本發(fā)明屬于卷煙主流煙氣中重要化學(xué)成分分析的
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，具體涉及一種采用多維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析卷煙煙氣中亞硝胺類(lèi)化合物釋放量的方法。
背景技術(shù)：
：煙草特有亞硝胺(TSNAs，Tobacco-SpecificNitrosamines)是發(fā)現(xiàn)僅存在于煙草和煙氣中的非揮發(fā)性亞硝胺。一般認(rèn)為，煙草特有亞硝胺是在煙草調(diào)制過(guò)程中通過(guò)煙草生物堿硝化作用形成的。煙草特有亞硝胺(TSNAs)主要包括是4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)，其結(jié)構(gòu)如下式。其中，NNN和NNK被國(guó)際癌癥研究署(IARC)認(rèn)定為一類(lèi)致癌物，而NAB和NAT被證實(shí)對(duì)動(dòng)物有致癌性。由于卷煙煙氣有超過(guò)五千種成分且組成復(fù)雜，目前主流的方法主要有高效氣相色譜-熱能分析(GC-TEA)法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)。但是，GC-TEA法存在前處理步驟煩瑣、樣品分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度較低等缺點(diǎn)，而LC-MS法有基質(zhì)干擾嚴(yán)重，方法的靈敏度、檢測(cè)限較低等問(wèn)題。多維液相色譜(MDLC)，即將樣品在第一根液相色譜柱的洗脫液依次注入后面的色譜柱進(jìn)行分離的液相色譜聯(lián)用技術(shù)，其與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用是目前對(duì)復(fù)雜樣品分離分析最受重視的手段之一，因此對(duì)于卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的測(cè)定方法有必要進(jìn)行進(jìn)一步的探討和研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏高準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性好、檢測(cè)限低、二次分離后樣品不易污染質(zhì)譜離子源，適應(yīng)于樣品批量檢測(cè)的卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法的問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，對(duì)卷煙煙氣進(jìn)行樣品前處理，采用多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)前處理所得待測(cè)樣品進(jìn)行定性定量分析，所述多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括依次連接的第一維液相色譜裝置、第二維液相色譜裝置、質(zhì)譜裝置。較佳地，所述卷煙煙氣中亞硝胺包括有N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝基氨基)-l-(3-比啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙草堿(NAT)。較佳地，所述樣品前處理包括以下步驟：1)選取卷煙煙支，點(diǎn)燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣；2)將濾片進(jìn)行超聲萃取后靜置、離心，取上清液過(guò)濾后，即得待測(cè)樣品。優(yōu)選地，在步驟1)中，所述濾片為劍橋?yàn)V片。所述劍橋?yàn)V片的直徑為44mm。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述濾片置于EP管中進(jìn)行萃取。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述萃取溶液為0.05-0.2mol/L乙酸銨(NH4Ac)水溶液。更優(yōu)選地，所述萃取溶液為0.1mol/L乙酸銨(NH4Ac)水溶液。所述乙酸銨水溶液，通過(guò)稱(chēng)取乙酸銨，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容得到。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述超聲萃取的時(shí)間為30-50min。更優(yōu)選地，所述超聲萃取的時(shí)間為40min。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述靜置時(shí)間為4-6min。更優(yōu)選地，所述靜置時(shí)間為5min。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述離心條件為：離心時(shí)間：4-6min；離心轉(zhuǎn)速：2700-3300rpm。更優(yōu)選地，所述離心條件為：離心時(shí)間：5min；離心轉(zhuǎn)速：3000rpm。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述過(guò)濾的方式為水相濾膜過(guò)濾方式。更優(yōu)選地，所述水相濾膜的孔徑為0.22μm。較佳地，所述采用多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)前處理所得待測(cè)樣品進(jìn)行定性定量分析，包括以下步驟：A)配制標(biāo)準(zhǔn)樣品；A1)分別稱(chēng)取NAB、NAT、NNN、NNK的標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；優(yōu)選地，所述NAB、NAT、NNN、NNK的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度均為0.5mg/ml。優(yōu)選地，所述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度均為50μg/ml。A2)分別稱(chēng)取d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK，加入甲醇定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液；優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為5μg/ml。優(yōu)選地，所述d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK為氘代試劑。具體的，所述d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK分別為氘代N-亞硝基去甲基煙堿、氘代N-亞硝基新煙草堿、氘代N-亞硝基假木賊堿、氘代4-(甲基亞硝基氨基)-l-(3-比啶基)-1-丁酮。所述d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK為商品化試劑，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適于作為內(nèi)標(biāo)。A3)分別移取不同體積的步驟A1中混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再分別加入一定體積的步驟A2中內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容配制為一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。