專利名稱：：β-葡聚糖和甘露聚糖的制備的制作方法卩-葡聚糖和甘露聚糖的制備交叉引用的相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2005年5月5日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/677,973的優(yōu)先權(quán)，通過引用將該申請(qǐng)的主題全文并入本文。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及卩-葡聚糖/甘露聚糖制備物及其制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及由微生物產(chǎn)生的制備物，包括(3-(1，3/1，6)葡聚糖及甘露聚糖，所述微生物包括但不限于酵母。"葡聚糖"是指主要或全部由D-葡萄糖構(gòu)成的寡糖或多糖的通稱。葡聚糖廣泛地分布在自然界中，對(duì)于維持細(xì)菌、酵母及植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性尤其重要。舉例來說，葡聚糖與其它多糖(例如甘露聚糖和幾丁質(zhì))，共同決定著細(xì)胞壁的外形和機(jī)械強(qiáng)度。在這些細(xì)胞中葡聚糖通常占細(xì)胞壁重量的大約40%到50%。作為D-葡萄糖的聚合物，D-葡萄糖單元可以通過各種方式連接在一起。例如，具有(1'3)、(1,4)、(1，6)和(1,2)鍵(糖苷鍵)的葡聚糖都是已知的?？赡艿逆I的多樣化意味著葡聚糖通常是多支鏈化合物。在這種高度可變的方式下單個(gè)葡萄糖單體以及母體分子的所有立體形狀都可以相連，結(jié)果是許多形式都是可能的。一種常見的葡聚糖是|3-(1,3)-鍵連的吡喃葡萄糖(通常稱為(3-葡聚糖)。一些物種的細(xì)胞壁包含與P-(l,6)鍵連的吡喃葡萄糖偶聯(lián)的卩-(l，3)-鍵連的吡喃葡萄糖。例如，釀酒酵母(5^cc/wraowycesc^ev^'ae)的細(xì)胞壁主要是由P-鍵連的葡聚糖組成的，其主要是(3-(l-3)-鍵連的葡萄糖單元構(gòu)成的主鏈，而分子間和分子內(nèi)的少量成分是通過卩-(l-6)-鍵形成支鏈。葡聚糖由于其化學(xué)特性而在化學(xué)、食品和制藥工業(yè)中具有多種用途。例如，它們可以用作增稠劑(viscosityimpartingagent)、乳化劑、纖維、膜、涂料、親合層析法和凝膠電泳的支持物，可用于細(xì)胞培養(yǎng)基，用作濾板，和用于粘固劑。其還廣泛地用作食品增稠劑和食用纖維的來源以及藥品中的載體以及涂層劑。已經(jīng)表明在人和動(dòng)物體內(nèi)葡聚糖具有免疫藥理學(xué)活性。例如，已經(jīng)顯示在蝦、魚、家禽、豬、牛、兔、小鼠、大鼠和人中對(duì)致病微生物具有強(qiáng)烈的免疫刺激和保護(hù)作用。通過與Toll-樣受體Dectin-l相互作用，酵母P-葡聚糖可以刺激脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的先天性(非特異性)免疫應(yīng)答。這種結(jié)合刺激了巨噬細(xì)胞中活性氧種類的產(chǎn)生，增強(qiáng)它們的吞噬作用并殺死微生物。這些被刺激的免疫細(xì)胞還產(chǎn)生細(xì)胞因子(cytokin)，其能循環(huán)到動(dòng)物全身并與其它免疫細(xì)胞相互作用以增強(qiáng)該動(dòng)物的免疫狀況。來自酵母及其他生物體的|3-葡聚糖的純化已被廣泛地研究，并且已知有多種方法。這些方法中大部分基于P-(l-3)-葡聚糖在堿或有機(jī)溶劑中的不可溶性。主要的已知方法是(a)用濃氫氧化鈉高溫提取，然后用酸高溫提取并用乙醇沉淀(參見，例如，Manners,D.J.等人，Biochem.J.13519-30(1973)，Jamas，S.等人，美國(guó)專利號(hào)4,810,646、5,028,703以及5,250,436)。這些方法中有許多需要預(yù)先勻漿化酵母細(xì)胞，還有許多需要多次重復(fù)各提取步驟；(b)用濃苯酚水(1:1)提取由酵母自溶作用或酶降解而產(chǎn)生的酵母細(xì)胞壁制備物(參見，例如，TruscheitE.等人的美國(guó)專利號(hào)4,138,479);以及(c)單獨(dú)用或者在存在堿的情況下用有機(jī)溶劑(例如異丙醇、乙醇、丙酮或甲醇)提取(參見，例如歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?15216)。已知酸處理降低了葡聚糖材料中P-(l-6)-鍵的數(shù)目，從而增加了粘度。甘露聚糖是一種由甘露糖單元組成的聚合物。在酵母中，甘露聚糖既與酵母細(xì)胞壁的外表面中的蛋白質(zhì)相結(jié)合，作為muscigenous多糖，又與內(nèi)細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)相結(jié)合。通常其占細(xì)胞壁干重的大約20-50%。甘露聚糖與核心-肽鏈相連為寡聚物或聚合物。該復(fù)合物包含大約5-50%的蛋白質(zhì)。寡聚甘露聚糖直接結(jié)合到絲氨酸和蘇氨酸上，而聚合的甘露聚糖則通過N-乙酰葡糖胺結(jié)合到天冬酰胺上。在這種甘露糖一蛋白質(zhì)復(fù)合物中，甘露糖單元是通過a-l,6、a-l,2和a-l,3-鍵相連的。甘露聚糖-寡聚糖(MOS)能通過蛋白水解作用從酵母細(xì)胞壁中釋放出來。釋放出的MOS能有效地與腸道的細(xì)菌性病原體結(jié)合并妨礙其在腸道建群(colonize)的能力。例如，大腸桿菌(五.co//)、沙門氏菌(^/附o"e〃a^p.)和霍亂弧菌(F/6n'oc/w/era)在其表面具有特異性地結(jié)合到這種MOS甘露糖糖殘基上的蛋白質(zhì)(凝集素)?？紤]到葡聚糖的許多用途和應(yīng)用，在本領(lǐng)域內(nèi)顯然需要有一種避免利用高濃度堿或酸和高溫的提取P-葡聚糖/甘露聚糖的方法，這樣才能提高葡聚糖和甘露聚糖的回收率，得到生物學(xué)有用的制備物。圖1是本發(fā)明生產(chǎn)P-葡聚糖/甘露聚糖制備物的方法的一種實(shí)施方式的流程圖。圖2是本發(fā)明生產(chǎn)(3-葡聚糖/甘露聚糖制備物的方法的另一實(shí)施方式的流程圖。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供一種處理酵母細(xì)胞的方法，其使用以下步驟使酵母細(xì)胞自溶以釋放酵母細(xì)胞壁，用外源的蛋白酶溫育該酵母細(xì)胞壁，將該酵母細(xì)胞壁分離成富含葡聚糖的組分和富含甘露聚糖的組分，并超濾富含甘露聚糖的組分，形成濾液和滲余物。另一方面，本發(fā)明提供一種處理酵母細(xì)胞的方法，其使用以下步驟使酵母細(xì)胞在40°C到65°C溫度下自溶以釋放酵母細(xì)胞壁，在pH9到10用外源的蛋白酶溫育該酵母細(xì)胞壁，并用酶(例如淀粉酶、脂肪酶或其組合)溫育所述經(jīng)蛋白酶處理過的細(xì)胞壁。另一方面，本發(fā)明提供一種包含(x-甘露聚糖的組合物，其中至少85%(w/w)的總a-甘露聚糖具有10,000Da或更高的分子量。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括那些包含本發(fā)明方法制備的葡聚糖或甘露聚糖的動(dòng)物飼料、食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品以及營(yíng)養(yǎng)輔助品(neutraceutical)。發(fā)明簡(jiǎn)述在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種方法,其產(chǎn)生富含P(l,3)和p-(1，6)葡聚糖的不溶性細(xì)胞壁制備物以及富含甘露聚糖的可溶性部分。本發(fā)明的方法包括細(xì)胞壁來源(例如酵母，諸如啤酒酵母或面包酵母)的自溶步驟，繼之以酶消化步驟。在一個(gè)方面，酶消化是使用一種高pH蛋白酶進(jìn)行。