倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種倍硫磷分子印跡固相萃取柱的制備方法及應(yīng)用，屬分析化學(xué)領(lǐng)域。其以倍硫磷為模板分子，將倍硫磷溶解于致孔劑中，加入功能單體后于低溫下預(yù)聚合。再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，將混合液滴入預(yù)先準(zhǔn)備好的聚乙烯醇溶液中，采用懸浮聚合法制備倍硫磷分子印跡聚合物微球。所得聚合物微球經(jīng)漂洗、過篩和干燥等一系列處理后，濕法填充于固相萃取柱空柱管中，經(jīng)丙酮和甲醇依次潤洗后用于食品中殘留倍硫磷的選擇性吸附、富集和純化。本發(fā)明所制備的分子印跡固相萃取柱較已有的固相萃取柱具有特異性強(qiáng)、制備簡便、后處理簡單、聚合物表面識別位點破壞^少，識別性能好、成本低廉、所需儀器和反應(yīng)條件；容易實現(xiàn)等特點。5
【專利說明】倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體是一種倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法及其在食品中倍硫磷殘留分析時樣品前處理方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]有機(jī)磷類藥物廣泛用于控制或消滅農(nóng)業(yè)、林業(yè)病蟲害以及畜禽體表寄生蟲，該類化合物進(jìn)入有機(jī)體，對生物體內(nèi)膽堿酯酶有抑制作用，抑制膽堿酯酶使其失去分解乙酰膽堿的能力，造成乙酰膽堿積累，引起神經(jīng)功能紊亂，從而導(dǎo)致對肌體的損害。倍硫磷是有機(jī)磷類藥物的一種，屬于廣譜、速效和中等毒力的有機(jī)磷殺蟲劑，對螨類也有較好效果，具有觸殺和胃毒作用，滲透性較強(qiáng)，有一定的內(nèi)吸作用，殘效期長。為了避免倍硫磷的殘留，許多國家和國際組織建立了其殘留檢測方法并對其殘留限量作了規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定了牛、豬和禽可食性產(chǎn)品中的最大殘留限量為lOOyg/kg。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763 -2012規(guī)定倍硫磷在蔬菜、谷物和水果中的最大殘留限量為50 μ g/kg，在油料制品中的最大殘留限量為10 μ g/kg。
[0003]倍硫磷的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，半衰期短，不易在作物、動物和人體內(nèi)蓄積，因而得到廣泛使用。但由于使用范圍越來越廣，使用頻率越來越高，施用量越來越大，已成為食品中殘留最為嚴(yán)重的化學(xué)藥物之一。根據(jù)倍硫磷的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性，目前常用的檢測方法有:酶抑制法、酶聯(lián)免疫分析法和儀器分析方法等。酶抑制法操作簡便，速度快，不需昂貴的儀器，特別適合現(xiàn)場檢測及大批樣品的篩選檢測，但靈敏度較差，并且對各類不同有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的靈敏度不同，重復(fù)性、回收率還有待提高。酶聯(lián)免疫法檢測的靈敏度高，精確度高，方法的特異性強(qiáng)，方便快捷，但是對試劑的選擇性高，對于小分子物質(zhì)進(jìn)行檢測時要合成相應(yīng)的人工抗原，抗原的合成不僅工作量大、周期長，而且結(jié)構(gòu)類似的藥物或待測代謝物可能發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)。儀器分析方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中，薄層色譜法操作簡單，便于掌握，定性準(zhǔn)確，但是定量測定準(zhǔn)確度和靈敏度低，是一種常用的定性測定方法。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的檢測靈敏度雖然很高，但價格相對昂貴，而色譜法檢出限較高，不能滿足痕量農(nóng)藥殘留和出口貿(mào)易檢測的實際需要，且在分析之前常需要進(jìn)行樣品的凈化和富集。由于許多食品和農(nóng)產(chǎn)品的樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)較多，前處理步驟比較繁瑣。因此，亟需開發(fā)選擇性強(qiáng)和分離效果好的樣品前處理方法。