優(yōu)選地，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0-10ng/ml。優(yōu)選地，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)，d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為1ng/ml。B)樣品定性檢測(cè)：分別將步驟A)配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品和經(jīng)樣品前處理后待測(cè)樣品進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，通過(guò)第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分后，由所述第二維液相色譜裝置進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測(cè)定，比較保留時(shí)間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測(cè)樣品中4種亞硝胺成分；C)樣品定量檢測(cè)：分別將步驟A)配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品和經(jīng)樣品前處理后待測(cè)樣品進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，通過(guò)第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分后，由所述第二維液相色譜裝置進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測(cè)樣品中4種亞硝胺成分的含量。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分是將步驟A1配制的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和經(jīng)樣品前處理后待測(cè)樣品溶液通過(guò)第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜裝置進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測(cè)定是指將步驟A3配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)樣品的稀釋溶液通過(guò)第二維液相色譜裝置進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：正相液相色譜；色譜柱：強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱(SCX)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220-240nm；柱溫：25-35℃；流速：0.5-1.5mL/min；進(jìn)樣量：5-15μl；流動(dòng)相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動(dòng)相B相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+0.1-1.0mol/LKCl+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；梯度洗脫。更優(yōu)選地，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：WatersACQUITYUPLC；色譜柱：WatersSpherisorbS5SCX(4.6*150mm,5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μl；流動(dòng)相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動(dòng)相B相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+0.5mol/LKCl+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；梯度洗脫。上述百分比％為體積百分比。最優(yōu)選地，如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-5min，A相：B相體積比為100：0-90：10；5-5.1min，A相：B相體積比為90：10-60：40；5.1-15min，A相：B相體積比為60：40-0：100；15-15.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；15.1-40min，A相：B相體積比為100：0-100：0。表1第一維液相色譜裝置的梯度洗脫保留時(shí)間T(min)流動(dòng)相A相流動(dòng)相B相01000590105.1604015010015.11000401000優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：C18柱；柱溫：25-35℃；流速：0.2-0.3mL/min；進(jìn)樣量：5-15μl；流動(dòng)相A相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；流動(dòng)相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％CH3CN+2-8％H2O；梯度洗脫。更優(yōu)選地，所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：AgilentTechnologies1260Infinity反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：WatersCortecsC18(2.1*150mm,2.7μm)；柱溫：30℃；流速：0.25mL/min；進(jìn)樣量：10μl；流動(dòng)相A相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；流動(dòng)相B相：5mmol/LNH4Ac+95％CH3CN+5％H2O；梯度洗脫。上述百分比％為體積百分比。最優(yōu)選地，如表2所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-10min，A相：B相體積比為100：0-100：0；10-20min，A相：B相體積比為100：0-0：100；20-22min，A相：B相體積比為0：100-0：100；22-22.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；22-25min，A相：B相體積比為100：0-100：0。表2第二維液相色譜裝置的梯度洗脫保留時(shí)間t/min流動(dòng)相A相流動(dòng)相B相0100010100020010022010022.11000251000優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述質(zhì)譜裝置的條件為：質(zhì)譜：三重四極桿質(zhì)譜；電離方式：ESI；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；MRM條件：見(jiàn)表3；清洗進(jìn)樣針程序：needlewash20-40s；質(zhì)譜流路切換：從8-12min開(kāi)始掃描，26-30min結(jié)束。更優(yōu)選地，所述質(zhì)譜裝置的條件為：質(zhì)譜：AgilentTechnologies6460TripleQuadMS三重四極桿質(zhì)譜；電離方式：ESI；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；MRM條件：見(jiàn)表3；清洗進(jìn)樣針程序：needlewash30s；質(zhì)譜流路切換：從10min開(kāi)始掃描，28min結(jié)束。