在另一方面，酶消化是使用酶(例如，高pH蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或脂肪酶)的組合進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，酶消化是使用一種高pH蛋白酶繼之以一種或多種其它酶(例如，淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或脂肪酶)進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種富含(3-(l,3)和p-(l，6)葡聚糖的細(xì)胞壁制備物，而在另一實(shí)施方式中，提供一種富含甘露聚糖的可溶組分。結(jié)合詳細(xì)的說明和附圖，本發(fā)明的其它方面將變得清楚。發(fā)明詳述在詳細(xì)解釋本發(fā)明的任何實(shí)施方式之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非將其應(yīng)用僅限制在下面說明書中列出或在附圖中所呈現(xiàn)的組分的細(xì)節(jié)或組分的排列。本發(fā)明能夠具備其它實(shí)施方式，并可以通過多種方式實(shí)施或進(jìn)行。此外，還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用措詞和術(shù)語是用于說明目的，而不應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)于本發(fā)明的限制。本文中所用的"包括"、"包含"或"具有"及其變體意在包括其后所列的各項(xiàng)和其等同物以及補(bǔ)充項(xiàng)。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的任何數(shù)值范圍包括從下限值到上限值的所有數(shù)值。例如，如果一種濃度范圍陳述為1%到50%，其意指諸如2%到40%、10%到30%、或1%到3%等等的數(shù)值都已在該說明書中清楚地列舉。這些僅僅是具體地意指的實(shí)例，列舉的最低值和最高值之間的所有可能數(shù)值組合都被認(rèn)為是在本申請(qǐng)中清楚地陳述了的。除非另有陳述，說明書和權(quán)利要求所用的表達(dá)組分?jǐn)?shù)量、反應(yīng)條件等等的所有數(shù)字在一切情況下應(yīng)被理解為被術(shù)語"約"修飾。因此，除非標(biāo)明與此相反，在下面說明書和所附權(quán)利要求中所述的數(shù)字參數(shù)均為近似值，可依據(jù)本發(fā)明設(shè)法獲得的期望特性而變化。最低限度，而不是試圖將等同物的教條應(yīng)用限制于權(quán)利要求的范圍，各數(shù)字參數(shù)應(yīng)該至少是按照?qǐng)?bào)道的有效數(shù)字的數(shù)字，并通過應(yīng)用普通四舍五入的方法(mimdingtechniques)來解釋。盡管闡明本發(fā)明寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)都是近似值，在特定實(shí)施例中所列的數(shù)值是盡可能精確的記錄。但是，任何數(shù)值都自然地包含某些不可避免的誤差，這些誤差來自在其各自試驗(yàn)測(cè)定中得到的標(biāo)準(zhǔn)差。P-葡聚糖/甘露聚糖制備物可，在微酸性的/接近中性的pH以及僅在適度升高的溫度下使用簡(jiǎn)單的自溶方法從微生物(例如酵母)制備。自溶后是酶消化。在一個(gè)實(shí)施方式中，該酶促步驟使用通常約0.05%-1wt。/。的高pH蛋白酶(例如，獲自GenencoreInternational的Protex6L或由發(fā)酵地衣芽孢桿菌(Ba"7/w//c/^"/orm&)獲得)，在堿性pH和升高的溫度下進(jìn)行。作為P-葡聚糖/甘露聚糖來源的適用酵母種包括，但不限于，釀酒酵母(5bcc/^ram_yc&sce"v&/ae)(包括面包酵母菌株以及啤酒酵母菌株)、脆壁克魯維氏酵母(尺/M"eramj;c"的酵母菌株和假絲酵母屬(Om^^)菌株(例如產(chǎn)朊假絲酵母(Ca"^fe^7&))及其組合。其它的|3-葡聚糖/甘露聚糖適宜來源的酵母菌株包括，但不限于，戴耳克氏糖酵母(5"acc/z"ra，ces^2/6ra^7V)、羅茜糖酵母(&cc/7"TO附y(tǒng)cesray")、iSacc/zflram少ces附/crae〃zj;jofifey、卡爾斯伯糖酵母(5i3cc/zarcw^casca廠/Aergem^)、粟酒裂殖糖酵母(5"c/7/zc^acc/wraw少ces/xw76e)、孚L克魯維氏酵母(ii:/w_yveraw_yces/acto)、多孢克魯維氏酵母(X7w"eromyc"po/"poms)、白色假絲酵母(C朋^/afl/6/c"""、陰溝假絲酵母(Cfl"&Wflc/oacae)、熱帶假絲酵母(Ow^^^;/cato)、季也蒙氏假絲酵母(CaraWagwz7/z'ermow必)、溫奇氏漢遜氏酵母(//imseww/awz,wge/)、//arae鹿/aarm'、亨利氏漢遜氏酵母(//a"""w/a/ze"n'"7)、美洲漢遜氏酵母(T/arae"w/a^meWc"加)及其組合。這些酵母菌株可通過分批發(fā)酵或者連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)在食品等級(jí)營(yíng)養(yǎng)物中的培養(yǎng)物中進(jìn)行制備。許多其它種的微生物，包括但不限于，細(xì)菌、真菌及植物(例如單細(xì)胞藻類)，已在本領(lǐng)域被報(bào)道作為一種卩-葡聚糖/甘露聚糖的來源?？捎糜诒景l(fā)明作為|3-葡聚糖和/或甘露聚糖來源的其它微生物包括但不限于細(xì)菌，例如產(chǎn)堿菌屬(J/fe^ge"")，特別是糞產(chǎn)堿菌混合基因變種(/aecafeVar.mixogenes)(ATCC-21680)，土壤桿菌屬。groZ^c^7'ww)，纖維單胞菌屬(Ce〃w/omowos)，例如ATCC21399及產(chǎn)黃纖維單胞菌(Ce〃w/owo"w/7avZge"a)(ATCC53703)，和盤多毛孢屬(尸asto/of/fl);真菌，例如短柄霉屬(Jweo6awWMm)，如出芽短柄霉"weo6os/^m;w〃w/ara)菌株IF0446及短柄霉屬K-l種(FERMP1289)，蘑薛屬(爿gan'ciw)，香燕屬(丄ewf/mw)，平燕(尸/ewofwsoj/reaft^s)，Macra;/wmo;w&，如菌株KOB55;靈芝屬(Gawoafem2a)，裂褶菌屬(5fc始o(jì)//^〃a)，F(xiàn)ac/^ma/zoe/ew，尸e加Ma，革蓋菌屬(Co/7'o/w)，及其組合。非微生物，如植物，也可用于本發(fā)明作為p-葡聚糖和/或甘露聚糖的來源。具體地，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生富含(l，3)-和|3-(1，6)-葡聚糖內(nèi)容物和甘露聚糖內(nèi)容物的細(xì)胞壁制備物的生產(chǎn)，由包括但不限于酵母的微生物產(chǎn)生。在一個(gè)示范性的實(shí)施方式中，該方法包括第一步酵母(例如啤酒酵母)的自溶，(通常7%到18%，優(yōu)選10%到17%，更優(yōu)選8%到12%或13%到16%的固態(tài)漿料)。自溶可適當(dāng)?shù)卦谥辽賞H4、優(yōu)選至少pH4.5、更優(yōu)選至少pH5時(shí)迸行。自溶可適當(dāng)?shù)卦诘陀趐H8、優(yōu)選低于pH7、更優(yōu)選低于pH6時(shí)進(jìn)行。進(jìn)行自溶的溫度可適當(dāng)?shù)貫橹辽?0。C，優(yōu)選至少35。C，更優(yōu)選至少40。C，甚至更優(yōu)選至少45。C。進(jìn)行自溶的溫度可適當(dāng)?shù)貫榈陀?5。C，優(yōu)選低于52。C，甚至更優(yōu)選低于50。C。自溶可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行至少10小時(shí)，優(yōu)選至少16小時(shí)，更優(yōu)選至少24小時(shí)。該自溶可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行少于100小時(shí)，優(yōu)選少于48小時(shí)，并且更優(yōu)選少于36小時(shí)。