本申請要求于2013年12月5日提交的美國臨時專利申請序列號61/912,275，以及于2014年5月30日提交的美國臨時專利申請序列號62/005,335的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請各自通過引用并入本文。概述本公開內(nèi)容提供了用于就生物標(biāo)記物分析來自受試者的樣品的方法，所述生物標(biāo)記物指示受試者對β-葡聚糖的免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，該方法一般包括從受試者中獲得生物樣品，與參考標(biāo)準(zhǔn)品相比較就生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體分析樣品，計算樣品中的抗β-葡聚糖抗體濃度或關(guān)于抗β-葡聚糖抗體的相對抗體單位（RAU）值，并且如果抗β-葡聚糖抗體濃度或RAU值大于預(yù)定的抗β-葡聚糖抗體濃度或關(guān)于生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體的RAU值，則將受試者鑒定為生物標(biāo)記物陽性的。在其他實施方案中，該方法一般包括從受試者獲得生物樣品，與參考標(biāo)準(zhǔn)相比較就生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體分析樣品，并且如果樣品含有的抗β-葡聚糖抗體的量大于關(guān)于生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體的預(yù)定截斷值（其將生物標(biāo)記物陽性受試者與生物標(biāo)記物陰性受試者分開），則將受試者鑒定為生物標(biāo)記物陽性的。在一些實施方案中，生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體可以是IgG。在這些實施方案的一些中，預(yù)定的RAU值可以是200。在一些實施方案中，生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體可以是IgM。在這些實施方案的一些中，預(yù)定的RAU值可以是300。在一些實施方案中，該方法可以進(jìn)一步包括給鑒定為生物標(biāo)記物陽性的受試者施用包括β-葡聚糖的組合物。在一些實施方案中，該方法可以進(jìn)一步包括給鑒定為生物標(biāo)記物陽性的受試者施用包括抗β-葡聚糖IgG2的組合物。在一些實施方案中，β-葡聚糖衍生自酵母，例如β-1,3/1,6葡聚糖。在某些實施方案中，β-葡聚糖可以包括β（1,6）-[聚（1,3）-D-吡喃葡糖基]-聚β（1,3）-D-吡喃葡萄糖。在一些實施方案中，就生物標(biāo)記物抗β-葡聚糖抗體分析樣品可以涉及使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。本發(fā)明的上述概括并不意圖描述本發(fā)明的每個公開的實施方案或每一種實現(xiàn)。下述說明書更具體地示例了說明性實施方案。在整個申請的幾個地方，通過實施例列表提供了指導(dǎo)，所述實施例可以以各種組合使用。在每種情況下，所述列表僅充當(dāng)代表性組，并且不應(yīng)解釋為詳盡列表。附圖簡述圖1A.對參考血清指定160的任意值（即160相對抗體單位[RAU]/mL）。因此，在校準(zhǔn)曲線上的最高點(diǎn)1:400稀釋度導(dǎo)致400mRAU/mL的值，并且在校準(zhǔn)曲線上的最低點(diǎn)1:51200稀釋度導(dǎo)致3.125mRAU/mL的值。平均RAU/mL=365。圖1B.IgG抗β-葡聚糖抗體濃度工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1C.IgM抗β-葡聚糖抗體濃度工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志愿者的全血摻料有濃度增加的IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）。去除血漿并且對于每個樣品確定RAU值。圖3.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的四個健康志愿者的血液樣品摻料有濃度增加的IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）。全血細(xì)胞用以10μg/mL的IMPRIMEPGG進(jìn)行處理，并且在37℃下溫育30分鐘，并且分析嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。圖4.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志愿者的全血細(xì)胞與IMPRIMEPGG（10mg/ml）和IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）一起培養(yǎng)，并且就IMPRIMEPGG結(jié)合和功能進(jìn)行評估（30分鐘溫育用于補(bǔ)體分析；2小時溫育用于結(jié)合和受體調(diào)節(jié)分析；過夜培養(yǎng)用于細(xì)胞因子分析）。圖5.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志愿者的全血細(xì)胞與IMPRIMEPGG（10mg/ml）和IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）一起培養(yǎng)，并且就IMPRIMEPGG誘導(dǎo)的SC5b-9釋放進(jìn)行評估。圖6.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志愿者的全血細(xì)胞與IMPRIMEPGG（10mg/ml）和IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）一起溫育，并且就IMPRIMEPGG誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞上的CD62L脫落（流式細(xì)胞術(shù)）和IL-8生產(chǎn)（ELISA）進(jìn)行評估。圖7.關(guān)于結(jié)合和功能所需的RAU根據(jù)個體而改變。因此，生物標(biāo)記物截斷的目的是鑒定RAU水平，所述RAU水平排除將不響應(yīng)IMPRIMEPGG的個體，并且富集具有更高的響應(yīng)概率的生物標(biāo)記物陽性受試者。結(jié)合和功能數(shù)據(jù)指示大多數(shù)活性在>IVIG-5組（RAU233-610）中發(fā)生，并且因此關(guān)于IgG截斷的進(jìn)一步分析應(yīng)集中于高于200的RAU范圍。圖8.通過IgGRAU水平標(biāo)繪的IMPRIMEPGG的健康志愿者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。圖9.通過IgGRAU水平標(biāo)繪的IMPRIMEPGG的健康志愿者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。帶圓圈的受試者是具有低IgGRAU的高嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合者，但具有高IgMRAU，因此，可以從IgGRAU分析中去除。圖10.通過IgGRAU水平標(biāo)繪的IMPRIMEPGG的健康志愿者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。在235的IgGRAU截斷將其RAU足以促進(jìn)結(jié)合（生物標(biāo)記物陽性）的志愿者相對于其RAU不足以促進(jìn)結(jié)合（生物標(biāo)記物陰性）的志愿者分離。圖11.通過IgGRAU水平標(biāo)繪的IMPRIMEPGG的健康志愿者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。帶圓圈的個體是IgG生物標(biāo)記物陰性但高IgMRAU的。圖12.通過IgGRAU水平標(biāo)繪的IMPRIMEPGG的健康志愿者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。綠色圓圈中的非藍(lán)色志愿者基于高IgGRAU已經(jīng)是生物標(biāo)記物陽性的，并且因此，可以從IgMRAU分析中去除。圖13.通過IgGRAU水平標(biāo)繪的IMPRIMEPGG的健康志愿者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。在330的IgMRAU截斷將其RAU足以促進(jìn)結(jié)合（生物標(biāo)記物陽性）的志愿者相對于其RAU不足以促進(jìn)結(jié)合（生物標(biāo)記物陰性）的志愿者分離。圖14.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖抗體水平和C4a生產(chǎn)的關(guān)聯(lián)。用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養(yǎng)物中的C4a量在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的倍數(shù)變化而呈現(xiàn)。