[0004]固相萃取(Solid Phase Extract1n, SPE)是近年來迅速發(fā)展起來的專門用于樣品純化和濃縮的一項技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于多種復(fù)雜樣品的前處理過程中。與液液萃取相比，SPE可以更有效地將分析物與干擾物分離，減少樣品前處理過程，使操作更加簡便、高效、省時和省力。SPE進(jìn)行萃取的機(jī)理就是依靠目標(biāo)物質(zhì)與填料表面活性基團(tuán)的一系列作用力來進(jìn)行樣品的凈化，萃取的效果在很大程度上依賴于固相填充劑的選擇。填充劑表面存在一系列活性基團(tuán)，傳統(tǒng)的SPE填充材料主要為氧化鋁、CS和C18硅烷等，這一類傳統(tǒng)填充材料的選擇性較差，在對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集的同時，樣品中的大量基質(zhì)以及非目標(biāo)分子的干擾物質(zhì)也同時被富集，這就會導(dǎo)致洗脫液中含有不同含量的基質(zhì)和雜質(zhì)，這些物質(zhì)會對色譜分離和分析產(chǎn)生干擾，影響樣品分析的效果。分子印跡技術(shù)作為一種能夠獲得在空間和結(jié)合位點上與某種分子完全匹配的聚合物制備技術(shù)，它具有構(gòu)效的預(yù)定性、識別的特異性和廣泛的實用性，可以特異性地識別萃取物，而且制備方法簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，能夠適用于多種環(huán)境條件，比較適合用作SPE填料。將分子印跡技術(shù)與SPE相結(jié)合，綜合二者的優(yōu)點，開發(fā)基于分子印跡聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)的SPE方法,將簡化樣品的前處理過程，減少檢測過程中的干擾，該方法已在化學(xué)物的殘留分析中展現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。
[0005]本發(fā)明采用懸浮聚合法制備倍硫磷的MIPs，所制備的分子印跡微球經(jīng)漂洗、過篩、干燥和洗脫等一系列處理后，再通過高效液相色譜法對其性能進(jìn)行評價分析即可得到識別性較好的聚合物材料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有固相萃取方法的不足，采用懸浮聚合法制備倍硫磷MIPs微球，用作固相萃取的萃取介質(zhì)，用于食品樣品中倍硫磷的分離、富集和痕量檢測。該固相萃取柱具有專一識別性、制備過程簡單、反應(yīng)條件易于實現(xiàn)等優(yōu)點。
[0007]為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法，包括以下步驟:
1)將模板分子溶于致孔劑中，然后加入功能單體，超聲混勻5min，放入4°C冰箱進(jìn)行預(yù)聚合24h，得到預(yù)聚合體系；
所述的模板分子為倍硫磷，致孔劑為氯仿，功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯基吡唆、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡唆、烯丙基胺、亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(雙甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的一種或兩種的組合；所述的模板分子與功能單體的比例為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為20mmol/L-70mmol/L ；
2)向步驟I)制得的預(yù)聚合體系中加入交聯(lián)劑與引發(fā)劑，超聲清洗儀中進(jìn)行超聲5min，混勻后通入氮?dú)?min，然后在氮?dú)鈿夥栈蛘婵諣顟B(tài)下密封；
所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇雙丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600)二甲基丙烯酸酯、馬來松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇單酯、六亞甲基二異氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一種，加入量為功能單體的5倍，所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異戊腈、偶氮二環(huán)己基甲腈和偶氮二異丁酸二甲酯中的任意一種，加入量為步驟I)所加功能單體摩爾量的0.5-1.5倍；