然后適當(dāng)?shù)赝ㄟ^離心分離該酵母，產(chǎn)生一種提取物和低(3-葡聚糖含量的細(xì)胞壁流質(zhì)。另一步，在至少pH8.5、優(yōu)選至少pH9、更優(yōu)選至少pH9.2時(shí)用酶處理細(xì)胞壁流質(zhì)，該酶包括但不限于蛋白酶，例如堿性蛋白酶。該pH還可適當(dāng)?shù)氐陀?0.5，優(yōu)選低于10，更優(yōu)選低于9.8。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)卦谥辽?5。C溫度、優(yōu)選至少50°C、更優(yōu)選至少53°C下進(jìn)行。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)卦诘陀?0。C、優(yōu)選低于65。C、更優(yōu)選低于60°C、甚至更優(yōu)選低于57°C的溫度下。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行至少5小時(shí)，優(yōu)選至少8小時(shí)，更優(yōu)選至少10小時(shí)，甚至更優(yōu)選至少12小吋。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行少于48小時(shí)，優(yōu)選少于36小時(shí)，更優(yōu)選少于24小B寸，甚至更優(yōu)選小于18小時(shí)。然后離心分離第二產(chǎn)物，產(chǎn)生一種富含甘露聚糖(a-甘露聚糖)的提取物和一種富含P-葡聚糖的細(xì)胞壁制備物。然后干燥(例如噴霧干燥)這種(3-(l，3/l，6)細(xì)胞壁產(chǎn)品，這致使產(chǎn)品聚集成約100-300微米或更大的顆粒。然后將甘露聚糖提取物經(jīng)過10,000分子量的超濾以產(chǎn)出富含甘露聚糖的高分子量的滲余物。如上所述的這種示范性的方法如圖1的流程圖所示?；铙w酵母在以下過程中進(jìn)行自溶，其間內(nèi)源的酵母酶分解和溶解一些酵母高分子。通過離心從不溶的酵母細(xì)胞壁中分離可溶性提取物。然后用高pH蛋白酶處理細(xì)胞壁，進(jìn)一步從細(xì)胞壁中去除蛋白質(zhì)，隨后同樣去除依附于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的甘露聚糖。然后通過離心從二次提取物中分離出富含P-葡聚糖的細(xì)胞壁。具有高分子量的甘露聚糖可通過10,000Da超濾該二次提取物進(jìn)一步純化和濃縮甘露聚糖。在另一實(shí)施方式中，方法包括了第一步的酵母(例如啤酒酵母)的自溶，(通常8%-12%的固態(tài)漿料)。自溶可適當(dāng)?shù)卦谥辽賞H4、優(yōu)選至少pH4.5，更優(yōu)選至少pH5時(shí)進(jìn)行。該pH還可適當(dāng)?shù)氐陀?，優(yōu)選低于7，更優(yōu)選低于6。進(jìn)行自溶的溫度可適當(dāng)?shù)貫橹辽?0。C，優(yōu)選至少40°C，更優(yōu)選至少45。C。該溫度還可適當(dāng)?shù)氐陀?5°C，優(yōu)選低于53°C，更優(yōu)選低于50。C。自溶可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行至少IO小時(shí)，優(yōu)選至少16小時(shí)，更優(yōu)選至少24小時(shí)。該自溶可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行少于100小時(shí)，優(yōu)選少于48小時(shí)，并且更優(yōu)選少于36小時(shí)。然后通過離心適當(dāng)?shù)胤蛛x酵母，產(chǎn)生一種提取物和一種低卩-葡聚糖含量的細(xì)胞壁流質(zhì)。另一步用酶處理該細(xì)胞壁流質(zhì)。該酶步驟首先在堿性pH(例如，在至少pH8.5，優(yōu)選至少9，更優(yōu)選至少9.2)時(shí)使用一種高pH蛋白酶。該pH還可適當(dāng)?shù)氐陀?0.5，優(yōu)選低于10，更優(yōu)選低于9.8。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)卦谥辽?5°C、優(yōu)選至少50。C、更優(yōu)選至少53。C的溫度下進(jìn)行。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)卦诘陀?0。C、優(yōu)選低于65°C、更優(yōu)選低于60°C、甚至更優(yōu)選低于57°C的溫度下進(jìn)行。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行至少5小時(shí)，優(yōu)選至少8小時(shí)，更優(yōu)選至少10小時(shí)，甚至更優(yōu)選至少12小時(shí)。該蛋白酶處理可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行少于48小時(shí)，優(yōu)選小于36小時(shí)，更優(yōu)選小于24小時(shí)，更優(yōu)選小于18小時(shí)。蛋白酶酶步驟后是用葡糖淀粉酶(例如來自曲霉屬的種)、淀粉酶(例如來自枯草芽孢桿菌(Sa"7/wwte力')、米曲霉"^ergz7/^oo^e)的a淀粉酶；來自黑曲霉Us戸^7to或根霉屬霉菌的淀粉葡萄糖苷酶)和/或脂肪酶(例如來自洋蔥假單胞菌(Aez^omomwce戸"'a)、鈹褶假絲酵母(Ca"(i/cbrwgcwa)和爪哇毛霉(Mwcor_/avflm'cus)的脂肪酶；通常約0.05%-1wt%)進(jìn)行溫育。用葡糖淀粉酶、淀粉酶和/或脂肪酶溫育是在中性到微酸性的pH和高溫條件下適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行的。例如，該pH可以適當(dāng)?shù)貫橹辽贋?.5，優(yōu)選至少4，更優(yōu)選至少4.5。該pH還可適當(dāng)?shù)貫榈陀?，優(yōu)選低于6，更優(yōu)選低于5.5。與葡糖淀粉酶、淀粉酶和/或脂肪酶進(jìn)行溫育的溫度可適當(dāng)?shù)貫橹辽?0°C，優(yōu)選至少45°C，更優(yōu)選至少50°C，甚至更優(yōu)選至少53°C。該溫度也可適當(dāng)?shù)貜牡陀?0°C，優(yōu)選低于65。C，更優(yōu)選低于60。C，甚至更優(yōu)選低于58。C。尤其是如果該蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶是耐熱酶，可適當(dāng)?shù)夭捎弥辽?0°C、至少65。C、至少70。C、至少75。C、至少80。C、至少85。C或至少90。C的溫度。與堿性蛋白酶一起進(jìn)行的溫育還可以繼之以與葡糖淀粉酶和脂肪酶的組合、淀粉酶和脂肪酶的組合或葡糖淀粉酶、淀粉酶和脂肪酶的組合一起的溫育。如上所述的這種示范方法如圖2的流程圖所示。在圖2描繪的方法中，活體酵母在以下過程中進(jìn)行自溶，其間內(nèi)源的酵母酶會(huì)分解和溶解一些酵母高分子。來自自溶作用的細(xì)胞壁首先用高pH蛋白酶處理。與該高pH蛋白酶的溫育適當(dāng)?shù)卦?0°C到65°C的溫度進(jìn)行大約10到16小時(shí)。然后用淀粉酶(或其它葡聚糖酶)或脂肪酶、或淀粉酶和脂肪酶的組合處理細(xì)胞壁。與該淀粉酶和/或脂肪酶的溫育適當(dāng)?shù)卦趐H4到7和50°C到65°C的溫度進(jìn)行大約4到10小時(shí)。淀粉酶可以溶解殘留的(x-葡聚糖，例如那些可能仍然殘留在細(xì)胞壁上的糖原。脂肪酶可以降解富含脂類和脂肪的細(xì)胞壁膜。然后可以離心細(xì)胞壁流質(zhì)，產(chǎn)生富含甘露聚糖的二次提取物，和富含(3-葡聚糖的細(xì)胞壁產(chǎn)品。該細(xì)胞壁產(chǎn)品可進(jìn)行干燥(例如噴霧干燥)。該二次甘露聚糖提取物可通過超濾膜，例如10,000Da的超濾膜、50,000Da的超濾膜或100,000Da的超濾膜，從而富集滲余物中的甘露聚糖。