)記了AuNPs的發(fā)夾探針A；分別取70 μL CdSe QDs溶液、5 μL 100 ppb的碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液和5 μL 100 ppb的羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶液混勻，活化0.5 h后，用50 kDa的超濾離心管在13000 rpm下離心10 min，取超濾離心管中的溶液加雙蒸水至原體積，放入4 ℃冰箱備用；

再將一端標(biāo)記了AuNPs的發(fā)夾探針A與活化好的CdSe QDs溶液混勻，室溫反應(yīng)2 h，最后采用PBS緩沖液為重懸液，將混合液離心重懸，得到兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液，于4 ℃冰箱備用；

B．取發(fā)夾探針B重復(fù)上述步驟，首先在發(fā)夾探針B的一端標(biāo)記AuNPs，其次在發(fā)夾探針B的另一端標(biāo)記CdSe QDs ，得到兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液，于4 ℃冰箱備用；

（3）三聚氰胺的檢測(cè)

分別將20 μL1 μM DNA1溶液和20 μL 3 μM DNA2溶液加入到50 μL 0.01 M PBS緩沖液中混勻，室溫反應(yīng)30 min；再加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品（以水為空白對(duì)照），混勻，室溫反應(yīng)40 min；最后分別加入30 μL 4 μM的兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液，30 μL 4 μM的兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液和30 μL 4 μM的probe C溶液，混勻反應(yīng)90 min，通過酶標(biāo)儀測(cè)得一系列不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的熒光光譜圖，掃描波長從450 nm到700 nm（激發(fā)波長為395 nm），得到三聚氰胺濃度與熒光強(qiáng)度之間的定量關(guān)系，根據(jù)兩者的定量關(guān)系，確定待測(cè)樣品中三聚氰胺的含量。

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液的具體步驟如下：將1 mL質(zhì)量濃度為0.5%的氯金酸和60 mL的雙蒸水加入到錐形瓶中加入，在加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰，并維持1500 r/min的轉(zhuǎn)速不變，向沸騰后的溶液中迅速加入850 μL質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉溶液，溶液的顏色在2 min內(nèi)發(fā)生明顯變化，當(dāng)顏色不再變化時(shí)繼續(xù)加熱煮沸5 min，冷卻后補(bǔ)水至原體積，冷卻后體積濃縮5倍得到膠體金溶液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，其中所用的玻璃儀器都用王水浸泡過夜，再用雙蒸水清洗，烘干備用。

所述的DNA1的堿基序列為：5' -GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC ACC CCG ATG GCG GTC CAG TTC TAC GGT AAG CTC ATA TGC CGG ACG TAG AGA CTG GGG AG -3'；

所述的DNA2的堿基序列為：5' -CTG GAC CGC CAT CGG GGT GCT TGA -3'；

所述的probe A的堿基序列為：5' -SH-GCT TGA GAT GTT AGG GAG TAG TGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA CTC CCT AAC ATC-NH₂ -3'；

所述的probe B的堿基序列為：5'- NH₂-AGG GAG TAG TGC GTT GTG ATT GGA AAC ATC TCA AGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA-SH-3'；

所述的probe C的堿基序列為：5'-GTT GTG ATT GGA GCT TGA GAT GTT GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC TCC AAT-3'。