在X軸呈現(xiàn)了關(guān)于每個組的平均倍數(shù)變化+SEM。具有IgGRAU>235的8/10個體（80%）和具有IgGRAU<235的0/7個體證實對于IMPRIMEPGG>1.5倍的C4a生產(chǎn)，支持高RAU和更大的補(bǔ)體活化之間的顯著關(guān)聯(lián)（**p=0.0069）。圖15.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖抗體水平和C5a生產(chǎn)的關(guān)聯(lián)。用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養(yǎng)物中的C5a量在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的倍數(shù)變化而呈現(xiàn)。在X軸呈現(xiàn)了關(guān)于每個組的平均倍數(shù)變化+SEM。具有IgGRAU>235的10/10個體和具有IgGRAU<235的1/7個體（14%）證實對于IMPRIMEPGG>1.5倍的C5a生產(chǎn)，支持高RAU和更大的補(bǔ)體活化之間的顯著關(guān)聯(lián)（*p=0.0381）。圖16.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖RAU水平和SC5b-9生產(chǎn)的關(guān)聯(lián)。與IMPRIMEPGG（10μg/ml）一起溫育30分鐘的健康個體全血培養(yǎng)物中的SC5b-9量。作為超過檸檬酸鹽對照的倍數(shù)變化而呈現(xiàn)的SC5b-9水平（Y軸）通過IgGRAU狀態(tài)（X軸）分層。具有IgGRAU>235的11/11（即100%）個體相對于具有IgGRAU<235的0/9（即0%）個體證實>2倍的SC5b-9生產(chǎn)，支持高RAU和更大的補(bǔ)體活化之間的顯著關(guān)聯(lián)（**p=0.0082）。圖17.來自健康供體的全血的PMN中的抗β-葡聚糖抗體水平和CR3的表面表達(dá)增加的關(guān)聯(lián)。在用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養(yǎng)物中的CD15+嗜中性粒細(xì)胞上的CR3表面表達(dá)在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的MFI百分比變化而呈現(xiàn)。在X軸呈現(xiàn)了關(guān)于每個組的平均MFI百分比變化+SEM。與具有IgGRAU<235的個體（N=7）相比較，來自具有IgGRAU>235的個體（N=11）的嗜中性粒細(xì)胞證實表面CR3水平中的顯著增加（*p=0.0211）。圖18.來自健康供體的全血的PMN中的抗β-葡聚糖抗體水平和CD88表達(dá)降低的關(guān)聯(lián)。在用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養(yǎng)物中的CD15+嗜中性粒細(xì)胞上的CD88表面表達(dá)在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的MFI百分比變化而呈現(xiàn)。在X軸呈現(xiàn)了關(guān)于每個組的平均MFI百分比變化+SEM。與具有IgGRAU<235的個體（N=8）相比較，來自具有IgGRAU>235的個體（N=13）的嗜中性粒細(xì)胞證實表面CD88水平中的顯著降低（*p=0.0197）。圖19.健康供體全血與IMPRIMEPGG（10μg/ml）一起溫育，并且測定在CD15+嗜中性粒細(xì)胞上的CD62L表面表達(dá)。CD15+CD62Llo細(xì)胞百分比（各個和平均值±SEM）通過X軸上的RAU狀態(tài)分層而存在于Y軸上。來自具有IgGRAU>235的個體的嗜中性粒細(xì)胞證實CD62L表達(dá)的顯著喪失（**p=0.005）。圖20.健康供體全血與IMPRIMEPGG（10μg/ml）一起溫過夜育，隨后測量血漿IL-8水平。作為超過檸檬酸鹽對照的倍數(shù)變化而呈現(xiàn)的IL-8水平（Y軸）通過IgGRAU狀態(tài)（X軸）分層。具有IgGRAU>235的12/13（即92%）個體相對于具有IgGRAU<235的僅3/13（即23%）個體證實對于IMPRIMEPGG>2倍的IL-8生產(chǎn)，支持高RAU和更大的IL-8生產(chǎn)之間的顯著關(guān)聯(lián)（**p=0.0028）。圖21.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖抗體水平和SC5b-9生產(chǎn)的關(guān)聯(lián)。在用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養(yǎng)物中的SC5b-9量在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的倍數(shù)變化而呈現(xiàn)。在X軸呈現(xiàn)了關(guān)于每個組的平均倍數(shù)變化+SEM。與具有IgMRAU<235的個體（N=9）相比較，來自具有IgMRAU>330的個體（N=3）的嗜中性粒細(xì)胞證實SC5b-9生產(chǎn)中的顯著增加（***p=0.0003）。圖22.用考馬斯藍(lán)染色的純化的“黃金參考”IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體的SDS-PAGE（在還原條件下4-20%）。其分子量（MW）以千道爾頓（kDa）表示的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品顯示于泳道3中。圖23.（A）健康受試者的全血中的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)；（B）健康受試者的全血中的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)。圖24.（A）健康受試者的全血中的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)；（B）健康受試者的全血中的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)。圖25.（A）基于高相對于低結(jié)合者狀態(tài)，IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)；（B）基于高相對于低結(jié)合者狀態(tài)，IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)。圖26.（A）基于高相對于低結(jié)合者狀態(tài)，IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)；（B）基于高相對于低結(jié)合者狀態(tài)，IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細(xì)胞結(jié)合的關(guān)聯(lián)。圖27.（A）基于嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的IgGROC曲線分析；（B）基于嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的IgMROC曲線分析。圖28.（A）基于單核細(xì)胞結(jié)合的IgGROC曲線分析；（B）基于單核細(xì)胞結(jié)合的IgMROC曲線分析。圖29.基于高相對于低結(jié)合者狀態(tài)的IgG抗β-葡聚糖抗體亞類嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。圖30.IgG抗β-葡聚糖抗體亞類嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。圖31.靜脈內(nèi)免疫球蛋白的體內(nèi)輸注以增加抗β-葡聚糖抗體用于低結(jié)合者患者的IMPRIMEPGG治療的結(jié)果。（A）IgGRAU；（B）PMN結(jié)合和單核細(xì)胞結(jié)合；（C）C5a增加倍數(shù)。舉例說明性實施方案的詳述β-葡聚糖是衍生自各種微生物和植物來源的葡萄糖聚合物，所述來源包括例如酵母、細(xì)菌、藻類、海藻、蘑菇、燕麥和大麥。當(dāng)然，酵母β-葡聚糖已就其免疫調(diào)節(jié)特性進(jìn)行廣泛評估。酵母β-葡聚糖可以作為各種形式存在，例如完整的酵母、酵母聚糖、純化的全葡聚糖顆粒、溶解的酵母聚糖多糖、或不同分子量的高度純化的可溶性β葡聚糖。在結(jié)構(gòu)上，酵母β-葡聚糖由葡萄糖單體組成，所述葡萄糖單體作為具有經(jīng)由β-（1,6）糖苷鍵與主鏈連接的循環(huán)β-（1,3）吡喃葡萄糖分支的β-（1,3）-連接的吡喃葡萄糖主鏈組構(gòu)。不同形式的酵母β-葡聚糖可以彼此不同起作用。酵母β-葡聚糖通過其發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制可以受不同形式的β-葡聚糖之間的結(jié)構(gòu)差異影響，所述結(jié)構(gòu)差異例如其微?；蚩扇苄再|(zhì)、三級構(gòu)象、主鏈的長度、側(cè)鏈的長度和側(cè)鏈的頻率。