本發(fā)明的制備物可通過任何適用的方法進(jìn)行干燥，所述方法包括但不限于凍干、滾筒式干燥、烤箱干燥、噴霧干燥、環(huán)形干燥(ringdrying)及其組合和/或使用成膜設(shè)備進(jìn)行干燥，和要么不采用進(jìn)一步的處理，要么可使用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行研磨。適當(dāng)?shù)?，該高pH蛋白酶可以在pH7以上具有最優(yōu)的蛋白水解活性。適宜的蛋白酶包括但不限于獲自下述來源的那些蛋白酶中華獼猴桃(jc""/(^ac/z/"em'50、菠蘿(^"a"oscomosu)、曲霉屬的種(例如黑曲霉、黑曲霉泡盛曲霉變種(Aw&ervar.awawoWJ、米曲霉、醬油曲霉".^/^)、蜂蜜曲霉(Ame〃e^))、芽孢桿菌屬的種(例如枯草芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(及fl/c"/op/7w)、溶淀粉芽孢桿菌(及aw_y/o/&Me/ac/my)、嗜堿芽孢桿菌(及/^/w/wra"j)、遲緩芽孢桿菌(及/e"fw)、地衣芽孢桿菌(及//c/^"!/or附&)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5.他an^mwo/Miw)、嗜熱芽孢桿菌(及^/7w，o加/Wcmj))、番木瓜(Gar/ca戸p少fl)、栗疫病菌(Qyp/zowe"n'a/amy/"ca)、栗疫菌(E"cfc^/a/araW^)、脫毛榕木(F/c"jg/"6rato)、乳克魯維式酵母，柑桔青霉(尸em'c/〃wmc//r/m<w)、米赫根毛霉(i/^zomwcorm/e/e/)、雪白根霉(i^izc^^m've^)、來自小牛、山羊或牛胃或豬胰腺，及其組合。適宜的蛋白酶可包括但不限于，市售的酶例如枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147及枯草桿菌蛋白酶168、AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTMDuralase、Durazym、EsperaseTM、和KannaseTM(獲自NovoNordiskA/S);MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、Optimase、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2、和FN3(獲自GenencorInternationalInc.);和ValidaseAFP、ValidaseFP濃縮物、ValidaseTMFP500、ValidaseFPII、ValidaseTSP濃縮物、堿性蛋白酶濃縮物、Bromelain(獲自ValleyResearch,SouthBend，IN)，及其組合。適宜的淀粉酶包括植物、動(dòng)物、細(xì)菌或真菌來源的那些淀粉酶，及其組合。淀粉酶包括但不限于，獲自芽孢桿菌屬的種(例如地衣芽孢桿菌、溶淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌)，米曲霉，黑曲霉，黑曲霉泡盛曲霉變種，蛾微桿菌(Af/cra6acfen'wm/m;eWa/e)，青綠色熱單孢(7T7erwomo"仍/orav/nVfe)，大麥芽(大麥屬的種)，豬胰腺(Sw種)，及其組合的葡糖淀粉酶或a-淀粉酶。有用的淀粉酶實(shí)例包括但不限于市售淀粉酶，例如葡糖淀粉酶濃縮物(GlucoamylaseConcentrate)、DuramylTM、TermamylTM、Fungamyl和BANTM(獲自NovoNordiskA/S);RapidaseTM和PurastarTM(獲自GenencorInternationalInc.);和ValidaseTMBAA,ValidaseTMHT340L，ValidaseFAA，ValidaseTMAGS,ValidaseTMGA，ValidaseTMRGA(獲自ValleyResearch,SouthBend,IN),及其組合?？梢赃m當(dāng)?shù)夭捎玫矸勖傅慕K濃度至少0.001%、優(yōu)選至少0.01%、更優(yōu)選至少0.02%?？梢赃m當(dāng)?shù)夭捎玫矸勖傅慕K濃度小于0.1%、優(yōu)選小于0.05%、更優(yōu)選小于0.1%?？捎糜诒景l(fā)明的脂肪酶包括但不限于來自腐質(zhì)霉屬(等同于嗜熱真菌屬(7^e/7ww;^"))的脂肪酶，例如來自疏棉狀嗜熱絲孢菌(HAa"wg/"OM(r./a"wg/"o;w))、年寺異腐質(zhì)霉(i/./rao/em))的脂肪酶；假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.fl/07/^e"")或類產(chǎn)堿假單胞菌(P./wez^oa/ca/Zge"")、洋蔥假單胞菌(P.ce/ac/a)、施氏假單胞菌(尸.、熒光假單胞菌(戶.yMomsce;w)、假單胞菌屬種菌株SD705、威州假單胞菌(尸.M^co肌'"e"&)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或短小芽孢桿菌(及戸mz7附)的脂肪酶(WO91/16422);米曲霉，黑曲霉，解脂假絲酵母(Ca"&^，鈹褶假絲酵母，爪哇毛霉，婁格法爾特氏青霉(戶e"/c77/wwmwe/oW/)，米赫根毛霉，德列馬根霉(i/^o;msflfe/e附a"，雪白根霉(旌zo戸w/v咖)，米根霉，無根根霉(艦zo，a^r/z/簡(jiǎn))，及其組合。市售脂肪酶包括但不限于Lipolase頂及LipolaseUltra(NovoNordiskA/S)，及真菌脂肪酶(FungalLipase)8000及胰脂肪酶(PancreaticLipase)250(獲自ValleyResearch,SouthBend，IN)。來自酵母細(xì)胞自溶作用的產(chǎn)物適當(dāng)?shù)剡€包含以干燥固體計(jì)總產(chǎn)物的至少20%、優(yōu)選至少23%、更優(yōu)選至少25%的蛋白質(zhì)。該產(chǎn)物同樣適當(dāng)?shù)匕愿稍锕腆w計(jì)小于總產(chǎn)物45%、優(yōu)選小于40%、更優(yōu)選小于35%的蛋白質(zhì)。來自酵母細(xì)胞自溶作用的產(chǎn)物適當(dāng)?shù)剡€包含以干燥固體計(jì)總產(chǎn)物的至少20%、優(yōu)選至少23%、要優(yōu)選至少25%的葡聚糖。該產(chǎn)物同樣適當(dāng)?shù)匕愿稍锕腆w計(jì)小于總產(chǎn)物的45%、優(yōu)選小于40%、更優(yōu)選小于35%的葡聚糖。來自酵母細(xì)胞自溶#用的產(chǎn)物適當(dāng)?shù)赝瑯影愿稍锕腆w計(jì)總產(chǎn)物的至少5%、優(yōu)選至少7%、更優(yōu)選至少10%的a-葡聚糖。該產(chǎn)物同樣適當(dāng)?shù)匕愿稍锕腆w計(jì)小于總產(chǎn)物的20%、優(yōu)選小于18%、更優(yōu)選小于15%的(x-葡聚糖。來自酵母細(xì)胞自溶作用的該產(chǎn)物適當(dāng)?shù)匕郧г锕腆w計(jì)總產(chǎn)物的至少7%、優(yōu)選至少10%、更優(yōu)選至少12%的J3-葡聚糖。該產(chǎn)物同樣適當(dāng)?shù)匕栽锕腆w計(jì)小于總產(chǎn)物的22%、優(yōu)選小于20%，更優(yōu)選小于18%的P-葡聚糖。來自酵母細(xì)胞自溶作用的該產(chǎn)物適當(dāng)?shù)匕愿稍锕腆w計(jì)總產(chǎn)物的至少5%、優(yōu)選至少7%、更優(yōu)選至少10%的甘露聚糖。該產(chǎn)物同樣適當(dāng)?shù)匕愿稍锕腆w計(jì)小于總產(chǎn)物的20%、優(yōu)選小于18%、更優(yōu)選小于15%的甘露聚糖。富含P-(1,3/1,6)葡聚糖產(chǎn)物的細(xì)胞壁產(chǎn)品的特征在于，例如，至少50%、至少55%、至少60%或至少65%的|3-(1,3/1，6)葡聚糖，而蛋白質(zhì)含量小于20%、小于15%或小于10%。富含甘露聚糖的產(chǎn)物(二次甘露聚糖提取物)的特征在于包含至少50%、優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少57%的甘露聚糖。該富含甘露聚糖的產(chǎn)物的特征還可以在于包含小于70%、優(yōu)選小于68%、更優(yōu)選小于65%的甘露聚糖。