一種同時拆分煙草特有亞硝胺手性分子的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種煙草特有亞硝胺手性分子的分析方法，屬于煙草分析化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草特有的亞硝胺(TSNAs)是一組有致癌性的物質(zhì)。TSNAs存在于煙葉和煙氣中，主要包括亞硝基去甲基煙堿(NNN)，4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1_ 丁酮(NNK)，Pf-亞硝基假木賊堿(NAB)和N'-亞硝基新煙堿(NAT)。它們主要是煙草的生物堿在收獲后的調(diào)制過程中經(jīng)過亞硝化反應(yīng)形成的(Bush, L.P.et al.(2001) Format1nof tobacco-specific nitrosamines in air-cured tobacc0.Recent Adv.Tob.Sc1.，27，23 - 46.；Djordjevic, Μ.V et al.(1989) Tobacco-specific nitrosamineaccumulat1n and distribut1n in flue-cured tobacco alkaloid isolines.J.Agric.FoodChem.，37，752 - 756.)。一般情況下NNN和NAT的含量較其它兩個含量高，而NNN和NNK在四個煙草特有亞硝胺中的致癌性更高。
[0003]除了 NNK，NNN、NAT和NAB都是手性分子。有研究發(fā)現(xiàn)NNN的兩個手性分子的有害性是不同的(Lao，Y.et al.(2007) Analysis of pyridyloxobutyl DNA adductsin F344 rats chronically treated with (R)- and (S)-N1 -nitrosonornicotine.Chem.Res.Toxicol., 20，246 - 256.;Zhao，L.et al.(2013) Quantitat1n ofpyridyloxobutyl-DNA adducts in tissues of rats treated chronically with (R)-or (S)-N1 -nitrosonornicotine (NNN) in a carcinogenicity study.Chem.Res.Toxicol., 26，1526 - 35.;Balbo，S.et al.(2013) (S)-N' -Nitrosonornicotine,a constituent of smokeless tobacco, is a powerful oral cavity carcinogen inrats.Carcinogenesis, 34，2178 - 2183.;McIntee，E.J.et al.(2000) Metabolismof Nr -nitrosonornicotine enant1mers by cultured rat esophagus and in vivoin rats.Chem.Res.Toxicol., 13，192 - 199.) 0 Balbo 等通過老鼠喂食實驗發(fā)現(xiàn)喝添加⑶-NNN的老鼠得口腔癌的數(shù)量比喝添加⑶-NNN的老鼠高14倍(Balbo，S.et al.(2013) (S)-N' -Nitrosonornicotine, a constituent of smokeless tobacco, is apowerful oral cavity carcinogen in rats.Carcinogenesis, 34，2178 - 2183.) 0 目前還沒有針對NAT和NAB手性分子有害性差異的研究。
[0004]目前報道的拆分NNN的方法有兩個:毛細管電泳(CE) (McCorquodale,E.M.et al.(2003) Enant1meric separat1n of N ! -nitrosonornicotine bycapillary electrophoresis.Anal.Chim.Acta, 496，177 - 184.)和氣相色譜熱能分析儀(GC/TEA) (Carmella, S.G.et al.(2000) Enant1meric composit1n ofNr -nitrosonornicotine and Nr -nitrosoanatabine in tobacc0.Carcinogenesis,21，839 - 43.)。其中毛細管電泳的方法能夠用來拆分NNN標(biāo)樣，但由于檢測限過高作者沒能檢測到樣品中的NNN手性分子。而氣相色譜熱能分析儀方法的過程比較繁瑣，需要首先利用高效液相色譜(HPLC)分離和收集NNN和其它煙草特有亞硝胺，然后利用氣相色譜熱能分析儀分別拆分其手性分子。過于繁瑣的分析過程，特別是高效液相色譜分離這一步，會導(dǎo)致樣品損失影響樣品的檢出限。
[0005]由于現(xiàn)有的拆分這兩種方法都有各自的缺點，限制了這兩種方法的應(yīng)用，新的操作簡便、檢測限低的拆分煙草特有亞硝胺手性分子的分析方法有待進一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:針對現(xiàn)有拆分煙草特有亞硝胺手性分子分析方法的缺陷，提供的一種操作簡便的分析方法，該方法不需要利用高效液相色譜提前分離NNN和其它煙草特有亞硝胺，樣品前處理和分析的總時間減少，樣品在前處理過程中的損失降低，拆分效果優(yōu)于目前報道的毛細管電泳和氣相色譜熱能分析儀分析方法。
[0007]本發(fā)明同時拆分煙草特有亞硝胺手性分子的技術(shù)方案包括以下步驟:
(1)取粉末狀煙葉樣品，然后添加三氯甲烷和10%的氫氧化鈉溶液，振蕩提取；
(2)取上清的三氯甲烷，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用緩沖溶液重溶解，并用濾紙過濾；
(3)過濾后的緩沖溶液用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后重溶解在三氯甲烷中；
(4)將溶解了樣品的三氯甲烷添加到SEP-PAKPlus硅膠固相提取柱，然后依次添加三氯甲烷、三氯甲烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯進行洗脫柱子；
(5)收集乙酸乙酯流出液，蒸干后重溶解在乙腈中，然后利用氣相色譜熱能分析儀分析樣品中的煙草特有亞硝胺的手性組成即可，其中氣相色譜熱能分析儀中分析柱為兩根色譜柱通過連接頭連接在一起，一根為手性色譜柱，另一根為中等極性色譜柱。
[0008]所述緩沖溶液由55 mM的檸檬酸、904 mM的磷酸氫鈉和20 mM的抗壞血酸維生素C混合制得，緩沖溶液的pH值為4.5，目的是通過調(diào)整pH值將需要分析的煙草亞硝胺變?yōu)橛坞x態(tài)，便于下一步的選擇性提取，達到純化的目的。其中抗壞血酸的作用是保障游離態(tài)的煙草亞硝胺不被氧化變質(zhì)。
[0009]所述氣相色譜熱能分析儀的分析條件為:進樣口溫度為225°C ;載氣為氦氣；爐子溫度為60°C保持2min，然后以20°C /min速度升到187°C，然后保持lOmin，然后以0.5°C /min的速度升到203°C，然后以6°C /min的速度升到215°C，并保持10分鐘。
[0010]所述步驟(1)中煙葉樣品為2克，顆粒大小低于830um，三氯甲烷為15ml，氫氧化鈉為0.5ml。
[0011 ] 所述步驟(2 )中緩沖溶液為4ml。
[0012]所述步驟(3)中乙酸乙酯為5ml，三氯甲烷為0.5ml。
[0013]所述步驟(4)中依次添加的三氯甲烷為5ml，三氯甲烷/乙酸乙酯為5ml，乙酸乙酯為10ml ο
[0014]所述步驟(4)中三氯甲烷/乙酸乙酯體積比例為50:50ο
[0015]所述步驟(1)中振蕩提取時