3)按照分散劑與步驟I)所加功能單體比值為lOmL/mmol-lOOmL/mmol的比例取一定量的分散劑置于四口燒瓶中；
所述的分散劑為，甘油、硅油或聚乙烯醇1788水溶液。其中聚乙烯醇1788水溶液配制時，先將聚乙烯醇1788加入蒸餾水中，加熱至90°C _95°C使其溶解，形成6%_9%的聚乙烯醇1788溶液，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)至四口燒瓶中；
4)將2)所得的反應(yīng)體系在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加入步驟3)的四口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為45°C _65°C，聚合時間為8h-36h，得到微懸浮乳液，即為MIPs ；
5)將4)中的MIPs在丙酮中用濕篩法過篩，對顆粒大小進(jìn)行分級，除去粒徑較小和較大的微球，選出直徑50 μ m-70 μ m的顆粒，用濾紙包好，用體積比為9:1的甲醇-乙酸混合溶液進(jìn)行索氏抽提，期間進(jìn)行取樣，對索氏抽提液進(jìn)行高效液相色譜分析，測定模板分子的含量，直至模板分子無法檢出，停止索氏抽提；然后將得到的聚合物45°C烘干至恒重，得到對倍硫磷具有識別能力的MIPs微球；
6)稱取5)中制備的MIPs100mg-200mg,用濕法填裝固相萃取柱,依次用甲醇和丙酮對柱子進(jìn)行潤洗，即得到倍硫磷分子印跡固相萃取小柱，然后封于錫箔袋中備用。
[0008]所述步驟3)中聚乙烯醇1788溶液的質(zhì)量濃度為7%_8%。
[0009]所述步驟4)中的引發(fā)溫度為50°C _60°C，聚合時間為12h_24h。
[0010]所述步驟4)中的攪拌速度為400r/min。
[0011]倍硫磷分子印跡固相萃取小柱用于食品中殘留倍硫磷的選擇性吸附和富集時，首先用3mL-7mL甲醇和3mL_7mL甲醇-水溶液(1: 9，v/v)潤洗，2mL-7mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)平衡，加入濃縮后的樣品提取液lmL-5mL,經(jīng)3mL_8mL甲醇-水溶液(1:9, v/v)淋洗后，用5mL-10mL甲醇-乙酸混合液(9:1, v/v)洗脫。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明所提供的分子印跡固相萃取小柱可用于食品中倍硫磷的分離與富集，其制備過程操作簡單、方便快速，對極端環(huán)境耐受力強(qiáng)，較適合基層單位檢驗或現(xiàn)場處理樣品時使用。
[0013]2、本發(fā)明制得的倍硫磷分子印跡固相萃取小柱與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，所需生產(chǎn)成本低，聚合物的后處理簡單，無需研磨和裝柱，不會破壞聚合物的結(jié)構(gòu)，且所得SPE固定相的大孔結(jié)構(gòu)可以保證較快的傳質(zhì)速率和較低的柱壓，制得的萃取小柱對樣品中雜質(zhì)的凈化效果好，檢測結(jié)果的精密度高，專一性強(qiáng)，回收率高且穩(wěn)定性好，適合推廣使用。
[0014]3、制備過程中先將倍硫磷與功能單體在氯仿中4°C環(huán)境下預(yù)聚合，之后再加入交聯(lián)劑和偶氮二異丁腈，并滴加至分散劑中，形成懸浮聚合體系，引發(fā)聚合，獲得了粒度均勻的MIPs微球。傳統(tǒng)的本體聚合法所制備的聚合物需要研磨、破碎和篩分等復(fù)雜的后處理工藝，所得顆粒為無定型顆粒，產(chǎn)率較低，這樣做不僅費(fèi)時費(fèi)力，而且會破壞印跡識別位點和空間結(jié)構(gòu)，使得聚合物的吸附容量、特異性、印跡和識別效率均有不同程度地降低。為了克服上述缺陷，本發(fā)明采用懸浮聚合法所制備MIPs的微球，省去了復(fù)雜的后處理工序，提高了產(chǎn)率，避免了印跡識別位點的人為破壞。由于微球的比表面積較無定形顆粒大，其吸附的速率較快，特異性吸附的容量也較大，這就使得基于微球的分子印跡固相萃取小柱具有更高的分離效率和更好的分離效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的實施例1中倍硫磷分子印跡固相萃取柱在蔬菜樣品檢測中回收率的測定結(jié)果圖表；
圖2為本發(fā)明的實施例2中倍硫磷分子印跡固相萃取柱在雞肉樣品檢測中回收率的測定結(jié)果圖表；