該富含甘露聚糖的產(chǎn)物(二次甘露聚糖提取物)的特征還在于包含至少25%、優(yōu)選至少27%、更優(yōu)選至少29%的蛋白質(zhì)。該富含甘露聚糖的產(chǎn)物的特征還可以在于包含小于35°/。、優(yōu)選小于32%、更優(yōu)選小于30%的蛋白質(zhì)。超濾步驟可以這樣進(jìn)行迫使根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的提取物(例如二次甘露聚糖提取物)在壓力下穿過超濾膜。適當(dāng)?shù)?，該超濾膜包括一種或多種半透膜。該半透膜或超濾膜可以具有一定的截流分子量，例如至少8,000Da、優(yōu)選至少10，000Da、更優(yōu)選至少25，000Da、更優(yōu)選至少50,000Da、更優(yōu)選至少100,000Da、更優(yōu)選至少150,000Da。應(yīng)當(dāng)理解該超濾膜可以具有本文所述的那些數(shù)值之間的任一數(shù)值的截流分子量，包括但不限于至少15,000Da、20,000Da、30,000Da、40,000Da、60,000Da、70,000Da、80,000Da、90,000Da、110,000Da、120,000Da、130,000Da及140,000Da的截流分子量。適宜的超濾膜包括但不限于，獲自A/GTechnologyCorp，Needham，MA的空心纖維膜。二次甘露聚糖提取物經(jīng)過濾之后在滲余物中的總二次甘露聚糖的至少80%(w/w)、優(yōu)選至少85%(w/w)、更優(yōu)選至少90%(w/w)的分子量可高于所用過濾膜的截流分子量。例如，如果二次甘露聚糖提取物應(yīng)用了10,000Da的截流分子量，那么在滲余物中通常至少80%(wAv)、優(yōu)選至少85%(w/w)、更優(yōu)選至少90%(w/w)的總甘露聚糖的分子量高于10,000Da。如果二次甘露聚糖提取物應(yīng)用了50,000Da的截流分子量，那么在滲余物中通常至少80%(w/w)、優(yōu)選至少85%(w/w)、更優(yōu)選至少90%(w/w)的總甘露聚糖的分子量高于50,000Da。如果二次甘露聚糖提取物應(yīng)用了100,000Da的截流分子量，那么在滲余物中通常至少80%(w/w)、優(yōu)選至少85%(w/w)、更優(yōu)選至少90%(w/w)的總甘露聚糖的分子量高于100,000Da。如果二次甘露聚糖提取物應(yīng)用了150,000Da的截流分子量，那么在滲余物中通常至少80%(w/w)、優(yōu)選至少85%(w/w)、更優(yōu)選至少卯％(w/w)的總甘露聚糖的分子量高于150,000Da。該超濾步驟可任選地包括使甘露聚糖提取物通過兩個(gè)或多個(gè)不同截流分子量的超濾膜。最后的滲余物包含一種富含甘露聚糖的產(chǎn)物，其中大多數(shù)甘露聚糖的分子量介于所述超濾器的截流分子量之間。在該實(shí)施方式中，在最后的滲余物中至少80%(w/w)、優(yōu)選至少85%(w/w)、更優(yōu)選至少90°/。(w/w)的總甘露聚糖的分子量介于超濾膜的截流分子量之間。自溶細(xì)胞壁經(jīng)酶處理之后從富含葡聚糖產(chǎn)物中分離的二次甘露聚糖提取物的特征在于，例如，15%到50%的甘露聚糖，20%到30%的蛋白質(zhì)及20%到25%的其它組分。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明方法超濾二次甘露聚糖提取物時(shí)，滲余物可包含至少50%、優(yōu)選至少52%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少60%的甘露聚糖。該滲余物可包含低于70%、優(yōu)選低于65%、更優(yōu)選小于62%的甘露聚糖。該滲余物可進(jìn)一步包含至少10%、優(yōu)選至少12%、更優(yōu)選至少15%、甚至更優(yōu)選至少17%的蛋白質(zhì)。該滲余物可進(jìn)一步包含低于33%、優(yōu)選低于30%、更優(yōu)選低于22%的蛋白質(zhì)?？梢灶A(yù)見本發(fā)明的制備物在例如食品增補(bǔ)劑、藥品(例如改善免疫應(yīng)答)、化妝品、動(dòng)物飼料及營(yíng)養(yǎng)輔助品中具有重要性。例如，一種動(dòng)物飼料可以適當(dāng)?shù)匕?到10g制備物/kg詞料。適當(dāng)?shù)兀灾亓?重量計(jì)，該制備物可以包含該詞料總重的至少0.01%、優(yōu)選至少0.02%、更優(yōu)選至少0.05%、甚至更優(yōu)選至少0.1%，并低于該飼料總重的5°/。、優(yōu)選低于2%、更優(yōu)選低于0.5%、甚至更優(yōu)選低于0.3%。適合的動(dòng)物飼料包括，但不限于，牛、馬、豬、家禽、魚(例如，甲殼動(dòng)物、有殼的水生動(dòng)物)、鳥類和寵物(例如，貓、狗)飼料。液體組合物可以包含0.1%-1wtM的本發(fā)明的制備物。本發(fā)明的制備物還可與在農(nóng)業(yè)上可接受的載體一起，以及任選的在農(nóng)業(yè)上可接受的營(yíng)養(yǎng)物、除草劑或殺蟲劑一起，用于植物保護(hù)組合物。例如，根據(jù)本發(fā)明制備的富含P-葡聚糖的部分可適當(dāng)?shù)卦趧?dòng)物及人食品、藥品中用作免疫刺激物或軟化劑、降膽固醇劑、以及食品和飲料中的增稠劑。如果加入到一種軟化劑、洗液或乳膏劑中并用于治療病癥(condition)，該P(yáng)-葡聚糖可以適當(dāng)?shù)匾灾辽?.05%、優(yōu)選至少0.1%、更優(yōu)選至少0.5%并小于10%、優(yōu)選小于5%、更優(yōu)選小于2%的濃度(w/w)存在。適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明制備的P-葡聚糖部分可以用于例如通過摻入乳膏劑、洗液或軟化劑中治療濕疹。濕疹包括各種發(fā)炎的皮膚病癥，包括遺傳過敏性皮炎("遺傳過敏性濕疹(atopiceczema")，并會(huì)在兒童期影響世界人口的約10%到約20%。濕疹似乎是身體免疫系統(tǒng)的一種異常應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明制備的富含甘露聚糖的產(chǎn)品還有許多用途。例如，甘露聚糖產(chǎn)品可以用于動(dòng)物詞料工業(yè)，能夠有利地結(jié)合霉菌毒素以及病原菌，防止細(xì)菌在腸道建群?？傊藙e的之外本發(fā)明應(yīng)用相對(duì)溫和的工藝操作條件，提供了富含P-葡聚糖及甘露聚糖的制備物。在下面實(shí)施例中闡述了本發(fā)明的各種特征及方面。實(shí)施例l:使用高pH蛋白酶處理酵母在夾層式不銹鋼容器中將來自商品級(jí)的自溶啤酒酵母(釀酒酵母)的31.1kg的細(xì)胞壁部分加熱到55。C。總固相為10.7%，在該固相中蛋白質(zhì)總比例為24.5°/。。用氫氧化鈉將pH提高到9,5，并加入0.1%(基于總重)的Protex6L(—種堿性蛋白酶，獲自Genencor，PaloAlto，CA)。在55°C攪拌細(xì)胞壁16小時(shí)。在85。C加熱30分鐘使Protex6L失活，使用連續(xù)傾析法，用AlphaLavalGym型轉(zhuǎn)筒離心機(jī)分離細(xì)胞壁。用與除去的提取物等體積的水洗滌不溶的細(xì)胞壁部分三次。將洗滌的細(xì)胞壁部分濃縮到固相15.4%，鹽酸調(diào)整pH到7.0，噴霧干燥該部分。將一部分來自Protex6L處理的提取物(相當(dāng)于圖1所示2°提取物)濃縮到固相28.3%，調(diào)整pH為7.0并噴霧干燥該提取物。殘余的2°提取物用UFP-10-C-6A10,000NMWC空心纖維膜(獲自A/GTechnologyCorp，Needham，MA)超濾。將富含甘露聚糖的高分子量滲余物的pH調(diào)整為7.0并噴霧干燥。調(diào)整該3。提取物(濾液)的pH為7.0，濃縮并噴霧干燥。