表3MRM條件母離子(m/z)子離子(m/z)FragmentorCE(eV)NNK208.1122.1608NAB192.1162.1604NAT190.1160.1604NNN178.1148.1505優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分后采用中心切割法，獲得4種亞硝胺成分的餾分。所述4種亞硝胺成分的餾分包括NNK、NNN、NAT、NAB餾分。所述中心切割法為多維色譜中常用的分離方法，在本發(fā)明的二維液相色譜中，即將第一維液相色譜分離出的目標(biāo)物餾分的色譜峰的切割完整轉(zhuǎn)移至第二維液相色譜，其它非目標(biāo)物餾分不進(jìn)第二維液相色譜。更優(yōu)選地，所述4種亞硝胺成分的餾分是通過(guò)第二維液相色譜裝置分離，并經(jīng)質(zhì)譜裝置通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)荷比確定每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。所述4種亞硝胺成分的質(zhì)荷比數(shù)值見(jiàn)表3。所述NNK餾分的母離子質(zhì)荷比為208.1，字離子質(zhì)荷比為122.1；所述NAB餾分的母離子質(zhì)荷比為192.1，字離子質(zhì)荷比為162.1；所述NAT餾分的母離子質(zhì)荷比為190.1，字離子質(zhì)荷比為160.1；所述NNN餾分的母離子質(zhì)荷比為178.1，字離子質(zhì)荷比為148.1。更優(yōu)選地，所述4種亞硝胺成分的餾分為編號(hào)為6、7、8、9、10、11的6個(gè)餾分。如表4所示，所述編號(hào)為6、7、8、9、10、11的6個(gè)餾分物質(zhì)分別為：編號(hào)為6餾分物質(zhì)為NNK；編號(hào)為7餾分物質(zhì)為NNK；編號(hào)為8餾分物質(zhì)為NNN；編號(hào)為9餾分物質(zhì)為NNN；編號(hào)為10餾分物質(zhì)為NAT；編號(hào)為11餾分物質(zhì)為NAB。表4餾分物質(zhì)餾分67891011物質(zhì)NNKNNKNNNNNNNATNAB優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置與第二維液相色譜裝置之間還設(shè)有第二維捕集柱。更優(yōu)選地，所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：C18柱；流動(dòng)相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動(dòng)相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；梯度洗脫。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×10mmi.d.)；流動(dòng)相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動(dòng)相B相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；梯度洗脫。上述百分比％為體積百分比。最優(yōu)選地，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-30min，A相：B相體積比為100：0-0：100。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置包括有依次連通的第一維液相色譜泵、進(jìn)樣二位六通閥、第一維色譜柱、紫外檢測(cè)器。更優(yōu)選地，所述進(jìn)樣二位六通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第4接口經(jīng)管線依次連通第5接口、第2接口、第3接口，由第3接口經(jīng)管線連通第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第1接口經(jīng)管線連通第一維液相色譜泵的出樣端，所述第6接口經(jīng)管線連通第一維色譜柱，所述第1接口與第6接口相連通。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜裝置包括相連通的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)還包括有連通閥，所述連通閥分別與第一維液相色譜裝置中的紫外檢測(cè)器、第二維液相色譜裝置中的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱相連通。更優(yōu)選地，所述連通閥為二位十通閥或二位六通閥。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述二位十通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第8接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經(jīng)管線與紫外檢測(cè)器的出樣端相連通，所述第10接口經(jīng)管線與第二維捕集柱的進(jìn)樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經(jīng)管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經(jīng)管線依次連通第9接口、第8接口、第5接口、第4接口、第二維色譜柱進(jìn)樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經(jīng)管線與質(zhì)譜儀相連通。所述二位十通閥中將第8接口與第5接口短接后，即第9接口與第4接口直接連接，其結(jié)構(gòu)與所述二位六通閥相同，但是預(yù)留第8接口、第5接口可以在需要兩個(gè)捕集柱切換時(shí)使用。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述二位六通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經(jīng)管線與紫外檢測(cè)器的出樣端相連通，所述第10接口經(jīng)管線與第二維捕集柱的進(jìn)樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經(jīng)管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經(jīng)管線依次連通第9接口、第4接口、第二維色譜柱進(jìn)樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經(jīng)管線與質(zhì)譜儀相連通。最優(yōu)選地，采用多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析時(shí)，將待分析的樣品溶液由進(jìn)樣二位六通閥的第4接口進(jìn)入，樣品溶液依次通過(guò)第5接口、第2接口、第3接口，進(jìn)入第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經(jīng)第1接口、第6接口進(jìn)入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質(zhì)后，通過(guò)紫外檢測(cè)器，進(jìn)入連通閥，通過(guò)二位十通閥的第1接口經(jīng)第10接口進(jìn)入第二維捕集柱，再?gòu)牡诙S捕集柱的出樣端經(jīng)第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第8接口、第5接口、第4接口進(jìn)入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。