酵母β-葡聚糖的免疫刺激功能也依賴于在不同物種中的不同細(xì)胞類型中接合的受體，其再次可以依賴于β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)特性。一般而言，β-葡聚糖免疫療法可以包括給受試者施用任何合適形式的β-葡聚糖或者兩種或更多種形式的β-葡聚糖的任何組合。合適的β-葡聚糖和由其天然來源制備合適的β-葡聚糖在例如美國專利申請公開號US2008/0103112A1中描述。在一些情況下，β-葡聚糖可以衍生自酵母例如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。在某些情況下，β-葡聚糖可以是或衍生自β（1,6）-[聚（1,3）-D-吡喃葡糖基]-聚β（1,3）-D-吡喃葡萄糖，在本文中也稱為PGG（IMPRIMEPGG，Biothera，Eagan，MN），高度純化且充分表征形式的可溶性酵母衍生β-葡聚糖。此外，基于β-葡聚糖的免疫療法可以涉及例如經(jīng)修飾的和/或衍生化的β-葡聚糖例如國際專利申請?zhí)朠CT/US12/36795中描述的那些的使用。在其他情況下，β-葡聚糖免疫療法可以涉及施用例如微粒-可溶性β-葡聚糖或微粒-可溶性β-葡聚糖制劑，其各自在例如美國專利號7,981,447中描述。生物標(biāo)記物研究證實在受試者中在其嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合ImprimePGG的能力中的差異。IMPRIMEPGG與這些細(xì)胞的結(jié)合與受試者對IMPRIMEPGG的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答關(guān)聯(lián)。此外，與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的IMPRIMEPGG結(jié)合涉及特異性水平的天然抗β-葡聚糖抗體的存在。本公開內(nèi)容提供了定量測量患者血清樣品中的抗β-葡聚糖IgG和IgM抗體的簡單ELISA方法。ELISA方法可以用作生物標(biāo)記物測定。用于生物標(biāo)記物測定的截斷水平鑒定健康志愿者的生物標(biāo)記物陽性和生物標(biāo)記物陰性亞組，并且這些截斷點(diǎn)與結(jié)合、功能和臨床結(jié)果關(guān)聯(lián)。評估IMPRIMEPGG與來自健康志愿者的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的早期研究揭示具有不同結(jié)合能力的受試者。IMPRIMEPGG的高嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合（例如與>20%嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的IMPRIMEPGG）在~40%的健康志愿者中發(fā)現(xiàn)。IMPRIMEPGG的單核細(xì)胞結(jié)合與健康志愿者中的嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合潛力平行。在體外，高嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合者和高單核細(xì)胞結(jié)合者產(chǎn)生比低結(jié)合者更多的IL-8。更高的天然抗β-葡聚糖抗體水平與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合對應(yīng)。高結(jié)合者血清/血漿可以增加與來自低結(jié)合者的嗜中性粒細(xì)胞的IMPRIMEPGG結(jié)合。高結(jié)合者血清中的抗β-葡聚糖抗體可以增加在非允許結(jié)合條件下在低結(jié)合者中的嗜中性粒細(xì)胞IMPRIMEPGG結(jié)合。例如，含有高天然抗β-葡聚糖抗體滴度的靜脈內(nèi)免疫球蛋白（IVIG）可以增加與來自低結(jié)合者的嗜中性粒細(xì)胞的IMPRIMEPGG結(jié)合。天然抗β-葡聚糖IgG和/或IgM抗體涉及與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合。不希望受任何特定理論束縛，天然抗β-葡聚糖抗體（例如IgG和IgM）與IMPRIMEPGG結(jié)合。IMPRIMEPGG經(jīng)由補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑受調(diào)理作用。受調(diào)理作用的IMPRIMEPGG與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的CR3受體的凝集素樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合。IMPRIMEPGG的調(diào)理作用（即iC3b沉積）由于在抗體結(jié)合后的補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑而發(fā)生。幾種功能標(biāo)記物在IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞結(jié)合過程期間得到調(diào)節(jié)，例如C4a、C5a和SC5b-9。與全血樣品中的嗜中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的IMPRIMEPGG結(jié)合可以使用測定進(jìn)行重現(xiàn)性測量，例如流式細(xì)胞術(shù)。然而，全血對于此類測定的使用存在某些挑戰(zhàn)。例如，它需要活的健康細(xì)胞，使得血樣需要在收集24小時內(nèi)接受且加工。因此，運(yùn)送條件和環(huán)境因素可以損害血細(xì)胞。此類測定還需要來自已知高結(jié)合者和低結(jié)合者受試者的對照血樣。最后，盡管是概念上簡單的測定，但流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)在許多臨床實驗室中并不常見。因此，基于流式細(xì)胞術(shù)的測定不是用于臨床開發(fā)的實際測定。本公開內(nèi)容提供了涉及測量人血清樣品中的內(nèi)源抗β-葡聚糖抗體水平的簡單定量ELISA的方法。該方法克服了由用于開發(fā)實際臨床測試的基于流式細(xì)胞術(shù)的測定存在的挑戰(zhàn)?；谘宓腅LISA測定是常見的臨床測定，并且可以由大多數(shù)臨床實驗室執(zhí)行。此外，血清樣品可以進(jìn)行冷凍，導(dǎo)致更容易的貯存、運(yùn)送和測定表現(xiàn)中的一致性。在一些實施方案中，β-葡聚糖可以衍生自酵母例如釀酒酵母。在一些實施方案中，β-葡聚糖可以包括β-1,3/1,6葡聚糖，例如β（1,6）-[聚（1,3）-D-吡喃葡糖基]-聚β（1,3）-D-吡喃葡萄糖。在一些實施方案中，與免疫細(xì)胞結(jié)合的β-葡聚糖可以通過使樣品與單克隆抗體接觸進(jìn)行檢測，所述單克隆抗體與β-葡聚糖特異性結(jié)合。單克隆抗體可以是與β-葡聚糖特異性結(jié)合的任何單克隆抗體。如本文使用的，“特異性”及其變化指對于特定靶具有差異或非一般（即非特異性）親和力，至任何程度。特異性結(jié)合β-葡聚糖的示例性單克隆抗體包括例如鑒定為BfDI、BfDII、BfDIII和/或BfDIV（Biothera，Eagan，MN）的單克隆抗體，其各自在美國專利號6,294,321中描述。測量血清中的抗體量的傳統(tǒng)方法通常涉及在將樣品系列稀釋的測定背景下使用ELISA。對ELISA測定實施系列稀釋，并且基于生成陽性測定應(yīng)答的血清樣品的最大稀釋度估計血清樣品中的抗體量。所得到的滴度值是在稀釋范圍內(nèi)的估計值，而不是抗體量的確切測量。系列稀釋方法頻繁用于血清學(xué)中，以確定血清中的抗體量（滴度水平）。確定滴度水平頻繁用于評估對疫苗的抗體應(yīng)答。然而，在系列稀釋方法中，不能直接測量產(chǎn)生的抗體的確切量。相反，僅能夠估計在稀釋范圍內(nèi)產(chǎn)生的抗體量。滴度水平因此不順應(yīng)以直接方式而無需數(shù)據(jù)修飾和/或統(tǒng)計分析技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計分析。相比之下，本公開內(nèi)容提供了基于ELISA的方法，其測量人血清中針對IMPRIMEPGG的天然抗β-葡聚糖抗體。該方法涉及定量測量作為相對抗體單位（RAU）或在統(tǒng)計要求內(nèi)的抗β-葡聚糖抗體濃度的天然抗β-葡聚糖抗體量。這通過在相同測定中生成滴度并且關(guān)聯(lián)RAU數(shù)據(jù)或抗體濃度數(shù)據(jù)（兩者均由校準(zhǔn)曲線確定）來完成。因此，本文描述的方法涉及由具有確定水平的抗β-葡聚糖抗體的血清生成內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，該方法提供了定量測量相對或?qū)嶋H抗β-葡聚糖抗體而不是測量滴度的更佳方法。該方法可以用于測量抗β-葡聚糖IgG和/或抗β-葡聚糖IgM。關(guān)于IgG和/或IgM的RAU計算顯示于表7中。關(guān)于IgG和/或IgM的抗體濃度的計算分別顯示于表8和表9中。該方法提供了測定內(nèi)精確度-即板之間的重現(xiàn)性。該方法還提供了測定間精確度-即測定和/或測定日之間關(guān)于對照和測試血清樣品的重現(xiàn)性。