發(fā)明原理：如圖1所示，采用的DNA1是含有三聚氰胺適配體的一段堿基序列，DNA2是與DNA1的部分序列互補(bǔ)的一段堿基序列。首先是含有目標(biāo)物核酸適配體的DNA1與DNA2雜交，當(dāng)目標(biāo)物不存在時(shí)，DNA1與DNA2依然雜交，再加入一端標(biāo)記CdSe QDs另一端標(biāo)記AuNPs的發(fā)夾探針A和發(fā)夾探針B以及未標(biāo)記的發(fā)夾探針C，發(fā)夾探針A、B、C的發(fā)夾不會(huì)打開，同一發(fā)夾探針上的QDs與AuNPs之間的距離小于10 nm，QDs與AuNPs之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），QDs的熒光被淬滅；當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，由于三聚氰胺與含有三聚氰胺適配體的DNA1親和力更強(qiáng)，目標(biāo)物與DNA1上的適配體結(jié)合，DNA2被置換下來，再加入一端標(biāo)記QDs另一端標(biāo)記AuNPs的發(fā)夾探針A和發(fā)夾探針B以及未標(biāo)記的發(fā)夾探針C，結(jié)合有目標(biāo)物的DNA1與發(fā)夾探針A的一部分序列雜交，發(fā)夾探針A的發(fā)夾打開，發(fā)夾探針A上的QDs熒光恢復(fù)，發(fā)夾探針A的另一部分序列與發(fā)夾探針B的一部分序列雜交，形成Y型結(jié)構(gòu)的一端，發(fā)夾探針B上的QDs熒光恢復(fù)，發(fā)夾探針B的另一部分序列與發(fā)夾探針C的一部分序列雜交，形成Y型結(jié)構(gòu)的另一端，由于發(fā)夾探針C與發(fā)夾探針A結(jié)合能力更強(qiáng)，因此，發(fā)夾探針C的另一部分序列與發(fā)夾探針A雜交，形成Y型結(jié)構(gòu)的最后一端，含有目標(biāo)物的DNA1脫落下來，繼續(xù)參與下一個(gè)循環(huán)，這樣就產(chǎn)生了信號(hào)放大。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了基于連接量子點(diǎn)和膠體金的Y型DNA結(jié)構(gòu)快速檢測(cè)三聚氰胺的方法，包括膠體金和CdSe QDs的制備；在發(fā)夾探針A（發(fā)夾探針B）的兩端分別標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs，即probe A（probe B）；鏈置換反應(yīng)；Y型DNA結(jié)構(gòu)的形成，快速檢測(cè)三聚氰胺，首先在發(fā)夾探針A和發(fā)夾探針B的兩端分別標(biāo)記膠體金和量子點(diǎn)， DNA1與DNA2在適宜條件下雜交，當(dāng)不存在三聚氰胺時(shí)，由于膠體金和量子點(diǎn)之間的距離接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），量子點(diǎn)的熒光被膠體金淬滅，當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，才會(huì)形成Y型DNA結(jié)構(gòu)，膠體金和量子點(diǎn)之間的距離增大，量子點(diǎn)的熒光逐漸恢復(fù)，從而建立量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與三聚氰胺的濃度之間的關(guān)系，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)三聚氰胺的目的。本方法通過將量子點(diǎn)與膠體金結(jié)合，再利用Y型DNA結(jié)構(gòu)用于信號(hào)放大，具有靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡便，快速，時(shí)效性強(qiáng)，節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣。

附圖說明

圖1為基于連接量子點(diǎn)和膠體金的Y型DNA結(jié)構(gòu)對(duì)三聚氰胺的快速檢測(cè)的原理示意圖；

圖2為本發(fā)明制備的膠體金的紫外吸收光譜圖；

圖3為本發(fā)明制備的膠體金的粒度分布圖；

圖4為本發(fā)明制備的CdSe量子點(diǎn)的熒光光譜圖；

圖5為本發(fā)明制備的CdSe量子點(diǎn)的粒度分布圖；

圖6為本發(fā)明制備的probe A的表征圖；a，CdSe QDs；b，標(biāo)記了CdSe QDs點(diǎn)的發(fā)夾探針A；c，兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe A-未重懸；d，兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe A -重懸后；

圖7為實(shí)施例中不同條件下的熒光光譜圖；a, no Mel，DNA1-DNA2, probe A, B, and C； b,0.2 μM Mel, DNA1-DNA2, probe A；c；0.2 μM Mel, DNA1-DNA2, probe A and B； d,0.2 μM Mel, DNA1-DNA2, probe A, B, and C；其中probe A, B的兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs，probe C兩端未標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs；

圖8為實(shí)施例中不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)的熒光光譜圖；

圖9為實(shí)施例中三聚氰胺的濃度與量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)效率之間建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線；三聚氰胺的濃度依次為0.01，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 μM；F：不同濃度的三聚氰胺的實(shí)際熒光強(qiáng)度，F(xiàn)₀：對(duì)照組熒光強(qiáng)度；

圖10為實(shí)施例中三聚氰胺特異性檢測(cè)圖；橫坐標(biāo)依次為：對(duì)照（Blank），三聚氰胺（Mel），氯化鎂（MgCl₂），氯化鋅（ZnCl₂），氯化鈣（CaCl₂），氯化鉀（KCl），葡萄糖（Glucose），蔗糖（Sucrose），乳糖（Lactose），甘氨酸（Glycine），半胱氨酸（Cysteine），賴氨酸（Lysine）。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

一、具體實(shí)施例

一種基于連接量子點(diǎn)和膠體金的Y型DNA結(jié)構(gòu)快速檢測(cè)三聚氰胺的方法，其原理如圖1所示，具體包括以下步驟：

（1）膠體金溶液的制備（采用檸檬酸鈉還原法）

將1 mL質(zhì)量濃度為0.5%的氯金酸和60 mL的雙蒸水加入到錐形瓶中加入，在加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰，并維持1500 r/min的轉(zhuǎn)速不變，向沸騰后的溶液中迅速加入850 μL質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉溶液，溶液的顏色在2 min內(nèi)發(fā)生明顯變化，當(dāng)顏色不再變化時(shí)繼續(xù)加熱煮沸5 min，冷卻后補(bǔ)水至原體積，冷卻后體積濃縮5倍得到膠體金溶液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫渲兴玫牟Ａx器都用王水浸泡過夜，再用雙蒸水清洗，烘干備用；制備的膠體金的紫外吸收光譜圖如圖2所示，膠體金溶液的最大吸收峰為525 nm，吸收峰尖銳，沒有雜峰出現(xiàn)，說明所制備膠體金粒徑均一。制備的膠體金的粒度分布圖如圖3所示，膠體金的粒徑大致分布在25-40 nm之間，滿足實(shí)驗(yàn)要求；