最優(yōu)選地，采用多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析時(shí)，將待分析的樣品溶液由進(jìn)樣二位六通閥的第4接口進(jìn)入，樣品溶液依次通過(guò)第5接口、第2接口、第3接口，進(jìn)入第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經(jīng)第1接口、第6接口進(jìn)入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質(zhì)后，通過(guò)紫外檢測(cè)器，進(jìn)入連通閥，通過(guò)二位六通閥的第1接口經(jīng)第10接口進(jìn)入第二維捕集柱，再?gòu)牡诙S捕集柱的出樣端經(jīng)第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第4接口進(jìn)入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選地，所述步驟C)中，所述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法包括以下步驟：所述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指在標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，進(jìn)行儀器測(cè)定，獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，進(jìn)而測(cè)定含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的實(shí)際樣品濃度的方法。ⅰ、將步驟A)的A3中一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，分別獲得4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比的線性關(guān)系，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別計(jì)算得到4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。進(jìn)一步的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸)。ⅱ、將經(jīng)樣品前處理后待測(cè)樣品溶液，進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，將獲得的待測(cè)液中4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比，代入步驟ⅰ中相應(yīng)的4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并根據(jù)加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的已知質(zhì)量濃度，計(jì)算得到待測(cè)樣品溶液中4種亞硝胺成分的質(zhì)量濃度。如上所述，本發(fā)明的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，將煙氣樣品經(jīng)過(guò)提取后上樣，采用中心切割多維液相色譜法對(duì)第一維液相色譜(SCX)餾分進(jìn)行分離切割，餾分進(jìn)入第二維液相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。該方法具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，通過(guò)第一維液相色譜分離后中心切割，有效去除煙氣中影響亞硝胺準(zhǔn)確定量的干擾物質(zhì)，降低基質(zhì)的干擾。(2)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，通過(guò)兩維液相色譜分離除雜，進(jìn)入質(zhì)譜樣品干擾離子大大減少，質(zhì)譜離子源不易被污染。(3)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，通過(guò)兩維液相的分離大大提高液相色譜的峰容量和檢測(cè)通量，方法具有靈敏度高、通量高的優(yōu)點(diǎn)。(4)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、檢測(cè)限低，適應(yīng)于樣品的批量檢測(cè)。附圖說(shuō)明圖1顯示為本發(fā)明的對(duì)卷煙煙氣中亞硝胺分析的第一維SCX液相色譜圖，其中，6、7為NNK；8、9為NNN；10為NAT；11為NAB。圖2顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類(lèi)化合物NNK的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖3顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類(lèi)化合物NAB的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類(lèi)化合物NAT的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類(lèi)化合物NNN的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖6顯示為本發(fā)明的一種多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)示意圖。圖中，1、第一維液相色譜泵，2、進(jìn)樣二位六通閥，21、第1接口，22、第2接口，23、第3接口，24、第4接口，25、第5接口，26、第6接口，3、第一維色譜柱，4、紫外檢測(cè)器，5、第二維捕集柱，6、連通閥，61、第1接口，62、第2接口，63、第3接口，64、第4接口，65、第5接口，66、第8接口，67、第9接口，68、第10接口，7、第二維液相色譜泵，8、第二維色譜柱，9、質(zhì)譜儀。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。以下實(shí)施例中使用的試劑及實(shí)驗(yàn)用具均為常規(guī)使用的試劑及實(shí)驗(yàn)用具，均可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)獲得。以下實(shí)施例中使用儀器如下：第一維色譜裝置(WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)，Waters公司)、第二維色譜裝置(AgilentTechnologies1260Infinity系統(tǒng)，Agilent公司)、質(zhì)譜裝置(AgilentTechnologies6460TripleQuadLC/MS系統(tǒng)，Agilent公司)、第一維色譜柱(WatersSpherisorbS5SCX柱(5μm,4.6×150mmi.d.)，Waters公司)、第二維捕集柱(WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×10mmi.d.)，Waters公司)、第二維色譜柱(WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×150mmi.d.)，Waters公司)、紫外檢測(cè)器(WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)，Waters公司)。實(shí)施例11、樣品前處理選取卷煙煙支，點(diǎn)燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣，使煙氣吸附于劍橋?yàn)V片上。