該方法允許通過單個操作者評估在不同測試板上分析的多重樣品。因此，該方法提供了無論是在單日內(nèi)分析多重樣品的單個操作者的手中還是經(jīng)過多日過程多個操作者的手中的可靠、重現(xiàn)性結(jié)果。結(jié)合和功能所需的抗β-葡聚糖抗體水平可以根據(jù)個體而改變。圖2顯示了對于IVIG在抗β-葡聚糖IgGRAU水平中的劑量依賴性增加。該方法涉及使用生物標(biāo)記物截斷來鑒定RAU水平，所述RAU水平排除將不響應(yīng)ImprimePGG的個體，并且富集具有更高的響應(yīng)概率的生物標(biāo)記物陽性受試者。結(jié)合和功能數(shù)據(jù)指示大多數(shù)活性在>IVIG-5組（RAU233-610）中發(fā)生，并且因此關(guān)于IgG截斷的進(jìn)一步分析應(yīng)集中于高于200的RAU范圍（圖7）。執(zhí)行在32個健康志愿者中的初始研究，以確定在嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞中的IMPRIMEPGG結(jié)合和功能必需的天然抗β-葡聚糖抗體的特異性最低水平（IgG和/或IgM的RAU）。定量為IgG和/或IgM的抗β-葡聚糖抗體濃度的最低水平使用健康受試者的更大隊列（n=143）進(jìn)一步優(yōu)化，并且證實就IMPRIMEPGG與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合而言的升高的抗β-葡聚糖抗體水平、IMPRIMEPGG誘導(dǎo)的功能變化和臨床結(jié)果的顯著性。具有有助于IMPRIMEPGG與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合的抗β-葡聚糖抗體水平的受試者視為“生物標(biāo)記物陽性的”。生物測定可以允許鑒定在臨床背景下具有抗β-葡聚糖抗體水平的受試者，所述抗β-葡聚糖抗體水平對于IMPRIMEPGG與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合太低（“生物標(biāo)記物陰性”），使得他們可以接受替代治療或接受抗β-葡聚糖抗體治療，使得他們可以更好地響應(yīng)涉及IMPRIMEPGG的療法?？商娲兀飿?biāo)記物陽性個體可以比生物標(biāo)記物陰性個體更免疫活性，并且因此可以更好地響應(yīng)免疫療法藥物。當(dāng)使用RAU方法時，通過具有至少最低IgGRAU預(yù)定值的IgGRAU和/或具有至少最低IgMRAU預(yù)定值的IgMRAU，個體可以是生物標(biāo)記物陽性的。在一些實施方案中，IgGRAU預(yù)定值可以是至少200，例如至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270或至少275。在一些實施方案中，IgMRAU預(yù)定值可以是至少300，例如至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370或至少375。即，例如至少200的IgGRAU或例如至少300的IgMRAU合理地與個體關(guān)聯(lián)，所述個體顯示出至少5%的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合β-葡聚糖，以及與β-葡聚糖“高結(jié)合者”狀態(tài)相關(guān)的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。例如，圖8顯示了根據(jù)計算的IgGRAU關(guān)于32個健康志愿者各自的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合百分比曲線。在5%嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合處的水平線描繪“高結(jié)合者”與“低結(jié)合者”。為了區(qū)分其IgGRAU太低不能結(jié)合超過5%的嗜中性粒細(xì)胞的那些志愿者與其IgGRAU足以顯示出至少5%的其嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合β-葡聚糖的那些志愿者，我們確定了在235的IgGRAU處的截斷線（圖10），在顯示高于5%的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合β-葡聚糖的最低IgGRAU值（239）下的最接近值。我們隨后估計三個個體的水平，所述個體具有大于5%的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合β-葡聚糖，但是IgG生物標(biāo)記物陰性的（圖9，帶圓圈的）。這三個個體是IgG生物標(biāo)記物陰性的-即小于235的IgGRAU-然而，顯示出至少5%的其嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合β-葡聚糖。當(dāng)嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合根據(jù)IgMRAU進(jìn)行標(biāo)繪時，確定了330的IgMRAU截斷值（圖13）。當(dāng)使用進(jìn)一步優(yōu)化的抗體濃度方法時，通過具有至少最低IgG抗β-葡聚糖抗體濃度預(yù)定值的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度和/或具有至少最低IgM抗β-葡聚糖抗體濃度預(yù)定值的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度，個體可以是生物標(biāo)記物陽性的。來自衍生自相同全血抽取的血清的IMPRIMEPGG結(jié)合和抗β-葡聚糖抗體濃度測量在健康志愿者N=143中進(jìn)行評估。對于N=143個體確定的IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體濃度范圍分別為1.13-209.8μg/ml（7.8-1447.8RAU/ml）和5.3-2032.7μg/ml（12.8-4878.4RAU/ml）。嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均證實分別在大約14μg/ml（100RAU/ml）和42μg/ml（100RAU/ml）IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體水平時更頻繁的大于5%結(jié)合。因此，在一些實施方案中，IgG抗β-葡聚糖抗體濃度預(yù)定值可以是至少14μg/ml（100RAU），例如至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75或至少80μg/ml（100RAU）。在一些實施方案中，IgM抗β-葡聚糖抗體濃度預(yù)定值可以是至少42μg/ml，例如至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300、至少310、至少320、至少330、至少340、至少350、至少360、至少370、至少380、至少390、至少400、至少410、至少420、至少430、至少440、至少450、至少460、至少470、至少480、至少490、至少500、至少510、至少520、至少530、至少540或至少550μg/ml（100RAU）。即，例如至少14μg/ml的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度或例如至少42μg/ml的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度合理地與個體關(guān)聯(lián)，所述個體顯示出至少5%的嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞結(jié)合β-葡聚糖，以及與β-葡聚糖“高結(jié)合者”狀態(tài)相關(guān)的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。圖23和圖24顯示根據(jù)計算的（A）IgG和（B）IgM抗β-葡聚糖抗體濃度，關(guān)于每個健康志愿者的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合百分比曲線。如所示的，與嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的IMPRIMEPGG結(jié)合隨著IgG和/或IgM抗β-葡聚糖抗體濃度增加而增加。如圖25和圖26中所示，在IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體濃度以及在5%結(jié)合水平下的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合兩者之間存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)，區(qū)分高和低IMPRIMEPGG結(jié)合者。在抗β-葡聚糖抗體濃度以及年齡、性別或總免疫球蛋白之間不存在關(guān)聯(lián)（數(shù)據(jù)未示出）。接下來，在143個健康志愿者中研究抗β-葡聚糖抗體的探索性截斷。