利用下列技術(shù)分析由此方法產(chǎn)生的產(chǎn)品的組成利用LECO蛋白質(zhì)測(cè)定儀(LECOCorp.,St.Joseph,MI)測(cè)定蛋白質(zhì)；利用MegazymeInternationalMushroom及酵母卩-葡聚糖試劑盒(獲自MegazymeInternational,Wicklow，愛爾蘭)測(cè)量總葡聚糖、a-葡聚糖和卩-葡聚糖；利用己糖激酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶及磷酸甘露糖異構(gòu)酶，通過碳水化合物的酸性水解測(cè)定甘露聚糖，結(jié)合分光光度分析測(cè)定游離甘露糖；使用Blich，E.G.和Dyer，W丄Can.J.Biochem.Physio1.(1959)37，911的甲醇-氯仿提取法測(cè)定脂肪；使用YellowSpringsInstrumentsBiochemistry分析器(獲自YSIIncorporated,YellowSprings,OH)領(lǐng)!j定游離葡萄糖。這些分析結(jié)果示于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>ND指未確定的。實(shí)施例2:使用高pH蛋白酶和葡糖淀粉酶處理酵母將16,000加侖的由原啤酒酵母提取物產(chǎn)生的細(xì)胞壁膏狀物加熱到55°C，用氫氧化鈉調(diào)整pH為9.5。加入0.1%(v/v)的Protex6L，混合物在55°C放置14小時(shí)。用HC1將pH降到pH5.0。Protex6L在pH5下沒有活性，不會(huì)破壞加入的酶。加入0.0175%(重量:總重)的葡糖淀粉酶濃縮物(獲自ValleyResearch,SouthBend,IN)。在55°C放置4小時(shí)，然后升溫到88。C使該酶失活。用Westfalia轉(zhuǎn)筒分離器(獲自WestfaliaSeparator,Inc.,Northvale,NJ)分離加熱的物料。濃縮大部分提取物(圖2中所示的2°提取物)并噴霧干燥。一部分2°提取物用UFP-10-C-6A1O，OOONMWC空心纖維膜(獲自A/GTechnologyCorp，Needham，MA)超濾。濃縮滲余物及濾液并噴霧干燥。根據(jù)在實(shí)施例1所述的技術(shù)分析該噴霧干燥產(chǎn)品。結(jié)果列于表2。通過離心用水洗滌該細(xì)胞壁部分，濃縮并噴霧干燥。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>比較表1和2的數(shù)據(jù)可以看出在實(shí)施例2處理過程中加入的葡糖淀粉酶的效果。在實(shí)施例2的過程中，超濾之后在滲余物和濾液中并沒有檢測(cè)到a-葡聚糖。同樣，來自實(shí)施例2處理過程的2。和3。提取物中的游離葡萄糖水平(如表2所示)比來自實(shí)施例1的2°和3°提取物(如表1所示)高出很多。實(shí)施例3:使用以不同順序加入到自溶的酵母細(xì)胞壁中的葡糖淀粉酶和高pH蛋白酶處理酵母向兩個(gè)夾層式不銹鋼容器中分別加入25Kg來自商業(yè)級(jí)原啤酒酵母提取物的細(xì)胞壁，其中酵母細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過自溶作用。固相為11.8%。將兩個(gè)容器加熱到55°C。容器1的pH調(diào)整為5.0并加入0.1%(重量:總重)的葡糖淀粉酶濃縮物(獲自ValleyResearch,SouthBend，IN)。連續(xù)溫育14小時(shí)，將pH升高到9.5。然后加入0.10。/。的Protex6L，繼續(xù)溫育4小時(shí)。在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣并測(cè)定在葡糖淀粉酶作用下釋放的游離葡萄糖。開始時(shí)容器2的pH升高到9.5并加入0.1%(重量:總重量)的Protex6L。在55°C溫育混合物14小時(shí)。然后將pH降到5.0并加入0.1%的葡糖淀粉酶濃縮物。繼續(xù)溫育4小時(shí)。在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣并測(cè)定在葡糖淀粉酶作用下釋放的游離葡萄糖。表3表明在不同時(shí)間兩個(gè)容器中游離葡萄糖的水平。表3啤酒酵母細(xì)胞壁a-葡聚糖釋放出的葡萄糖(g/L游離葡萄糖)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表3的數(shù)據(jù)表明在Protex6L之前加入葡糖淀粉酶時(shí)，如在容器1中，則細(xì)胞壁的變化不足以使葡糖淀粉酶進(jìn)入并消化在啤酒酵母自溶作用之后嵌入細(xì)胞壁內(nèi)部的大分子a-葡聚糖(糖原)。相反，在容器2中，在葡糖淀粉酶之前加入蛋白酶，使得葡糖淀粉酶能夠進(jìn)入并消化(x-葡聚糖，釋放出多得多的葡萄糖。在pH5.0下，盡管容器l中的葡糖淀粉酶作用時(shí)間(14小時(shí))要比在容器2中的葡糖淀粉酶作用時(shí)間(4小時(shí))長(zhǎng)，但仍是這樣的情況。因此，為了最優(yōu)地去除來自啤酒酵母細(xì)胞壁的糖原Ax-葡聚糖，應(yīng)在葡糖淀粉酶之前加入堿性蛋白酶Protex6L。實(shí)施例4:根據(jù)圖2所示處理過程處理啤酒酵母和面包酵母。將220g來自商業(yè)級(jí)的自溶的初級(jí)培養(yǎng)面包酵母(固相15%)或啤酒酵母(固相11.8%)的細(xì)胞壁加熱到55。C，調(diào)整pH為9.5。然后用0.1%(重量總重)Protex6L處理該細(xì)胞壁14小時(shí)。14小時(shí)后，將pH降到5.0，每個(gè)容器中加入0.0175%的葡糖淀粉酶濃縮物。在55。C下再溫育該培養(yǎng)瓶4小時(shí)。用YSI生化分析器(BiochemistryAnalyzer)監(jiān)測(cè)游離葡萄糖。結(jié)果如表4所示。比較使用圖2所示的處理過程由啤酒酵母和面包酵母細(xì)胞壁釋放出的葡萄糖<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>來自面包酵母的自溶作用的細(xì)胞壁所含的糖原低于來自啤酒酵母的細(xì)胞壁，主要是因?yàn)楹醚跖囵B(yǎng)的面包酵母累積的p-葡聚糖往往少于厭氧培養(yǎng)的啤酒酵母。用葡糖淀粉酶溫育之后的啤酒酵母細(xì)胞壁釋放出的葡萄糖多于面包酵母細(xì)胞壁釋放出的葡萄糖。因此圖2的處理過程對(duì)于處理來自啤酒酵母細(xì)胞壁的P-葡聚糖非常有效。實(shí)施例5:提取物在動(dòng)物飼料中的用途通過將兩個(gè)組分干混在一起來配制自溶啤酒酵母細(xì)胞來自圖2處理的2。提取物為50:50(基于干燥固體)混合物，其中2°提取物根據(jù)實(shí)施例2制備(即前后用蛋白酶和淀粉酶處理獲得的甘露聚糖)。該混合物用來補(bǔ)充斷乳后28天的幼豬的詞料。該混合物在第I階段(0-7天)以3磅(lbs)/噸飼料加入，在第2階段(7-14天)為2磅/噸餌料，第3階段(14-28天)為2磅/噸餌料。對(duì)照組和處理組詞料均含有抗生素。根據(jù)體重將斷乳后的豬(17-22天齡)隨機(jī)地分配到對(duì)照組飼料或處理組飼料。每個(gè)飼料組有13只豬，分6個(gè)圍欄。結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>是指差異顯著，PO.IO。處理組餌料飼養(yǎng)的豬在14天明顯地更重，并到28天豬重量有增加的趨勢(shì)。實(shí)施例6:酵母提取物在動(dòng)物飼料中作為增味劑的用途。犬食涂以油，然后將1.0%的來自圖2所示處理過程的干燥的3°提取物(根據(jù)實(shí)施例2制備(即超濾之后的濾液))或者1.0%的己經(jīng)被接受的犬增味劑噴涂到涂有油的犬食表面上。以1000g的定額在兩天內(nèi)提供給一組20只犬。食盆的位置每天互換，防止"左-右"偏愛。每只犬在兩天時(shí)間內(nèi)食用的食物量列于表6。表6顯示根據(jù)實(shí)施例2制備的圖2處理過程的3。提取物即使不高于標(biāo)準(zhǔn)增味劑(palatant)，但至少能夠跟標(biāo)準(zhǔn)增味劑一樣增強(qiáng)干燥犬食的可口性。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例7(預(yù)示性)酵母細(xì)胞壁-噴霧干燥粉的特性根據(jù)實(shí)施例2所述方法制備高度純化的釀酒酵母細(xì)胞壁產(chǎn)品。