（2）CdSe QDs的制備

A．將390 mg硒粉和189 mg硼氫化鈉加入到4 mL超純水，將容器置于冰浴中反應(yīng)24 h，得到硒前驅(qū)體，將其避光放置于4℃冰箱中備用；

B．將570 mg 2.5水合氯化鎘完全溶解于148 mL超純水中，再加入0.5 mL巰基丙酸，用1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5，得到鎘前驅(qū)體；

C．先將制備的鎘前驅(qū)體置于三頸燒瓶中，在N₂保護(hù)下，向三頸燒瓶中迅速注入制備好的硒前驅(qū)體上清液2 mL，10 min后將反應(yīng)后的溶液快速轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，通過控制反應(yīng)溫度為180℃，反應(yīng)時(shí)間為220 min，得到粒徑為4-6 nm的CdSe QDs溶液；

制備的CdSe量子點(diǎn)的熒光光譜圖如圖4所示，對(duì)稱性好，且半峰寬窄，說明制備的量子點(diǎn)粒徑均一；制備的CdSe量子點(diǎn)的粒度分布圖如圖5所示，平均粒徑為4.85 nm，分布均勻，進(jìn)一步證明所制備的CdSe量子點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)要求；

（3）發(fā)夾探針兩端標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs

A．發(fā)夾探針A兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs：

將10 μL 5 μM的發(fā)夾探針A、3 μL 1mM 的三(2-羧乙基)膦（TCEP）和3 μL 1.5 M的醋酸緩沖液（AB）分別加入到潔凈的小玻璃瓶中，混勻，避光振蕩反應(yīng)1 h；然后加入200μL 膠體金溶液，混勻，振蕩反應(yīng)1 h；再加入20 μL 100 μM dATP（三磷酸脫氧腺苷）溶液，混勻，振蕩反應(yīng)1 h；再加入40 μL 0.1 M NaCl溶液，混勻，室溫反應(yīng)0.5 h，置于冰箱中4 ℃過夜；最后離心取沉淀，在沉淀中加入200 μL PBS緩沖液，混勻得到一端標(biāo)記了AuNPs的發(fā)夾探針A；分別取70 μL CdSe QDs溶液、5 μL 100 ppb的碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液和5 μL 100 ppb的羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶液混勻，活化0.5 h后，用50 kDa的超濾離心管在13000 rpm下離心10 min，取超濾離心管中的溶液加雙蒸水至原體積，放入4 ℃冰箱備用；再將一端標(biāo)記了AuNPs的發(fā)夾探針A與活化好的CdSe QDs溶液混勻，室溫反應(yīng)2 h，最后采用PBS為重懸液，將混合液離心重懸，得到兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液，于4 ℃冰箱備用；

制備的probe A的表征圖如圖6所示；其中a，CdSe QDs；b，標(biāo)記了CdSe QDs的發(fā)夾探針A；c，兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的發(fā)夾探針A（即probe A）-未重懸；d，probe A-重懸后；由a和b可知，偶聯(lián)發(fā)夾探針A的CdSe QDs的熒光光圖譜相對(duì)于未偶聯(lián)探針的CdSe QDs發(fā)生了紅移，且熒光強(qiáng)度僅有微弱的減小；由a、c、d可知，c和d相對(duì)a發(fā)生了紅移，說明CdSe QDs標(biāo)記在發(fā)夾探針A上，由b、c和d可知，c和d的熒光強(qiáng)度相對(duì)b明顯減弱，說明AuNPs也標(biāo)記在發(fā)夾探針A上，且QDs和AuNPs之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移，證明形成兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe A；

B．取發(fā)夾探針B重復(fù)上述步驟，首先在發(fā)夾探針B的一端標(biāo)記AuNPs，其次在發(fā)夾探針B的另一端標(biāo)記CdSe QDs ，得到兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液，于4 ℃冰箱備用；

（3）三聚氰胺的檢測(cè)

分別取20 μL1 μM DNA1、20 μL 3 μM DNA2于50 μL 0.01 M PBS緩沖液中混勻，室溫反應(yīng)30 min；再加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品（以水為空白對(duì)照），混勻，室溫反應(yīng)40 min；最后分別加入30 μL 4 μM的probe A、probe B和probe C，混勻反應(yīng)90 min，通過酶標(biāo)儀測(cè)得一系列不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的熒光光譜圖，掃描波長從450 nm到700 nm（激發(fā)波長為395 nm），得到三聚氰胺濃度與熒光強(qiáng)度之間的定量關(guān)系，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，根據(jù)兩者的定量關(guān)系，確定待測(cè)樣品中三聚氰胺的含量。