使用關(guān)于IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合兩者的5%水平，使用ROC曲線分析測定抗β-葡聚糖濃度的靈敏度和特異性之間的關(guān)聯(lián)（圖27和圖28）。在關(guān)于結(jié)合的95%的初始探索性特異性時，確定抗β-葡聚糖抗體濃度截斷，并且用于計算健康群體中的生物標(biāo)記物的流行及其用于確定結(jié)合狀態(tài)的靈敏度。結(jié)果顯示于表1中。表1陽性IgG抗β-葡聚糖生物標(biāo)記物狀態(tài)與使用任一組截斷的體外IMPRIMEPGG生物活性高度關(guān)聯(lián)。然而，如由ROC曲線分析指示的，在不同截斷下的相似靈敏度指示與IMPRIMEPGG的生物活性關(guān)聯(lián)的抗β-葡聚糖抗體濃度范圍。因此，研究各種抗β-葡聚糖抗體濃度截斷，并且功能終點(diǎn)用于確定截斷是否合理地將個體分離成高結(jié)合者和低結(jié)合者（生物標(biāo)記物陽性和生物標(biāo)記物陰性）狀態(tài)。IL-8生產(chǎn)用作功能終點(diǎn)，以探究IgG抗β-葡聚糖抗體濃度截斷范圍。結(jié)果顯示于表2中。表2截斷（RAU/μg/ml）與嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合與單核細(xì)胞結(jié)合IL-8生產(chǎn)近似特異性/靈敏度100/14<0.0001<0.00010.013244.90/92.55125/18<0.0001<0.00010.001959.18/88.30150/22<0.0001<0.00010.000269.39/79.79175/25<0.0001<0.0001<0.000177.55/74.47200/29<0.0001<0.0001<0.000181.63/72.34276/40<0.0001<0.0001<0.000197.96/60.64351/51<0.0001<0.0001<0.0001100/54.26400/60<0.0001<0.0001<0.0001100/48.94425/62<0.0001<0.0001<0.0001100/47.87450/65<0.0001<0.0001<0.0001100/45.74475/69<0.0001<0.0001<0.0001100/42.55500/72<0.0001<0.0001<0.0001100/40.43525/76<0.0001<0.0001<0.0001100/39.36550/80<0.0001<0.00010.0009100/35.11同樣地，C4a/SC5b9生產(chǎn)用作功能終點(diǎn)，以探究IgM抗β-葡聚糖抗體濃度截斷范圍。結(jié)果顯示于表3中。表3截斷（RAU/μg/ml）與嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合與單核細(xì)胞結(jié)合C4a生產(chǎn)近似特異性/靈敏度100/420.0001<0.0001N/A67.35/68.09150/63<0.0001<0.0001N/A77.55/54.26200/83<0.0001<0.00010.133185.71/42.55250/104<0.0001<0.00010.058793.88/30.85300/125<0.0001<0.00010.036395.92/21.28350/146<0.0001<0.00010.086997.96/14.89400/1670.00220.0007N/A97.96/11.7450/1880.00340.0004N/A100/8.51500/2080.00340.0004N/A100/7.44550/2290.00160.0003N/A100/6.38如由數(shù)據(jù)顯而易見的，取決于視為使用ROC曲線分析在臨床試驗中的患者分層或選擇必需的特異性和靈敏度組合，可以選擇特異性IgG抗β-葡聚糖抗體濃度或RAU截斷。例如，基于健康志愿者中的IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合的ROC曲線分析，276RAU/ml或40μg/ml的截斷將具有大約98%的特異性和61%的靈敏度?；诠δ芊治隼绱颂幨褂玫腃4a生產(chǎn)的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度或RAU截斷的合理范圍可以是200-350RAU/ml或83-146μg/ml。如上文，取決于視為在特定臨床試驗中的患者分層或選擇必需的特異性和靈敏度組合，可以選擇特異性IgM抗β-葡聚糖抗體濃度或RAU截斷。例如，基于健康志愿者中的IMPRIMEPGG的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合的ROC曲線分析，250RAU/ml或104μg/ml的截斷將具有大約94%的特異性和31%的靈敏度。作為另外的支持，使用表1中所示的截斷，生物標(biāo)記物狀態(tài)與由IMPRIMEPGG誘導(dǎo)的功能變化關(guān)聯(lián)，包括補(bǔ)體組分C3a、C5a、SC5b9的活化，嗜中性粒細(xì)胞CR1、CR3、CD88和CD62L表面標(biāo)記物表達(dá)的調(diào)節(jié)，以及IL-8誘導(dǎo)。結(jié)果顯示于表4中。表41p值251μg/ml的嗜中性粒細(xì)胞IgG抗β-葡聚糖抗體濃度截斷和118μg/ml的IgM截斷340μg/ml的單核細(xì)胞IgG抗β-葡聚糖抗體濃度截斷和126μg/ml的IgM截斷。生物標(biāo)記物截斷隨后應(yīng)用于兩個臨床試驗中的患者，所述臨床試驗研究包括IMPRIMEPGG的肺癌治療。在第一個隨機(jī)化、2期研究中，對于前4-6個周期，在每個3周治療周期的第1、8和15天時，59個IV期NSCLC患者接受西妥昔單抗、卡鉑和紫杉醇，不連同（對照）或連同IMPRIMEPGG4mg/kg。用單獨(dú)或與IMPRIMEPGG組合的西妥昔單抗的維持治療繼續(xù)直至疾病進(jìn)展時。研究在通過上文健康志愿者數(shù)據(jù)和功能數(shù)據(jù)確定的范圍內(nèi)的各個點(diǎn)處的截斷。結(jié)果顯示于表5中。表5中值總體存活（OS）通過研究者在臨床試驗場所進(jìn)行確定。對于一些患者，生物標(biāo)記物狀態(tài)在治療過程期間改變。因此，生物標(biāo)記物陽性狀態(tài)給予在第一個或第二個周期時測量高于截斷的患者。例如，使用51μg/mlIgG抗β-葡聚糖抗體濃度、118μg/mlIgM抗β-葡聚糖抗體濃度的截斷，25個患者是生物標(biāo)記物陽性的。與生物標(biāo)記物陰性患者的261天相比較，生物標(biāo)記物陽性患者具有429天的中值總體存活。因此，兩個組之間的存活差異是168天，其是顯著差異。在此處給出的例子中，該截斷產(chǎn)生該臨床試驗中的最佳分離。剩余示例截斷產(chǎn)生在兩個組之間較小的中值總體存活差異。然而，在一些情況下，通過降低截斷具有更多患者被治療可能是理想的。并且如上文討論的，使用ROC曲線分析，特異性和靈敏度可根據(jù)需要改變用于定制患者分離。在第二個隨機(jī)化、2期研究中，在與上文研究相似的治療周期中，58個IV期NSCLC患者接受貝伐珠單抗、卡鉑和紫杉醇，不連同（對照）或連同IMPRIMEPGG4mg/kg。用單獨(dú)或與IMPRIMEPGG組合的貝伐珠單抗的維持治療繼續(xù)直至疾病進(jìn)展時。研究在通過上文健康志愿者數(shù)據(jù)和功能數(shù)據(jù)確定的范圍內(nèi)的各個點(diǎn)處的截斷。結(jié)果顯示于表6中。表6對于該臨床試驗，最佳截斷在60μg/mlIgG抗β-葡聚糖抗體濃度和100μg/mlIgM抗β-葡聚糖抗體濃度時出現(xiàn)。如由剩余例子所示，在該截斷任一側(cè)上的截斷快速崩潰，并且不提供實際差異。再次，取決于所需特異性和靈敏度（通過ROC曲線分析計算的），可以選擇適當(dāng)截斷以實現(xiàn)響應(yīng)IMPRIMEPGG治療，而無需補(bǔ)充抗β-葡聚糖抗體的患者的分層?；谏飿?biāo)記物狀態(tài)的患者分離（高結(jié)合者相對于低結(jié)合者）可以使用在上文闡述范圍內(nèi)的截斷來實現(xiàn)。因此，生物標(biāo)記物狀態(tài)可以用作成功的β-葡聚糖免疫療法的預(yù)測物。如上所述，一些患者的生物標(biāo)記物狀態(tài)可以在療法過程期間改變。我們因此評估相對于在任何療法周期后-在C1/C2/C3的任何一個后顯示出生物標(biāo)記物陽性狀態(tài)的患者，關(guān)于在一個療法周期后顯示出生物標(biāo)記物陽性狀態(tài)的患者的截斷值。表7在一個化學(xué)療法周期后顯示出生物標(biāo)記物陽性狀態(tài)的生物標(biāo)記物陽性患者的總體存活例如，使用60μg/mlIgG抗β-葡聚糖抗體濃度、100μg/mlIgM抗β-葡聚糖抗體濃度的截斷來分離生物標(biāo)記物陽性與生物標(biāo)記物陰性患者，接受貝伐珠單抗療法的生物標(biāo)記物陽性患者具有超過使用相同截斷值的生物標(biāo)記物陰性患者多于200天的中值總體存活。類似地，使用45μg/mlIgG抗β-葡聚糖抗體濃度、110μg/mlIgM抗β-葡聚糖抗體濃度的截斷，接受西妥昔單抗療法的生物標(biāo)記物陽性患者具有超過使用相同截斷值的生物標(biāo)記物陰性患者多于130天的中值總體存活。如上文就表5和表6中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)所述，使用ROC曲線分析，根據(jù)定制患者分離的需要，可以選擇關(guān)于所需特異性和靈敏度組合的適當(dāng)截斷值。