將劍橋?yàn)V片置于EP管中加入萃取溶液，置于超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行超聲萃取30-50min，萃取溶液為0.05-0.2mol/LNH4Ac水溶液，NH4Ac水溶液是通過(guò)稱(chēng)取乙酸銨，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容得到。萃取后靜置5±1min，取萃取液置于離心機(jī)上離心5±1min，離心轉(zhuǎn)速為3000±300rpm，然后取上清液經(jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾后，移至色譜分析瓶中，即得待測(cè)樣品溶液。2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別移取10ml濃度為0.5mg/ml的NAB、NAT、NNN、NNK的標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度均為50μg/ml。同時(shí)，分別移取一定體積的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK內(nèi)標(biāo)物，加入甲醇定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為5μg/ml。分別準(zhǔn)確移取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于多個(gè)100mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容，配制為一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0-10ng/ml，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為1ng/ml。3、樣品含量的測(cè)定分別將2配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和1中待測(cè)樣品溶液分別進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，即將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和待測(cè)樣品溶液通過(guò)第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分后，再將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)樣品溶液的稀釋溶液由所述第二維液相色譜裝置進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測(cè)定，比較保留時(shí)間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測(cè)液中4種亞硝胺成分；同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測(cè)液中4種亞硝胺成分的含量。具體來(lái)說(shuō)，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法是先將上述2中一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，分別獲得4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比的線性關(guān)系，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸)，分別計(jì)算得到4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。再將上述1中待測(cè)液進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，將獲得的待測(cè)液中4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比，代入相應(yīng)的4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并根據(jù)加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的已知質(zhì)量濃度，計(jì)算得到待測(cè)液中4種亞硝胺成分的質(zhì)量濃度。其中，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：正相液相色譜；色譜柱：強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱(SCX)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220-240nm；柱溫：25-35℃；流速：0.5-1.5mL/min；進(jìn)樣量：5-15μl；流動(dòng)相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動(dòng)相B相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+0.1-1.0mol/LKCl+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；梯度洗脫。如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-5min，A相：B相體積比為100：0-90：10；5-5.1min，A相：B相體積比為90：10-60：40；5.1-15min，A相：B相體積比為60：40-0：100；15-15.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；15.1-40min，A相：B相體積比為100：0-100：0。第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分，如圖1所示，將譜圖中六個(gè)峰分別收取餾分，從左到右依次編號(hào)6、7、8、9、10、11，從而獲得編號(hào)為6、7、8、9、10、11的6個(gè)餾分。再采用中心切割法，將第一維液相色譜分離出的目標(biāo)物餾分的色譜峰的切割完整轉(zhuǎn)移至第二維液相色譜，其它非目標(biāo)物餾分不進(jìn)第二維液相色譜。所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：C18柱；柱溫：：25-35℃；流速：0.2-0.3mL/min；進(jìn)樣量：5-15μl；流動(dòng)相A相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；流動(dòng)相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％CH3CN+2-8％H2O；梯度洗脫。如表3所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-10min，A相：B相體積比為100：0-100：0；10-20min，A相：B相體積比為100：0-0：100；20-22min，A相：B相體積比為0：100-0：100；22-22.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；22-25min，A相：B相體積比為100：0-100：0。所述質(zhì)譜裝置的條件為：質(zhì)譜：三重四極桿質(zhì)譜；電離方式：ESI；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；MRM條件：見(jiàn)表4；清洗進(jìn)樣針程序：needlewash20-40s；質(zhì)譜流路切換：從8-12min開(kāi)始掃描，26-30min結(jié)束。