其具有高濃度的(P-l，3/1,6)葡聚糖。該產(chǎn)品通過了FDA的G.R.A.S.(通常被認(rèn)為是安全的)。該產(chǎn)品具有高質(zhì)量天然來源的((3-1,3/1,6)葡聚糖，可以用于各式各樣的食品中的增補(bǔ)劑。已經(jīng)表明該生物學(xué)活性物質(zhì)刺激許多動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。該組合物和該產(chǎn)品的特性列于表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例8(預(yù)示性)啤酒酵母細(xì)胞壁膏狀物被加熱到131°F(55°C)。用50%氫氧化鈉(每Kg細(xì)胞壁膏狀物約5ml)將pH升到9.5。加入0.1%(體積:細(xì)胞壁膏狀物總重)的Protex6L(Genencore)。在131°F放置混合物14小時(shí)。用28。/。的HC1(鹽酸)將pH降到5.0并加入0.0175%(重量:總重)的葡糖淀粉酶濃縮物(ValleyResearch)。在55°C放置混合物4小時(shí)，然后加熱到185-195。F加熱滅活該酶。分離各部分。在噴霧干燥富含J3-葡聚糖的不溶部分之前，調(diào)整pH為6.5。噴霧干燥富含P-葡聚糖的不溶部分。制備高度純化的釀酒酵母細(xì)胞壁產(chǎn)品。其具有高濃度的(P-1，3/1，6)葡聚糖。該產(chǎn)品通過FDA的G.R.A.S.。該產(chǎn)品具有高質(zhì)量的天然來源的(p-l,3/l,6)葡聚糖，可用于各式各樣的食品中增補(bǔ)劑。已經(jīng)表明該生物學(xué)活性物質(zhì)能夠刺激許多動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。該組合物和該產(chǎn)品的特性示于表7。實(shí)施例9:使用高pH蛋白酶和脂肪酶處理酵母。將220g來自商業(yè)級(jí)面包酵母自溶作用的細(xì)胞壁(固相15%)置于玻璃培養(yǎng)瓶中并攪拌。將溫度升高到55。C，并用HCl將pH升到9.5。加入0.1%的Protex6L，溫育樣品14小時(shí)。此時(shí)，將30g的等分試樣裝入適用于SorvallSS34離心機(jī)轉(zhuǎn)子的50ml離心管(獲自Nalgene)中。各管中加入磁攪拌棒。向離心管加入下列A、B或C:A.0.0175%的葡糖淀粉酶濃縮物(獲自ValleyResearch)B.0.1。/。的脂肪酶CR(—種獲自ValleyResearch的三酰基甘油脂肪酶)C.0.0175%的葡糖淀粉酶濃縮物+0.1%的脂肪酶CR。各管在55°C攪拌溫育四小時(shí)。85°C加熱15分鐘滅活所述酶，使用帶有SS34轉(zhuǎn)子的Sorvall離心機(jī)沉淀(pellet)細(xì)胞壁(12,000r.p.m.10分鐘)。然后用與除去的可溶性提取物等體積的水洗滌沉淀三次。細(xì)胞壁重懸浮到約固相15%并用BuchiMini噴霧干燥器B-191噴霧干燥。分析干燥細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)(氮X6.25;LECO蛋白質(zhì)測(cè)定儀，獲自LECOCorp.,St.Joseph,MI)，并禾ll用MegazymeInternationalMushroom禾卩酵母卩-葡聚糖試劑盒(獲自MegazymeInternational,Wicklow,Ireland)觀!)量卩-葡聚糖。結(jié)果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例IO(預(yù)示性)實(shí)施例2的富含J3-葡聚糖的產(chǎn)品在肉用仔雞飼料中的應(yīng)用每天給來自1天齡的肉用仔雞詞喂含1g/Kg實(shí)施例2的富含p-葡聚糖產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)雞詞料(無抗生素)或者不含P-葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)雞飼料(無抗生素)(對(duì)照)。7天后用雛雞病原性大腸桿菌菌株對(duì)對(duì)照和j3-葡聚糖飼養(yǎng)的兩組雛雞進(jìn)行呼吸免疫攻擊。持續(xù)給這些小雞喂其各自的飼料，并記錄一個(gè)月內(nèi)的死亡率。預(yù)計(jì)P-葡聚糖飼養(yǎng)的雛雞的死亡率會(huì)明顯低于標(biāo)準(zhǔn)飼料組。對(duì)于降低呼吸道感染引發(fā)的生產(chǎn)損失來說，P-葡聚糖對(duì)雛雞免疫系統(tǒng)的刺激作用是有價(jià)值的。實(shí)施例11(預(yù)示性)實(shí)施例1的富含甘露聚糖的超濾液滲余物在雛雞飼料中的用途兩星期內(nèi)每天給肉用仔雞飼喂含有l(wèi)g/Kg實(shí)施例1的富含甘露聚糖超濾滲余物的標(biāo)準(zhǔn)雞飼料(無抗生素)或者不含富集的甘露聚糖的標(biāo)準(zhǔn)雞飼料(無抗生素)(對(duì)照)。然后給肉用仔雞(對(duì)照和甘露聚糖詞養(yǎng)組)經(jīng)口接種雛雞病原性沙門氏菌屬的菌株。持續(xù)給這些雛雞喂其各自的飼料，監(jiān)測(cè)一個(gè)月內(nèi)的死亡率和發(fā)病率。甘露聚糖會(huì)與沙門氏菌屬結(jié)合并防止其與甘露聚糖飼料組雛雞的腸道結(jié)合。預(yù)計(jì)這會(huì)顯著降低甘露聚糖飼養(yǎng)雛雞組的發(fā)病率及死亡率。實(shí)施例12(預(yù)示性)實(shí)施例1或2的富含P-葡聚糖的產(chǎn)品在虎蝦(TigerShrimp)培養(yǎng)中的用途。將一組虎蝦(斑節(jié)對(duì)蝦(尸e憩ewmom^ow)浸于不含富集的卩-葡聚糖的溶液中(對(duì)照組)。在研究期間該組飼以不含富集的p-葡聚糖的商品蝦食小球(commercialpellet)。第二組虎蝦浸于含0.1%來自實(shí)施例1的富含P-葡聚糖的溶液中，然后飼以含0.1%來自實(shí)施例1的富集的p-葡聚糖的商品奸食顆粒。第三組虎蝦浸于含0.1%來自實(shí)施例2的富含P-葡聚糖的溶液中，然后飼以含0.1M來自實(shí)施例2的富集的p-葡聚糖的商品蝦食顆粒。監(jiān)測(cè)幾個(gè)月內(nèi)各組的死亡率。在蝦的養(yǎng)殖歷史上曾有過高的死亡率。與對(duì)照組相比，當(dāng)蝦浸于含卩-葡聚糖的溶液中時(shí)，以及當(dāng)該蝦隨后用含p-葡聚糖的飼料養(yǎng)殖時(shí)，預(yù)期來自實(shí)施例1和2的各酵母P-l,3-l,6-葡聚糖刺激蝦的免疫應(yīng)答。由于酵母P-葡聚糖對(duì)先天免疫系統(tǒng)的剌激作用，預(yù)計(jì)浸于和用酵母P-葡聚糖飼料伺養(yǎng)的虎蝦組生長(zhǎng)得更快，并預(yù)計(jì)其死亡率低于對(duì)照組。實(shí)施例13(預(yù)示性)實(shí)施例2富含p-葡聚糖的產(chǎn)品在濕疹治療中的用途選定一組患有濕疹且對(duì)當(dāng)前接受的皮膚洗液治療不響應(yīng)的兒童，用1%含實(shí)施例2的富含P-葡聚糖的產(chǎn)品的懸浮液進(jìn)行治療。每天施用洗液兩次。皮膚科醫(yī)生每周評(píng)價(jià)皮膚的病變及疼痛的改良。預(yù)計(jì)P-葡聚糖洗液降低病變引發(fā)的疼痛并加快病變?nèi)乃俣取?shí)施例14(預(yù)示性)實(shí)施例2富含(3-葡聚糖的產(chǎn)品在健康快餐食品生產(chǎn)中的用途將來自實(shí)施例2的酵母P-葡聚糖提取物按1%(w/w)加到冰淇淋中以部分替換脂肪。P-葡聚糖加固了冰淇淋的硬度和外形，但并不影響其質(zhì)地。添加了卩-葡聚糖的冰淇淋所含卡路里少于不含(3-葡聚糖的冰淇淋。攝取這種添加后的冰淇淋，預(yù)計(jì)卩-葡聚糖會(huì)刺激腸道的先天免疫系統(tǒng)從而有益于消費(fèi)者的免疫狀況。將來自實(shí)施例2的酵母P-葡聚糖提取物按0.5%(w/w)及l(fā)%(w/w)加到餅干、快餐店及面包店項(xiàng)目(item)中。