圖3為本發(fā)明的實施例3中倍硫磷分子印跡固相萃取柱在豬肉樣品檢測中回收率的測定結(jié)果圖表；

【具體實施方式】
[0016]以下是本發(fā)明的【具體實施方式】，下述實施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0017]一種倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法，包括以下步驟:
1)將模板分子溶于致孔劑中，然后加入功能單體，超聲混勻5min，放入4°C冰箱進(jìn)行預(yù)聚合24h，得到預(yù)聚合體系；
所述的模板分子為倍硫磷，致孔劑為氯仿，功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯基吡唆、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡唆、烯丙基胺、亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(雙甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的一種或兩種的組合；所述的模板分子與功能單體的比例為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為20mmol/L-70mmol/L ；
2)向步驟I)制得的預(yù)聚合體系中加入交聯(lián)劑與引發(fā)劑，超聲清洗儀中進(jìn)行超聲5min，混勻后通入氮?dú)?min，然后在氮?dú)鈿夥栈蛘婵諣顟B(tài)下密封；
所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇雙丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600)二甲基丙烯酸酯、馬來松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇單酯、六亞甲基二異氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一種，加入量為功能單體的5倍，所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異戊腈、偶氮二環(huán)己基甲腈和偶氮二異丁酸二甲酯中的任意一種，加入量為步驟I)所加功能單體摩爾量的0.5-1.5倍；
3)按照分散劑與步驟I)所加功能單體比值為10mL/mmol-100mL/mmol的比例取一定量的分散劑置于四口燒瓶中；
所述的分散劑為，甘油、硅油或聚乙烯醇1788水溶液。其中聚乙烯醇1788水溶液配制時，先將聚乙烯醇1788加入蒸餾水中，加熱至90°C _95°C使其溶解，形成6%_9%的聚乙烯醇1788溶液，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)至四口燒瓶中；
4)將2)所得的反應(yīng)體系在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加入步驟3)的四口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為45°C _65°C，聚合時間為8h-36h，得到微懸浮乳液，即為MIPs ；
5)將4)中的MIPs在丙酮中用濕篩法過篩，對顆粒大小進(jìn)行分級，除去粒徑較小和較大的微球，選出直徑50μπι-70μπι的顆粒，用濾紙包好，用體積比為9:1的甲醇-乙酸混合溶液進(jìn)行索氏抽提，期間進(jìn)行取樣，對索氏抽提液進(jìn)行高效液相色譜分析，測定模板分子的含量，直至模板分子無法檢出，停止索氏抽提；然后將得到的聚合物45°C烘干至恒重，得到對倍硫磷具有識別能力的MIPs微球；
6)稱取5)中制備的MIPs100mg-200mg,用濕法填裝固相萃取柱,依次用甲醇和丙酮對柱子進(jìn)行潤洗，即得到倍硫磷分子印跡固相萃取小柱，然后封于錫箔袋中備用。
[0018]所述步驟3)中聚乙烯醇1788溶液的質(zhì)量濃度為7%_8%。
[0019]所述步驟4)中的引發(fā)溫度為50°C _60°C，聚合時間為12h_24h。
[0020]所述步驟4)中的攪拌速度為400r/min。
[0021]倍硫磷分子印跡固相萃取小柱用于食品中殘留倍硫磷的選擇性吸附和富集時，首先用3mL-7mL甲醇和3mL_7mL甲醇-水溶液(1: 9，v/v)潤洗，2mL-7mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)平衡，加入濃縮后的樣品提取液lmL-5mL,經(jīng)3mL_8mL甲醇-水溶液(1:9, v/v)淋洗后，用5mL-10mL甲醇-乙酸混合液(9:1, v/v)洗脫。