將經(jīng)第一維液相色譜裝置餾分后獲得的編號(hào)為6、7、8、9、10、11的6個(gè)餾分稀釋后，通過(guò)第二維液相色譜裝置分離，并經(jīng)質(zhì)譜裝置通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)荷比確定每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。第一維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序?yàn)镹NK、NNK、NNN、NNN、NAT、NAB，第二維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序?yàn)镹NN、NNK、NAT、NAB。第一維液相色譜裝置與第二維液相色譜裝置之間還設(shè)有第二維捕集柱。所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：C18柱；流動(dòng)相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動(dòng)相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；梯度洗脫。所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-30min，A相：B相體積比為100：0-0：100。另外，本發(fā)明的多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)在具體測(cè)定時(shí)，如圖6所示，所述第一維液相色譜裝置包括有依次連通的第一維液相色譜泵、進(jìn)樣二位六通閥、第一維色譜柱、紫外檢測(cè)器。如圖6所示，所述進(jìn)樣二位六通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第4接口經(jīng)管線依次連通第5接口、第2接口、第3接口，由第3接口經(jīng)管線連通第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第1接口經(jīng)管線連通第一維液相色譜泵的出樣端，所述第6接口經(jīng)管線連通第一維色譜柱，所述第1接口與第6接口相連通。如圖6所示，所述多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)還包括有連通閥，所述連通閥分別與第一維液相色譜裝置中的紫外檢測(cè)器、第二維液相色譜裝置中的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱相連通。所述連通閥為二位十通閥或二位六通閥。所述二位十通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第8接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經(jīng)管線與紫外檢測(cè)器的出樣端相連通，所述第10接口經(jīng)管線與第二維捕集柱的進(jìn)樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經(jīng)管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經(jīng)管線依次連通第9接口、第8接口、第5接口、第4接口、第二維色譜柱進(jìn)樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經(jīng)管線與質(zhì)譜儀相連通。所述二位六通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經(jīng)管線與紫外檢測(cè)器的出樣端相連通，所述第10接口經(jīng)管線與第二維捕集柱的進(jìn)樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經(jīng)管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經(jīng)管線依次連通第9接口、第4接口、第二維色譜柱進(jìn)樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經(jīng)管線與質(zhì)譜儀相連通。采用多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析時(shí)，將待分析的樣品溶液由進(jìn)樣二位六通閥的第4接口進(jìn)入，樣品溶液依次通過(guò)第5接口、第2接口、第3接口，進(jìn)入第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經(jīng)第1接口、第6接口進(jìn)入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質(zhì)后，通過(guò)紫外檢測(cè)器，進(jìn)入連通閥，通過(guò)二位十通閥的第1接口經(jīng)第10接口進(jìn)入第二維捕集柱，再?gòu)牡诙S捕集柱的出樣端經(jīng)第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第8接口、第5接口、第4接口進(jìn)入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定；或者通過(guò)二位六通閥的第1接口經(jīng)第10接口進(jìn)入第二維捕集柱，再?gòu)牡诙S捕集柱的出樣端經(jīng)第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第4接口進(jìn)入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例21、樣品前處理選取卷煙煙支，點(diǎn)燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣，使煙氣吸附于劍橋?yàn)V片上。將劍橋?yàn)V片置于50mlEP管中加入萃取溶液，置于超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行超聲萃取40min，萃取溶液為50.0ml0.1mol/LNH4Ac水溶液，0.1mol/LNH4Ac水溶液是通過(guò)稱(chēng)取3.85g乙酸銨，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，加水定容得到。萃取后靜置5min，取2ml萃取液置于離心機(jī)上離心5min，離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，然后取1ml上清液經(jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾后，移至色譜分析瓶中，即得待測(cè)樣品溶液。2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別移取10ml濃度為0.5mg/ml的NAB、NAT、NNN、NNK的標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度均為50μg/ml。同時(shí)，分別移取一定體積的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK內(nèi)標(biāo)物，加入甲醇定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為5μg/ml。分別準(zhǔn)確移取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于多個(gè)100mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容，配制為一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0-10ng/ml，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為1ng/ml。