添加了P-葡聚糖的餅干、快餐店及面包店項(xiàng)目所含卡路里少于不含(3-葡聚糖的餅干、快餐店及面包店項(xiàng)目。攝取這種添加后的餅干、快餐店及面包店項(xiàng)目后，預(yù)計(jì)|3-葡聚糖刺激腸道的先天免疫系統(tǒng)從而有益于消費(fèi)者的免疫狀況。盡管已經(jīng)說明并例證了本發(fā)明的一些特性，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解能夠在本發(fā)明描述的基礎(chǔ)上進(jìn)行各種改變，包括變化、填加及省略。所以，意指這些改變同樣包括在本發(fā)明中，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求在法律上的最廣泛解釋所限制。本文引用的所有專利、出版物及參考文獻(xiàn)均全文并入本文作為參考。在本公開文本與并入的專利、出版物及參考文獻(xiàn)互相沖突的情況下，應(yīng)該參照本公開文本。權(quán)利要求1.一種處理微生物細(xì)胞的方法，其包括(a)使所述微生物細(xì)胞自溶，以釋放微生物細(xì)胞壁；(b)用外源的蛋白酶溫育所述微生物細(xì)胞壁；(c)將所述微生物細(xì)胞壁分離為富含葡聚糖的組分和富含甘露聚糖的組分；以及(d)超濾步驟(c)的富含甘露聚糖組分，以形成濾液和滲余物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物包括酵母、真菌、細(xì)菌或植物中的至少一種。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞包括酵母細(xì)胞。4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的蛋白酶在步驟(c)之前被滅活。5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的溫育在pH9到10、溫度50°C到65°C時(shí)進(jìn)行。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述滲余物包含甘露聚糖，并且其中至少85%(w/w)的所述甘露聚糖的分子量至少為10,000Da。7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)在pH4到8進(jìn)行。8.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)進(jìn)行24到36小時(shí)。9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)在35°C到55°C的溫度下進(jìn)行。10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在動(dòng)物飼料中使用步驟(c)的富含葡聚糖的組分。11.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在動(dòng)物飼料中使用步驟(b)的經(jīng)蛋白酶處理的細(xì)胞壁。12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在動(dòng)物飼料中使用步驟(d)的濾液。13.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在選自食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)輔助品的產(chǎn)品中使用步驟(C)的富含葡聚糖的組分。14..權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括在選自食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)輔助品的產(chǎn)品中使用步驟(b)的經(jīng)蛋白酶處理的細(xì)胞壁。15.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在選自食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)輔助品的產(chǎn)品中使用步驟(c)的富含葡聚糖的組分中使用步驟(d)的濾液。16.—種處理酵母細(xì)胞的方法，其包括(a)使酵母細(xì)胞在50°C到65°C的溫度自溶以釋放酵母細(xì)胞壁；(b)在pH9到IO用外源的蛋白酶溫育該酵母細(xì)胞壁；以及(c)用包含選自淀粉酶、脂肪酶及其組合的至少一種的酶溫育步驟(b)的經(jīng)蛋白酶處理的細(xì)胞壁。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述酵母細(xì)胞包括啤酒酵母細(xì)胞。18.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括在動(dòng)物飼料中使用步驟(c)的經(jīng)酶處理的細(xì)胞壁。19.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括在選自食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)輔助品的產(chǎn)品中使用步驟(c)的經(jīng)酶處理的細(xì)胞壁。20.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(c)在pH4到6進(jìn)行。21.權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括(d)將步驟(c)的經(jīng)酶處理的細(xì)胞壁分離成富含葡聚糖的組分和富含甘露聚糖的組分。22.權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括在動(dòng)物飼料中使用步驟(d)的富含葡聚糖組分。23.權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括在選自食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)輔助品的產(chǎn)品中使用步驟(d)的富含葡聚糖的組分。24.權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括(e)超濾步驟(d)的富含甘露聚糖的組分，以形成濾液和滲余物。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述滲余物包含甘露聚糖，并且其中至少85%(w/w)的所述甘露聚糖的分子量至少為10,000Da。26.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括在動(dòng)物飼料中使用步驟(e)的濾液。27.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括在選自食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)輔助品的產(chǎn)品中使用步驟(e)的濾液。28.—種包含a-甘露聚糖的組合物，其中總a-甘露聚糖的至少85%(w/w)具有10,000Da或更高的分子量。29.包含權(quán)利要求28的組合物的食品增補(bǔ)劑、藥品、化妝品或營(yíng)養(yǎng)輔助品。30.包含權(quán)利要求28的組合物的動(dòng)物詞料。31.權(quán)利要求30的動(dòng)物詞料，其中所述動(dòng)物飼料為狗、貓、豬、魚或牛飼料。全文摘要本發(fā)明公開了制備酵母&bgr，-葡聚糖和甘露聚糖制備物的方法。所述方法使用自溶處理，然后用高PH蛋白酶進(jìn)行酶處理，或者用高PH蛋白酶進(jìn)行酶處理后，繼之以包括淀粉酶、脂肪酶其組合中的至少一種酶進(jìn)行處理。文檔編號(hào)C08B37/00GK101184780SQ200680015026公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2006年5月5日優(yōu)先權(quán)日2005年5月5日發(fā)明者J·J·塞德馬克申請(qǐng)人:森馨香料公司