[0022]實施例1
(一).倍硫磷MIPs的制備
稱取7g聚乙烯醇1788加入到10mL蒸餾水中，于90°C _95°C的溫度下溶解，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)入250mL的四口燒瓶中。準(zhǔn)確稱取Immol倍硫磷溶于15mL氯仿中，加入功能單體甲基丙烯酸4mmol，使其充分溶解，超聲清洗儀中超聲混勻5min，置于4°C冰箱進(jìn)行預(yù)聚合24h，使其形成模板分子-功能單體預(yù)聚合體系。然后，向預(yù)聚合體系中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯20mmol，引發(fā)劑偶氮二異丁腈0.Smmol，超聲混勻5min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢將其滴入上述四口燒瓶中，在400r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行機(jī)械攪拌，水浴引發(fā)溫度為60°C，引發(fā)聚合24h形成微懸浮乳液，所得微懸浮乳液在丙酮中用濕篩法過分級篩，選擇直徑為50 μ m- 70 μ m的顆粒，用定量濾紙包好，以體積比為9:1的甲醇-乙酸混合溶液在索氏抽提器中進(jìn)行模板分子的洗脫，期間定時取樣，采用高效液相色譜法檢測提取液中模板分子的含量，直至無模板分子出現(xiàn)時，停止抽提，將提取得到的物質(zhì)于45°C烘干至恒重，即可得到模板分子的印跡聚合物微球(Molecular Imprinting Polymer, MIP)。
[0023]于本實施例中作為對照的空白分子印跡聚合物(Non-molecular ImprintingPolymer, NIP)的制備除不加模板分子，不進(jìn)行預(yù)聚合外，其余步驟同上。
[0024](二).倍硫磷MIPs吸附性能的表征
靜態(tài)平衡吸附量的測定，分別在1mL的塑料離心管中準(zhǔn)確加入50mg的MIPs和5mL
0.5mmol/L倍硫磷的氯仿溶液，經(jīng)旋渦后將其在搖床上振蕩24h (搖床溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為200r/min),然后以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min,取離心液ImL加氯仿稀釋至10mL。用高效液相色譜法在模板分子的最大吸收波長處定點測定其平衡濃度。根據(jù)吸附前后溶液中模板分子濃度的變化，計算聚合物對模板分子的吸附量Qw，并平行測定三次取平均值。依式(I)計算NIP的靜態(tài)平衡吸附量為0.026mmol/g, MIP的靜態(tài)吸附量為0.072mmol/g。
[0025]Q = (C O',/ ⑴
Vws0 - sJ /m
式中Qw為靜態(tài)平衡吸附量(mmol/g) ;(^為底物起始濃度(mmol/L) ;CS為吸附平衡時底物的濃度(mmol/L) ；V為底物溶液的體積(mL) ；m為MlP或NIP的加入量(mg)。
[0026]根據(jù)上述的測定結(jié)果計算MIPs的分離系數(shù)和印跡因子，用式(2)計算底物在聚合物和溶液兩相中的分離系數(shù)K，結(jié)果表明，NIP的分離系數(shù)為0.35，MIP的分離系數(shù)為2.57。
[0027]K = Cp / ⑵
/tS:聚合物結(jié)合底物的濃度(ymol/g) ;CS:溶液中底物的平衡濃度(ymol/mL)。由式(3)計算MIPs的印跡因子I為7.32。
[0028]I =(3)
Kpmip =MIP的分離系數(shù)；Kpnip:NIP的分離系數(shù)。
[0029]將模板分子倍硫磷的氯仿溶液作為吸附液，在25°C下準(zhǔn)確稱取10份50mg的MIPs，測定它們對不同濃度的模板分子溶液的吸附量，以吸附量對模板分子濃度作圖，繪制吸附等溫曲線，將獲得的數(shù)據(jù)用于式(4)Scatchard分析。再根據(jù)Scatchard曲線的斜率與截距求出MIPs的Qmax與Kd。結(jié)果顯示MIP存在兩類吸附位點，一類是具有高結(jié)合能和高選擇性的結(jié)合位點，另一類是具有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(其Kdi=0.30X 1^ymol/L，Qmaxl=2500.67 μ mol/g ；KD2=14.8 X 1-2 μ mol/L, Qmax2=5105.44ymol/g)0 而 NIP 僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(Kd=3.3 X KT1 μ mol/L, Qmax=6104.34 μ mol/g)。