表8在任何化學(xué)療法周期后顯示出生物標(biāo)記物陽性狀態(tài)的生物標(biāo)記物陽性患者的總體存活此處再次，可以選擇適當(dāng)?shù)腎gG和IgM截斷值，以使生物標(biāo)記物陽性患者的存活達(dá)到最大。例如，使用60μg/mlIgG抗β-葡聚糖抗體濃度、100μg/mlIgM抗β-葡聚糖抗體濃度的截斷，接受貝伐珠單抗療法的生物標(biāo)記物陽性患者具有超過使用相同截斷值的生物標(biāo)記物陰性患者多于150天的中值總體存活。使用45μg/ml或50μg/mlIgG抗β-葡聚糖抗體濃度、以及110μg/ml或120μg/mlIgM抗β-葡聚糖抗體濃度的截斷，接受貝伐珠單抗療法的生物標(biāo)記物陽性患者具有超過使用相同截斷值的生物標(biāo)記物陰性患者多于150天的中值總體存活。然而，在一些臨床情況下，總體存活可能不一定是最有關(guān)的臨床終點(diǎn)。在一些情況下，總體應(yīng)答率（ORR）可能是更有關(guān)的。如本文使用的，“總體應(yīng)答率”指在治療后顯示出癌癥大小和/或增殖中的可測量降低的患者百分比。表9中的數(shù)據(jù)證實IgG和IgM截斷值可以使用ORR作為臨床終點(diǎn)進(jìn)行確定。表9報告了來自上文描述的貝伐珠單抗和西妥昔單抗的合并數(shù)據(jù)，反映作為終點(diǎn)的中值總體存活和總體存活率。表9表9顯示取決于使用總體存活還是總體應(yīng)答率作為用于作出分離的臨床終點(diǎn)，對于分離生物標(biāo)記物陽性與生物標(biāo)記物陰性患者最有效的IgG/IgM截斷值可以有幾分不同。因此，與對于給定生物標(biāo)記物陽性患者的治療最有關(guān)的臨床終點(diǎn)無關(guān)，本文描述的方法可以提供用于鑒定生物標(biāo)記物陽性患者的IgG/IgM截斷值。一旦我們確定生物標(biāo)記物狀態(tài)可以用作成功β-葡聚糖免疫療法的預(yù)測物，我們隨后就察看IgG亞類是否起作用。IMPRIMEPGG是碳水化合物，并且針對碳水化合物抗原的人IgG應(yīng)答主要局限于IgG2亞類。IgG2是弱補(bǔ)體激活物，并且僅在抗原-抗體等價時或當(dāng)抗體過量時活化補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑。IMPRIMEPGG已顯示活化補(bǔ)體（C4a、C5a、SC5b9），但它不引起由于在細(xì)胞表面上的MAC形成的細(xì)胞裂解。另外，IMPRIMEPGG在大多數(shù)供體中顯示出鐘形濃度應(yīng)答曲線。結(jié)合、補(bǔ)體活化和IL-8生產(chǎn)在10或25μg/ml時是最佳的，但在100μg/ml時較低。在一些情況下，這可能是由于在10μg/ml或25μg/ml時抗原-抗體是等價的或抗體是過量的，而在100μg/ml時抗原是過量的。為了理解IgG亞類，因為它們涉及IgG抗β-葡聚糖抗體，使用對于IgG抗β-葡聚糖抗體的每個亞類特異性的二抗執(zhí)行嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。首先，來自高結(jié)合者和低結(jié)合者血清的IgG亞類對于與嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行測試。結(jié)果顯示于圖29中。如由結(jié)果顯而易見的，IgG2亞類顯示出與生物標(biāo)記物狀態(tài)的最佳關(guān)聯(lián)。該發(fā)現(xiàn)在圖30中生成的曲線中加以驗證。來自高結(jié)合者血清的IgG2抗β-葡聚糖抗體的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生比IgG1強(qiáng)得多的關(guān)聯(lián)。因此，在另一個實施方案中，IgG2抗β-葡聚糖抗體可以用作IMPRIMEPGG免疫療法的預(yù)測性生物標(biāo)記物。另外，對于其為低結(jié)合者的患者，IgG2抗β-葡聚糖的施用可以用于改善其對IMPRIMEPGG免疫療法的應(yīng)答。最后，顯示靜脈內(nèi)免疫球蛋白（IVIG）的體內(nèi)輸注增加抗β-葡聚糖抗體水平且改善對IMPRIMEPGG治療的應(yīng)答。經(jīng)歷用于結(jié)腸直腸腺癌的西妥昔單抗和IMPRIMEPGG每周輸注的組合治療的54歲患者具有在治療其血清樣品中測量的低抗β-葡聚糖抗體水平。為了增加患者的抗β-葡聚糖抗體水平，在28天治療周期的第一天時輸注IVIG（1g/kg），在周期7開始且繼續(xù)直到周期12。如圖31A中所示，治療后血清樣品通過ELISA就以RAU/ml表示的IgG抗β-葡聚糖抗體水平進(jìn)行分析。IVIG的添加增加每個周期的第1天樣品中的抗β-葡聚糖抗體濃度，并且隨后在每個周期的剩余周期間下降至基線水平。在圖31B中，通過FACS分析IMPRIMEPGG與PMN和單核細(xì)胞結(jié)合的體內(nèi)結(jié)合，并且通過與劑量前樣品相比較，IMPRIMEPGG劑量后的全血樣品中的IMPRIMEPGG+PMN或單核細(xì)胞增加進(jìn)行計算。結(jié)合隨著測量的抗β-葡聚糖抗體濃度水平而改變，對于在其中患者接受IVIG輸注的當(dāng)天時的PMN和單核細(xì)胞兩者具有最高結(jié)合。在圖31C中，如與劑量前樣品相比較，在IMPRIMEPGG劑量后血清中通過ELISA測量的C5a的增加倍數(shù)測量補(bǔ)體活化。僅在對應(yīng)于IVIG輸注的患者樣品中觀察到C5a水平中的2倍增加。本文描述的方法可以鑒定其最可能獲益于治療方案的個體，所述治療方案包括β-葡聚糖例如IMPRIMEPGG的施用。因此，測定可以允許醫(yī)務(wù)人員更好地定制對個體的治療處理，至少部分基于受試者響應(yīng)包括β-葡聚糖的療法的可能性。測定可以用于篩選用于包括在臨床研究中的個體，以更好地限定各個受試者群體。術(shù)語“和/或”意指所列出元件中的一個或全部或者所列出元件中的任何兩個或更多個的組合；當(dāng)這些術(shù)語在說明書和權(quán)利要求中出現(xiàn)時，術(shù)語“包括”及其變化不具有限制性含義；除非另有說明，否則“一個”、“一種”、“該/所述”和“至少一個/種”可互換使用，并且意指一個/種或多于一個/種；并且通過終點(diǎn)的數(shù)目范圍敘述包括在該范圍內(nèi)的包含的所有數(shù)目（例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。在前述說明書中，為清楚起見，特定實施方案可以單獨(dú)描述。除非另有明確說明特定實施方案的特點(diǎn)與另一個實施方案的特點(diǎn)不相容，否則某些實施方案可以包括與一個或多個實施方案結(jié)合的本文描述的相容性特點(diǎn)的組合。對于包括不連續(xù)步驟的本文公開的任何方法，步驟可以以任何可行次序進(jìn)行。并且，適當(dāng)時，兩個或更多個步驟的任何組合可以同時進(jìn)行。本發(fā)明通過下述實施例進(jìn)行舉例說明。應(yīng)當(dāng)理解特定實施例、材料、量和程序根據(jù)如本文闡述的本發(fā)明的范圍和精神廣泛加以說明。實施例實施例1Costar通用結(jié)合板用在純凈水中以1μg/mL的IMPRIMEPGG（Biothera，Eagan，MN）以每孔50μL進(jìn)行包被，并且在37℃下溫育30分鐘。包被的板隨后在室溫下暴露在>1500μW/cm2的高強(qiáng)度紫外線共5分鐘，并且在室溫下第二次暴露于紫外線五分鐘之前，置于50℃強(qiáng)制通風(fēng)烘箱中直至干燥。板在用牛血清白蛋白（BSA）的0.5%溶液封閉大于30分鐘之后，用洗滌緩沖液（具有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]）洗滌。每個測定運(yùn)行包括兩塊測定板。每塊板包括通過系列稀釋參考人血清制備的校準(zhǔn)曲線。板還包括與參考血清同樣稀釋的四個測試血清樣品。用于校準(zhǔn)曲線和血清樣品的稀釋系列以1:400稀釋度開始，并且以系列1:2稀釋繼續(xù)至1:51,200的最低稀釋度。稀釋在洗滌緩沖液中進(jìn)行。參考血清的1:50稀釋度用作曲線上的最高錨定點(diǎn)。參考和血清樣品的每個稀釋度在兩塊板各自的重復(fù)孔中進(jìn)行評估。樣品在測定板上在室溫下溫育90分鐘，以允許人IgG與板結(jié)合的IMPRIMEPGG結(jié)合。在溫育后，孔用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，并且酶標(biāo)記的二抗（辣根過氧化物酶綴合的親和力純化的山羊抗人IgG、Fcγ特異性抗體）在孔中進(jìn)行溫育，以與IMPRIMEPGG抗原結(jié)合的人IgG結(jié)合。在用洗滌緩沖液洗滌之前，允許二抗溫育90分鐘。在從孔中去除洗滌緩沖液之后，使過氧化物酶底物在孔中進(jìn)行溫育，并且在5分鐘顯色時用~1M磷酸猝滅顯色。使用微量滴定板閱讀器測量在450nm處的光密度，并且計算來自重復(fù)孔的平均值。結(jié)果以兩種方式進(jìn)行計算：1）滴度：滴度測定為其光密度讀數(shù)大于或等于0.1OD的樣品的最大稀釋因子。2）RAU-160的任意值指定至參考血清（160相對抗體單位（RAU/mL）。因此，測定方法中的1:400稀釋度導(dǎo)致400mRAU/mL的值作為校準(zhǔn)曲線上的最高點(diǎn)。稀釋值和相應(yīng)的RAU值在表10中陳述。