3、樣品含量的測(cè)定分別將2配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和1中待測(cè)樣品溶液分別進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，即將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和待測(cè)樣品溶液通過(guò)第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分后，再將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)樣品溶液的稀釋溶液(編號(hào)6、7、8、9、10、11的餾分分別用CH3CN稀釋100倍，每個(gè)餾分均進(jìn)樣10μL)由所述第二維液相色譜裝置進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測(cè)定，比較保留時(shí)間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測(cè)液中4種亞硝胺成分；同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測(cè)液中4種亞硝胺成分的含量。具體來(lái)說(shuō)，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法是先將上述2中一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，分別獲得4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比的線性關(guān)系，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸)，分別計(jì)算得到4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。再將上述1中待測(cè)液進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，將獲得的待測(cè)液中4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比，代入相應(yīng)的4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并根據(jù)加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的已知質(zhì)量濃度，計(jì)算得到待測(cè)液中4種亞硝胺成分的質(zhì)量濃度。其中，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：WatersACQUITYUPLC；色譜柱：WatersSpherisorbS5SCX(4.6*150mm,5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μl；流動(dòng)相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動(dòng)相B相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+0.5mol/LKCl+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；梯度洗脫。如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-5min，A相：B相體積比為100：0-90：10；5-5.1min，A相：B相體積比為90：10-60：40；5.1-15min，A相：B相體積比為60：40-0：100；15-15.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；15.1-40min，A相：B相體積比為100：0-100：0。第一維液相色譜裝置進(jìn)行餾分，如圖1所示，將譜圖中六個(gè)峰分別收取餾分，從左到右依次編號(hào)6、7、8、9、10、11，從而獲得編號(hào)為6、7、8、9、10、11的6個(gè)餾分。再采用中心切割法，將第一維液相色譜分離出的目標(biāo)物餾分的色譜峰的切割完整轉(zhuǎn)移至第二維液相色譜，其它非目標(biāo)物餾分不進(jìn)第二維液相色譜。所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：AgilentTechnologies1260Infinity反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：WatersCortecsC18(2.1*150mm,2.7μm)；柱溫：30℃；流速：0.25mL/min；進(jìn)樣量：10μl；流動(dòng)相A相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；流動(dòng)相B相：5mmol/LNH4Ac+95％CH3CN+5％H2O；梯度洗脫。如表3所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-10min，A相：B相體積比為100：0-100：0；10-20min，A相：B相體積比為100：0-0：100；20-22min，A相：B相體積比為0：100-0：100；22-22.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；22-25min，A相：B相體積比為100：0-100：0。所述質(zhì)譜裝置的條件為：質(zhì)譜：AgilentTechnologies6460TripleQuadMS；電離方式：ESI；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；MRM條件：見(jiàn)表4；清洗進(jìn)樣針程序：needlewash30s；質(zhì)譜流路切換：從10min開(kāi)始掃描，28min結(jié)束。將經(jīng)第一維液相色譜裝置餾分后獲得的編號(hào)為6、7、8、9、10、11的6個(gè)餾分稀釋后，通過(guò)第二維液相色譜裝置分離，并經(jīng)質(zhì)譜裝置通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)荷比確定每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。第一維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序?yàn)镹NK、NNK、NNN、NNN、NAT、NAB，第二維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序?yàn)镹NN、NNK、NAT、NAB。第一維液相色譜裝置與第二維液相色譜裝置之間還設(shè)有第二維捕集柱。所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×10mmi.d.)；流動(dòng)相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動(dòng)相B相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；梯度洗脫。所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?-30min，A相：B相體積比為100：0-0：100。另外，本發(fā)明的多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)在具體測(cè)定時(shí)，如圖6所示，所述第一維液相色譜裝置包括有依次連通的第一維液相色譜泵、進(jìn)樣二位六通閥、第一維色譜柱、紫外檢測(cè)器。