[0030]Scatcliard 方程:5 = _9l⑷
公式(4)中Kd表示結(jié)合位點的平衡解離常數(shù)，C表示模板分子的平衡濃度，Qfflax表示最大表觀吸附量。
[0031](三).分子印跡固相萃取柱的制備
在一 3mL的固相萃取柱空柱管中放入下層篩板，將其放到固相萃取真空裝置上，封堵空余的接口，打開真空泵，用3mL-5mL甲醇潤洗，待用。準(zhǔn)確稱量倍硫磷MIP 200mg，用3mL異丙醇調(diào)制成混懸液，徐徐倒入預(yù)先準(zhǔn)備得空白固相萃取小柱中，邊加邊輕輕敲打柱體，待勻漿液快抽干前放入上層的篩板并壓緊。依次用1mL丙酮和1mL甲醇沖洗柱子，最后對其標(biāo)記，放入錫箔袋中密封備用。
[0032](四).分子印跡固相萃取柱在蔬菜樣品檢測中回收率的測定
0.蔬菜中倍硫磷的提取
稱取5g空白蔬菜樣品，置于均質(zhì)杯中，加入丙酮和石油醚各40mL，添加倍硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，使其在樣品中的濃度達(dá)到GB2763-2012中所規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、I倍和2倍，而后于均質(zhì)機(jī)上高速均質(zhì)3min，上清液經(jīng)過濾后，移入250mL分液漏斗中，加入150mL 20g/L硫酸鈉水溶液，充分搖勻，靜置分層，將下層溶液移入另一 250mL分液漏斗中，用40mL的石油醚萃取兩次，合并石油醚層，過無水硫酸鈉層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用ImL石油醚溶解殘渣后備用。
[0033]2).蔬菜中倍硫磷的凈化
分子印跡固相萃取柱首先用5mL甲醇和5mL甲醇-水溶液(1:9, v/v)依次潤洗,3mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)平衡。加入濃縮后的樣品提取液lmL，經(jīng)4mL甲醇-水溶液(1: 9，v/V)淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v) 6mL洗脫。洗脫液過0.22 μ m的有機(jī)膜后45°C減壓蒸干，殘渣用ImL的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。
[0034]3).高效液相色譜法測定回收率
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用分析天平準(zhǔn)確稱取倍硫磷對照品，用甲醇溶解定容，分別配成濃度為 0.5 μ g/mL、1.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL、10.0 μ g/mL、20.0 μ g/mL 和 40.0 μ g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。每個濃度點做5個重復(fù)，共重復(fù)5天，做校正曲線。 色譜條件:色譜柱Agilent Zorbax SB C18, 250_X 4.6mm (1.d.),流動相甲醇-水(80:20, v/v)，檢測波長250nm，進(jìn)樣量20yL，柱溫為室溫，流速lmL/min。經(jīng)測定，其在蔬菜中的回收率見圖表I所示(每個樣品平行測定3次)。
[0035]實施例2
(一).倍硫磷MIPs的制備
制備的基本過程同實施例1，所用的分散劑為150mL的硅油，所用致孔劑用量為20mL，功能單體丙烯酰胺6mmol，交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯30mmol，所述的引發(fā)劑為偶氮二異庚腈0.7mmol，引發(fā)聚合溫度55°C，聚合時間12h，索氏萃取洗脫的時間15h。
[0036](二).倍硫磷MIPs吸附性能的表征
表征方法同實施例1，結(jié)果表明，NIP的靜態(tài)平衡吸附量為0.022mmol/g, MIP的靜態(tài)吸附量為0.048mmol/g, NIP的分離系數(shù)為0.28，MIP的分離系數(shù)為0.92，印跡因子I為3.27。在MIP上存在兩類吸附位點，一類是高選擇性的結(jié)合位點，另一類是低選擇性的結(jié)合位點(其 Kdi=0.42Xl(T2ymol/L，Qmaxl=2874.33 μ mol/g ;KD2=11.2X 1(Γ2 μ mol/L，Qmax2=4933.21 μ mol/g)。而NIP僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(KD=5.2X ΙΟ—1 μ mol/L，Qmax=6833.51 μ mol/g)。(三).分子印跡固相萃取柱的制備