表10稀釋度平均OD計算的濃度（mRAU/ml）計算的濃度×稀釋度除以1000=RAU/ml4001.577404.68001.493322.225774925816001.369239.338291238332001.031119.938368338464000.71564.3411398411128000.39329.5378022378256000.20414.7377574378512000.1058.0關(guān)于樣品和對照的RAU值用4參數(shù)擬合進(jìn)行計算，使用參考人血清稀釋系列作為校準(zhǔn)曲線。通過由校準(zhǔn)曲線內(nèi)插，隨后校準(zhǔn)稀釋度，來計算對于落入校準(zhǔn)曲線的線性部分內(nèi)的每個樣品稀釋度以mRAU表示的濃度。隨后，由那些回復(fù)計算的多個稀釋度獲得每個樣品的平均濃度。結(jié)果顯示于圖1A中。實施例2IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體“黃金參考標(biāo)準(zhǔn)品”由商購可得的95%純的總IgG和IgM級分進(jìn)行純化，所述總IgG和IgM級分衍生自合并的正常人血漿（AthensResearchandTechnology，Athens，GA）。使IgG和IgM級分經(jīng)過IMPRIMEPGG親和柱，濃縮且使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）就純度進(jìn)行表征。參見圖22。“黃金參考標(biāo)準(zhǔn)品”的系列稀釋通過下文描述的用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法用于生成校準(zhǔn)曲線。用通過針對“黃金參考標(biāo)準(zhǔn)品”校準(zhǔn)測定的抗β-葡聚糖濃度，由合并的正常人血清制備測定工作參考標(biāo)準(zhǔn)品。測定對照由來自所選擇的各個受試者的正常人血清進(jìn)行制備，所述受試者具有接近工作標(biāo)準(zhǔn)曲線上的限定位置的抗β-葡聚糖濃度。Maxisorp平底96孔板（ThrmoFisherScientific，Waltham，MA）用在D-PBS（CorningInc.，Tewksbury，MA）中以3μg/mL的IMPRIMEPGG以每孔100μL進(jìn)行包被。將板覆蓋，置于緊密密封的拉鏈封口塑料袋中，并且在4℃下溫育最少15小時且最多24小時。包被的板隨后取出用于冷藏，抽吸且用洗滌緩沖液（在PBS中的0.05%聚山梨醇酯20（AlfaAesar，WardHill，MA））洗滌三次。在最終抽吸后，每塊包被的板完全包裹在紙巾中，并且在紙巾墊上用力拍打三次，以去除剩余液體。板隨后在工作臺上用250μl/孔的StabilCoatImmunoassayStabilizer（SurModics，Inc.，EdenPrairie，MN）封閉1至3小時。在封閉后，將板抽吸以去除內(nèi)容物且包裹在紙巾中。重復(fù)如上所述的去除剩余液體的拍打程序。將板打開且允許在工作臺上干燥最少45分鐘且最高達(dá)三小時。每個測定包括通過系列稀釋工作參考樣品制備的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。工作參考樣品的稀釋系列顯示于表11和12中。測定還包括1:20、1:400和1:1600稀釋的對照和測試樣品。稀釋在洗滌緩沖液中進(jìn)行。參考和血清樣品的每個稀釋度一式三份進(jìn)行評估。樣品在測定板上在室溫下溫育45分鐘在設(shè)為310rpm的軌道直徑2mm的定軌振蕩器上進(jìn)行溫育，以允許人IgG和/或IgM與板結(jié)合的IMPRIMEPGG結(jié)合。在溫育后，孔用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌，并且酶標(biāo)記的二級抗體（辣根過氧化物酶綴合的親和力純化的山羊抗人IgG或IgM、Fcγ特異性抗體）在孔中進(jìn)行溫育，以與IMPRIMEPGG抗原結(jié)合的人IgG或IgM結(jié)合。在用洗滌緩沖液洗滌之前，允許二級抗體溫育45分鐘。在從孔中去除洗滌緩沖液之后，使過氧化物酶底物在孔中進(jìn)行溫育，并且在五分鐘顯色時用~1M磷酸猝滅顯色。使用微量滴定板閱讀器測量在450nm處的光密度，并且計算來自重復(fù)孔的平均值。通過針對由工作參考樣品稀釋生成的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)樣品吸光度，來確定IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體濃度（μg/ml）。關(guān)于校準(zhǔn)曲線的稀釋度值和相應(yīng)的濃度在表11和12中陳述。表11.用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的IgG稀釋度稀釋度平均OD平均計算的濃度（ng/ml）1:102.85942073.31:1002.626191.01:4002.21458.21:8001.77329.11:16001.16113.71:32000.6747.11:128000.2022.0表12.用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的IgM稀釋度稀釋度平均OD平均計算的濃度（ng/ml）1:6.262.64211176.31:50.082.1331354.71:100.171.706664.41:200.331.227338.51:801.380.45483.71:3204.760.15820.81:128190.0795.2衍生自表11和12的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別顯示于圖1B和1C中。一旦通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定測試樣品的抗體濃度，濃度就可以通過將平均計算的濃度乘以稀釋因子并且隨后除以1000而轉(zhuǎn)換為μg/ml。實施例3在含有肝素的管（BDVacutainersodiumheparintubes，BectonDickinson，F(xiàn)ranklinLake，NJ）中收集來自健康志愿者的全血（WB）。在研究中使用的IVIG是Privigen，以100mg/mL的人多價人免疫球蛋白的10%溶液（CSLBehring，KingofPrussia，PA）。樣品摻料有在PBS中至2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL的最終濃度的IVIG稀釋物，連同僅PBS對照。隨后制備IVIG摻料血液的等分試樣用于IgGRAU測定、以及補(bǔ)體途徑活化的IMPRIMEPGG誘導(dǎo)、嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合（下文實施例4中所述）、活化標(biāo)記物表達(dá)和IL-8生產(chǎn)測定。IVIG摻料的WB的等分試樣在37℃下與以10μg/mL的IMPRIMEPGG、或作為對照的等體積的檸檬酸鹽緩沖液（11mMNaCitrate，140mMNaCL，pH6.3）一起溫育30分鐘。在溫育后，在加入5μLBfDIV小鼠抗β-葡聚糖IgM抗體/100μLWB，并且在室溫下溫育15分鐘之前，將細(xì)胞用PBS洗滌兩次。樣品隨后再次用PBS洗滌兩次，并且用含有用于表面標(biāo)記物的抗體以及用于檢測BfDIV結(jié)合的抗小鼠IgM的抗體混合物染色。使細(xì)胞在室溫下溫育30分鐘，隨后加入2mLFACS/Lyse（eBiosciences，SanDiego，CA），并且在室溫下溫育15分鐘。細(xì)胞用PBS洗滌兩次，之后用1%多聚甲醛固定且在LSRII流式細(xì)胞儀上分析。FACS數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖2-7中。實施例4在WB中的IMPRIMEPGG結(jié)合和細(xì)胞表面上的葡聚糖結(jié)合的檢測基本上如上文實施例2中所述執(zhí)行。結(jié)果顯示于圖8-13、23-30、31A和31B中。實施例5如實施例3中所述，在含有肝素的管中收集來自健康志愿者的全血（WB）。將管充分混合且貯存于冰上，直至準(zhǔn)備使用時。WB的等分試樣與以10μg/mL或100μg/mL最終濃度的IMPRIMEPGG、或者與等體積的PBS或檸檬酸鹽緩沖液一起溫育。以10μg/mL的完整葡聚糖顆粒（WGP）用作陽性對照。經(jīng)處理的WB在37℃下在加濕5%CO2溫箱中溫育30分鐘或120分鐘。在每個時間點(diǎn)結(jié)束時立即將WB在4℃下以2000xrpm（或1150xg）離心10分鐘。收集上清液（血漿），并且轉(zhuǎn)移至1.5mLeppendorf管且保持在冰上。血漿如下述部分中所述在補(bǔ)體調(diào)節(jié)研究的相同日使用，或在-70℃下冷凍直至準(zhǔn)備使用時。補(bǔ)體C4a調(diào)節(jié)研究。MicroVueC4aEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）根據(jù)廠商說明書用于血漿中的C4a定量。簡言之，將標(biāo)準(zhǔn)品、對照和1:20稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿制劑）加入用特異性抗C4a單克隆抗體預(yù)包被的微量測定孔中。