上述DNA1、DNA2、probe A、probe B、probe C的堿基序列如下所示：

DNA1：5' -GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC ACC CCG ATG GCG GTC CAG TTC TAC GGT AAG CTC ATA TGC CGG ACG TAG AGA CTG GGG AG -3'；

DNA2：5' -CTG GAC CGC CAT CGG GGT GCT TGA -3'；

probe A：5' -SH-GCT TGA GAT GTT AGG GAG TAG TGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA CTC CCT AAC ATC-NH₂ -3'；

probe B：5'- NH₂-AGG GAG TAG TGC GTT GTG ATT GGA AAC ATC TCA AGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA-SH-3'；

probe C：5'-GTT GTG ATT GGA GCT TGA GAT GTT GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC TCC AAT-3'。

由圖8可知，在0-0.5 μM范圍內(nèi)，隨著三聚氰胺濃度的增加，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；由圖9可知，在0.01-0.3 μM范圍內(nèi)，三聚氰胺的濃度與量子點(diǎn)的熒光增強(qiáng)效率有良好的線性關(guān)系，即y=0.30577x+0.06576，且R²=0.97657，檢測(cè)限為9.25 nM。

二、可行性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證上述具體實(shí)施例所設(shè)計(jì)的檢測(cè)三聚氰胺方法的可行性，測(cè)得在不同條件下溶液的熒光光譜圖。如圖7所示，當(dāng)三聚氰胺不存在時(shí)，溶液中包括DNA1-DNA2、probe A、probe B和probe C，產(chǎn)生的微弱熒光是由于加入的probe A和probe B本身產(chǎn)生的背景信號(hào)，即曲線a；當(dāng)加入三聚氰胺，溶液中包括DNA1-DNA2、probe A時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，即曲線b，這是因?yàn)槿矍璋泛虳NA1的結(jié)合物與probe A雜交，使probe A的發(fā)夾打開，量子點(diǎn)的熒光恢復(fù)；probe A和probe B都存在時(shí)，熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，即曲線c；當(dāng)三聚氰胺、DNA1-DNA2、probe A、probe B和probe C都存在時(shí)，量子點(diǎn)的熒光急劇增強(qiáng)，即曲線d，這是因?yàn)閜robe A、probe B和probe C形成了一個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生了信號(hào)放大。

綜上所述，本發(fā)明三聚氰胺檢測(cè)方法，首先，在發(fā)夾探針A和發(fā)夾探針B的兩端相應(yīng)標(biāo)記膠體金和量子點(diǎn)，由于膠體金和量子點(diǎn)之間的距離接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），量子點(diǎn)的熒光被膠體金淬滅，當(dāng)三聚氰胺以及probe A、probe B和probe C都存在時(shí)存在時(shí)，NA1和三聚氰胺的結(jié)合物在適宜條件下首先與probe A雜交，形成Y型結(jié)構(gòu)的一端，再與probe B雜交形成另一端，最后由于probe A與probe C的親和力強(qiáng)于probe A與DNA1，所以probe A和probe C雜交形成Y型結(jié)構(gòu)的最后一端，膠體金和量子點(diǎn)之間的距離增大，量子點(diǎn)的熒光逐漸恢復(fù)，從而建立量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與三聚氰胺的濃度之間的關(guān)系。該方法通過將量子點(diǎn)與膠體金結(jié)合，再利用Y型DNA結(jié)構(gòu)用于信號(hào)放大， 從而大幅提高了靈敏度。其中probe A, B的兩端相應(yīng)標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs，probe C兩端未標(biāo)記AuNPs和CdSe QDs。

三、特異性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證本發(fā)明方法對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的選擇性，我們對(duì)一些潛在干擾物質(zhì)，如一些常見的離子、氨基酸、有機(jī)分子等進(jìn)行研究。試管1為空白對(duì)照（Blank），試管2中加入100 nM的三聚氰胺（Mel），試管3到試管12中依次加入10 μM Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、K⁺、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、乳糖（Lactose）、甘氨酸（Glycine）、半胱氨酸（Cysteine）、賴氨酸（Lysine），按照本發(fā)明方法對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的具體步驟，對(duì)試管1到12進(jìn)行相同操作。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：圖10顯示了各種干擾物質(zhì)對(duì)熒光增強(qiáng)效率的響應(yīng)。從圖10可以看出，這些高濃度的干擾物質(zhì)對(duì)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的恢復(fù)影響較小，進(jìn)一步說明本發(fā)明方法對(duì)三聚氰胺檢測(cè)有較高的選擇性。

當(dāng)然，上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。