稱取150mg的MIP裝入3mL的固相萃取柱空柱管中，根據(jù)實施例1中的裝柱方法制備分子印跡固相萃取柱，裝好后依次用6mL丙酮和6mL甲醇潤洗。最后對柱子標(biāo)記，放入錫箔袋中密封待用。
[0037](四).分子印跡固相萃取柱在雞肉樣品檢測中回收率的測定 I).雞肉中倍硫磷的提取
稱取勻漿后試樣5g于50mL具塞離心管中，加入乙酸乙酯20mL，添加倍硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，使其在樣品中的濃度達(dá)到農(nóng)業(yè)部235號公告中所規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、I倍和2倍，潤旋混勻Imin,振蕩15min, 5000r/min離心1min,上清液轉(zhuǎn)入雞心瓶中，然后再加入乙酸乙酯1mL到具塞離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，45°C水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。殘留物用2mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)溶解后備用。
[0038]2).雞肉中倍硫磷的凈化
分子印跡固相萃取柱首先用5mL甲醇和5mL甲醇水依次潤洗，5mL乙腈-水溶液(1: 1，v/v)平衡。加入濃縮后的樣品提取液lmL，經(jīng)5mL甲醇-水溶液(1: 9，v/v)淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v) SmL洗脫。洗脫液過0.22 μ m的有機(jī)膜后45°C減壓蒸干，殘渣用ImL的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。
[0039]3).高效液相色譜法測定回收率
采用高效液相色譜法對其回收率進(jìn)行測定和計算(每個樣品平行測定3次)，結(jié)果見圖表2所示，所用色譜條件同實施例1。
[0040]實施例3
(一).倍硫磷MIPs的制備
制備的基本過程同實施例1，所用的分散劑為200mL的甘油，所用致孔劑用量為30mL，功能單體為4-乙烯基卩比唳7mmol,交聯(lián)劑季戍四醇三丙烯酸酯35mmol,引發(fā)劑偶氮二異戍腈1.2mmol，引發(fā)聚合溫度50°C，聚合時間18h，索氏萃取洗脫的時間24h。
[0041](二).倍硫磷MIPs吸附性能的表征表征方法同實施例1，結(jié)果表明，NIP的靜態(tài)平衡吸附量為0.024mmol/g, MIP的靜態(tài)吸附量為0.028mmol/g, NIP的分離系數(shù)為0.32，MIP的分離系數(shù)為0.39，印跡因子I為1.23。在MIP上存在兩類吸附位點，一類是高選擇性的結(jié)合位點，另一類是低選擇性的結(jié)合位點(其 Km=0.54 X KT1 μ mol/L, Qmaxl=3144.42 μ mol/g ；Kd2=1.23 X KT1 μ mol/L,Qmax2=6548.34 μ mol/g)。而NIP僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(KD=8.7X ΙΟ—1 μ mol/L, Qmax=9247.44 μ mol/g)。
[0042](三).分子印跡固相萃取柱的制備
稱取180mg的MIP裝入3mL的固相萃取柱空柱管中，根據(jù)實施例1中的裝柱方法制備分子印跡固相萃取柱,依次用7mL丙酮和7mL甲醇潤洗。然后對柱子標(biāo)記,密封備用。
[0043](四).分子印跡固相萃取柱在豬肉樣品檢測中回收率的測定
樣品的處理方法同實施例2，樣品經(jīng)過勻質(zhì)后，添加倍硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，使其在樣品中的濃度達(dá)到農(nóng)業(yè)部235號公告中所規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、I倍和2倍，而后采用實施例2中的方法進(jìn)行樣品的提取和凈化，用高效液相色譜法對其回收率進(jìn)行測定和計算(每個樣品平行測定3次)，結(jié)果見圖表3所示，所用色譜條件同實施例1。
【權(quán)利要求】