在室溫下溫育60分鐘后，將板洗滌一個洗滌循環(huán)。將辣根過氧化物酶（HRP）綴合的鼠抗人C4a單克隆抗體加入每個測試孔中，并且在室溫下溫育另外60分鐘。在溫育后，在加入生色酶底物TMB以起始酶促反應(yīng)之前，將板洗滌一個洗滌循環(huán)。使板在室溫下溫育60分鐘，并且隨后用所提供的終止溶液猝滅酶反應(yīng)。顏色強(qiáng)度在450nm處進(jìn)行分光光度法測量。由用所提供的標(biāo)準(zhǔn)品生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測試樣本中存在的C4a濃度，并且使用4參數(shù)回歸分析進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖14中。補(bǔ)體C5a調(diào)節(jié)研究。MicroVueC5aEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）根據(jù)廠商說明書用于血漿中的C5a定量。簡言之，將標(biāo)準(zhǔn)品、對照和1:60稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿制劑）加入用特異性抗C5a單克隆抗體預(yù)包被的微量測定孔中。在室溫下溫育60分鐘后，將板洗滌一個洗滌循環(huán)。將辣根過氧化物酶（HRP）綴合的鼠抗人C5a單克隆抗體加入每個測試孔中，并且在室溫下溫育另外60分鐘。在溫育后，在加入生色酶底物TMB以起始酶促反應(yīng)之前，將板洗滌一個洗滌循環(huán)。使板在室溫下溫育60分鐘，并且隨后用所提供的終止溶液猝滅酶反應(yīng)。顏色強(qiáng)度在450nm處進(jìn)行分光光度法測量。由用所提供的標(biāo)準(zhǔn)品生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測試樣本中存在的C5a濃度，并且使用4參數(shù)回歸分析進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖15和圖31C中。補(bǔ)體Sc5b-9調(diào)節(jié)研究。MicroVueSc5b-9PlusEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）根據(jù)廠商說明書用于測量血漿樣本中存在的Sc5b-9復(fù)合物的量。簡言之，將標(biāo)準(zhǔn)品、對照和1:20稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿制劑）加入用特異性抗Sc5b-9單克隆抗體預(yù)包被的微量測定孔中。使板在室溫下溫育60分鐘，隨后為五次洗滌。隨后使板在室溫下與所提供的SC5b-9PlusConjugate一起溫育30分鐘，所述SC5b-9PlusConjugate含有對于SC5b-9特異性的辣根過氧化物酶綴合的鼠抗人Ab。隨后將板洗滌五次，在室溫下與生色酶底物TMB一起溫育60分鐘，以起始酶促反應(yīng)，并且隨后用終止溶液猝滅。測量OD450。使用線性回歸分析由所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果。結(jié)果顯示于圖16中。細(xì)胞表面補(bǔ)體受體的調(diào)節(jié)。IMPRIMEPGG與WB的結(jié)合以10μg/mL和100μg/mL以及在30分鐘和120分鐘時進(jìn)行研究。在結(jié)合后，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并且隨后在室溫下與CD88-APC、CD35-PE和CD11b-PB（BioLegend）一起溫育30分鐘。通過在室溫下與2mLFACS/Lyse（eBiosciences，SanDiego，CA）一起溫育15分鐘來裂解RBC。細(xì)胞用PBS洗滌兩次，用1%多聚甲醛固定且在LSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。FACS數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖17和圖18中。實施例6IMPRIMEPGG與WB的結(jié)合以10μg/mL和100μg/mL以及在30分鐘和120分鐘時進(jìn)行研究。在結(jié)合后，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并且隨后在室溫下與CD62L-PB（BioLegend）一起溫育30分鐘。通過在室溫下與2mLFACS/Lyse（eBiosciences，SanDiego，CA）一起溫育15分鐘來裂解RBC。細(xì)胞用PBS洗滌兩次，用1%多聚甲醛固定且在LSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。FACS數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖19中。實施例7如實施例3中所述，在含有肝素的管中收集來自健康志愿者的全血（WB）。WB的等分試樣與以10μg/mL或100μg/mL最終濃度的IMPRIMEPGG一起溫育，或者用作為基線對照的PBS或檸檬酸鹽緩沖液、或者作為陽性對照的100ng/mLTLR4激動劑LPS（大腸桿菌（E.coli）菌株0127:B8，Sigma，St.Louis，MO）進(jìn)行處理。培養(yǎng)物在37℃下在加濕5%CO2溫箱中進(jìn)行溫育。在20-24小時后，將WB以1600xrpm離心10分鐘，并且收集血漿上清液。將樣品貯存于-80℃下的96孔Matrix貯存板（MatrixTechnologies，Hudson，NH）中，直至準(zhǔn)備使用時。通過根據(jù)制造商的說明書執(zhí)行HumanCXCL8/IL-8ELISA（R&DSystems，Catalog#D8000C，Minneapolis，MN），來確定IMPRIMEPGG或?qū)φ仗幚淼腤B的血漿樣品中IL-8的存在。結(jié)果顯示于圖20中。實施例8Sc5b-9調(diào)節(jié)研究。根據(jù)廠商說明書使用MicroVueSc5b-9PlusEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）測量血漿樣本中存在的Sc5b-9復(fù)合物的量。簡言之，將標(biāo)準(zhǔn)品、對照和1:20稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿制劑）加入用特異性抗Sc5b-9單克隆抗體預(yù)包被的微量測定孔中。使板在室溫下溫育60分鐘，隨后為五次洗滌。隨后使板在室溫下與所提供的SC5b-9PlusConjugate一起溫育30分鐘，所述SC5b-9PlusConjugate含有對于SC5b-9特異性的辣根過氧化物酶綴合的鼠抗人Ab。隨后將板洗滌五次，在室溫下與生色酶底物TMB一起溫育60分鐘，以起始酶促反應(yīng)，并且隨后用終止溶液猝滅。測量OD450。使用線性回歸分析由所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果。結(jié)果顯示于圖21中。實施例9使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示于圖27和28中。本文引用的所有專利、專利申請和出版物，和可電子獲得的材料（包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及來自GenBank和RefSeq中的注釋編碼區(qū)的翻譯）的完全公開內(nèi)容以其整體通過引入本文。在本申請的公開內(nèi)容和引入本文作為參考的任何文件的公開內(nèi)容之間存在任何不一致的情況下，以本申請的公開內(nèi)容為準(zhǔn)。前述詳述和實施例僅為了清楚理解而給出。由其不應(yīng)理解不必要的限制。本發(fā)明并不限于所示和所述的確切細(xì)節(jié)，因為對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化將包括在由權(quán)利要求限定的本發(fā)明內(nèi)。除非另有說明，否則表示說明書和權(quán)利要求中使用的組分?jǐn)?shù)量、分子量等等的所有數(shù)目均應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語“約”進(jìn)行修飾。相應(yīng)地，除非另有相反說明，否則在說明書和權(quán)利要求中闡述的數(shù)目產(chǎn)生是近似值，其可以根據(jù)尋求通過本發(fā)明獲得的所需特性而改變。最低限度以及并非作為限制權(quán)利要求范圍的等價原則的嘗試，每個數(shù)目參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)所報告的有效數(shù)字且通過應(yīng)用普通四舍五入技術(shù)加以解釋。雖然闡述本發(fā)明的廣泛范圍的數(shù)目范圍和參數(shù)是近似值，但具體實施例中闡述的數(shù)值盡可能精確地報告。然而，所有數(shù)值固有地含有必然起因于在其各自的測試測量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)差范圍。所有標(biāo)題均為了讀者方便，并且不應(yīng)用于限制標(biāo)題下的正文的含義，除非如此指明。當(dāng)前第1頁1 2 3