如圖6所示，所述進(jìn)樣二位六通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第4接口經(jīng)管線依次連通第5接口、第2接口、第3接口，由第3接口經(jīng)管線連通第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第1接口經(jīng)管線連通第一維液相色譜泵的出樣端，所述第6接口經(jīng)管線連通第一維色譜柱，所述第1接口與第6接口相連通。如圖6所示，所述多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)還包括有連通閥，所述連通閥分別與第一維液相色譜裝置中的紫外檢測(cè)器、第二維液相色譜裝置中的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱相連通。所述連通閥為二位十通閥或二位六通閥。所述二位十通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第8接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經(jīng)管線與紫外檢測(cè)器的出樣端相連通，所述第10接口經(jīng)管線與第二維捕集柱的進(jìn)樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經(jīng)管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經(jīng)管線依次連通第9接口、第8接口、第5接口、第4接口、第二維色譜柱進(jìn)樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經(jīng)管線與質(zhì)譜儀相連通。所述二位六通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經(jīng)管線與紫外檢測(cè)器的出樣端相連通，所述第10接口經(jīng)管線與第二維捕集柱的進(jìn)樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經(jīng)管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進(jìn)樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經(jīng)管線依次連通第9接口、第4接口、第二維色譜柱進(jìn)樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經(jīng)管線與質(zhì)譜儀相連通。采用多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析時(shí)，將待分析的樣品溶液由進(jìn)樣二位六通閥的第4接口進(jìn)入，樣品溶液依次通過(guò)第5接口、第2接口、第3接口，進(jìn)入第一維液相色譜泵的進(jìn)樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經(jīng)第1接口、第6接口進(jìn)入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質(zhì)后，通過(guò)紫外檢測(cè)器，進(jìn)入連通閥，通過(guò)二位十通閥的第1接口經(jīng)第10接口進(jìn)入第二維捕集柱，再?gòu)牡诙S捕集柱的出樣端經(jīng)第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第8接口、第5接口、第4接口進(jìn)入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定；或者通過(guò)二位六通閥的第1接口經(jīng)第10接口進(jìn)入第二維捕集柱，再?gòu)牡诙S捕集柱的出樣端經(jīng)第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第4接口進(jìn)入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例3如上述實(shí)施例2中2所示，分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，采用甲醇定容，配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.5、25、50和100ng/mL的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為10ng/ml。將上述配制好的一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸)，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程及其相關(guān)系數(shù)，如表5、圖2-5所示。由表5、圖2-5可知，回歸方程的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9817～0.9997。對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)，采用最低濃度標(biāo)樣重復(fù)進(jìn)樣10次，進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析，以3倍信噪比為方法的檢出限(LOD)，10倍信噪比為定量限(LOQ)，換算為樣品含量后得出目標(biāo)物的方法檢出限為0.023～0.045ng/ml，定量限為0.076～0.151ng/ml，具有較高的靈敏度。表5工作曲線和檢出限y：離子峰面積比；x：濃度比實(shí)施例4選取已知亞硝胺濃度的卷煙煙氣樣品，加入已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行上述實(shí)施例2中1的前處理，并進(jìn)行多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析，按照樣品與加標(biāo)量＝1：1/2或1：1或1：2，計(jì)算其回收率。同時(shí)對(duì)同一待測(cè)樣品溶液進(jìn)行平行測(cè)定5次(n＝5)，得到4種亞硝胺成分的精密度測(cè)定數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表6。表64種亞硝胺成分的回收率和精密度由表6可以看出，目標(biāo)物的回收率在93.4～106.2％之間，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6％，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于9％，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可以滿足定量需要。實(shí)施例5采用如實(shí)施例2中的本發(fā)明的分析方法測(cè)定常規(guī)卷煙煙氣樣品中4種亞硝胺的含量，具體結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，獲得的TSNAs含量：NNK5.37ng/cig，NAB2.89ng/cig，NAT5.52ng/cig，NNN7.68ng/cig，與經(jīng)典方法樣品的含量水平一致，該方法具有較好的準(zhǔn)確性，可以應(yīng)用于大批量實(shí)際樣品的分析測(cè)定中。其中，樣品的含量(ng/cig)是將本發(fā)明的分析方法測(cè)定的樣品濃度(ng/mL)×20mL/20cig后獲得。表7實(shí)際卷煙煙氣樣品中4種亞硝胺的含量序號(hào)成分名稱(chēng)樣品的含量(ng/cig)1NNK5.372NAB2.893NAT5.524NNN7.68所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3