1.倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于，制備步驟為: 1)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，超聲處理5min混勻，放入4°C冰箱進(jìn)行預(yù)聚合24h，得到預(yù)聚合體系； 所述的模板分子為倍硫磷；所述的致孔劑為氯仿；所述的功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡啶、烯丙基胺、亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(雙甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的任意一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為 20mmol/L_ 70mmol/L ； 2)向步驟I)制得的預(yù)聚合體系中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，超聲處理5min，充分混合后，通入氮?dú)?min，并在氮?dú)鈿夥栈蛘婵諣顟B(tài)下密封； 所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇雙丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、馬來松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇單酯、六亞甲基二異氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一種，交聯(lián)劑的加入量為步驟I)所加功能單體摩爾量的5倍； 所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異戊腈、偶氮二環(huán)己基甲腈和偶氮二異丁酸二甲酯中的任意一種，加入量為步驟I)所加功能單體摩爾量的0.5-1.5倍； 3)按照分散劑與步驟I)所加功能單體比值為lOmL/mmol-lOOmL/mmol的比例取一定量的分散劑置于四口燒瓶中； 所述的分散劑為甘油、娃油或聚乙烯醇水溶液。
2.其中聚乙烯醇水溶液配制時，先將聚乙烯醇加入蒸餾水中，加熱至90°C?95°C使其溶解，制得質(zhì)量濃度為6%-9%的聚乙烯醇溶液，冷卻至室溫，即完成制備； 4)將步驟2)所得的反應(yīng)體系在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加入步驟3)的四口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為45°C _65°C,聚合時間為8h-36h,得到微懸浮乳液，即為印跡聚合物； 5)將步驟4)得到的印跡聚合物在丙酮中用濕篩法過分級篩，篩選出直徑為50 μ m-70 μ m的顆粒，并用濾紙包好,采用體積比為9:1的甲醇-乙酸混合溶液進(jìn)行索氏抽提，期間定時對新流出的提取液進(jìn)行取樣，并采用高效液相色譜分析取樣得到的提取液中倍硫磷的含量，直至提取液中無倍硫磷時停止索氏提取，然后，將濾紙中剩余的物質(zhì)在45°C烘干至恒重，得到微球狀的對倍硫磷具有識別能力的分子印跡聚合物； 6)稱取步驟5)所制備的分子印跡聚合物100mg-200mg,用濕法填裝固相萃取柱,依次用甲醇和丙酮對柱子進(jìn)行潤洗，然后封于錫箔袋中，即得到倍硫磷分子印跡固相萃取小柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中聚乙烯醇溶液的質(zhì)量濃度為7%-8%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中的引發(fā)溫度為50°C _60°C，聚合時間為12h-24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的倍硫磷分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中的攪拌速度為400r/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的倍硫磷分子印跡固相萃取小柱在食品殘留倍硫磷的選擇性吸附和富集中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N30/08GK104209103SQ201410362441
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】李兆周, 李道敏, 張小帆, 侯玉澤, 高紅麗, 曹力, 陳秀金, 李松彪, 呂璞, 張成博, 張臘梅, 雍雪萍, 俞嘉偉, 王爽 申請人:河南科技大學(xué)