專利名稱：常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體是常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法及其在動物性食品中殘留分析時樣品的純化和富集。
背景技術(shù)：
常山酮是從我國中藥常山中提取出的常山堿的衍生物，是一種廣譜抗寄生蟲藥， 對雞的柔嫩、毒害、堆型、變位、巨型和布氏艾美耳球蟲均有效，對球蟲的子孢子、第一代和第二代裂殖體均有明顯的抑殺作用；對大多數(shù)革蘭氏陽性菌也有效，且無交叉耐藥性。常山酮氫溴酸鹽作為一種飼料添加劑廣泛用于防治家禽的球蟲病。在我國，氫溴酸常山酮被允許以3 mg/kg的濃度添加在飼料里，其休藥期為4天。為了避免常山酮的殘留，許多國家建立了其殘留檢測方法并對其殘留限量作了規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定常山酮在牛肌肉、皮/脂、肝和腎組織中的最高殘留限量分別為10// g/kg、25/z g/kg、30/z g/kg和30// g/ kg，在雞/火雞的肌肉、皮/脂和肝組織中的最高殘留限量分別為100// g/kgUOO// g/kg和 130// g/kg。常山酮在動物組織中的殘留對人類健康和環(huán)境生態(tài)均有潛在的危害。美國農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)督署已將該藥列入國家殘留檢測計劃，定期對其殘留進行監(jiān)控。目前，常山酮殘留的檢測方法中的儀器方法主要為高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，其檢測能力雖然較強，但檢測方法和樣品的前處理繁瑣、費時、費力、影響因素眾多?；诟黝惿镄钥贵w的免疫分析技術(shù)需要制備結(jié)合抗原和有特異性識別作用的抗體，制備過程較為復(fù)雜，同時分析過程中的穩(wěn)定性較差，精密度較低。固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)是近年來迅速發(fā)展起來的專門用于樣品純化和濃縮的一項技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于多種復(fù)雜樣品的前處理過程中。與液液萃取相比， SPE可以更有效地將分析物與干擾物分離，減少樣品前處理過程，使操作更加簡便、高效、省時、省力。SPE處理的效果很大程度上依賴于其填料的種類，已有的填料包括活性炭、硅膠和氧化鋁等，這些傳統(tǒng)填料中吸附劑與目標分子之間主要依靠一些非特異性的分子間作用力而進行相關(guān)物質(zhì)的吸附。分子印跡技術(shù)作為一種能夠獲得在空間和結(jié)合位點上與某種分子完全匹配的聚合物制備技術(shù)，具有構(gòu)效的預(yù)定性、識別的特異性和廣泛的實用性?；诜肿佑≯E聚合物的固相萃取柱既具有對靶分子的特異性識別作用，又具有較好的穩(wěn)定性，能夠耐極端環(huán)境，制備簡便，成本廉價。將分子印跡聚合物用于待測物質(zhì)的選擇性吸附和富集較其他方法具有更為明顯的優(yōu)勢，已經(jīng)展現(xiàn)出誘人的開發(fā)和應(yīng)用前景。本發(fā)明采用氧化還原引發(fā)劑低溫引發(fā)制備常山酮的分子印跡聚合物微球，所制備的微球經(jīng)漂洗、過篩、干燥和洗脫等一系列處理后，再通過紫外分光光度法對其進行評價分析即可得到高效識別性能的聚合物材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有固相萃取方法的不足，提出一種常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法及其在動物性食品中常山酮殘留分析中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其步驟如下
1)先將聚乙烯醇400加入蒸餾水中，加熱至95°C使其溶解，形成濃度為3%-8%聚乙烯醇400溶液(優(yōu)選為4%_6%)，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)至三口燒瓶中；
2)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，得到混合溶液；所述的模板分子為常山酮，致孔劑為乙腈，功能單體為甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:3-6，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為2. 5mmol/L-5mmol/L ；
3)將步驟2)的混合溶液用超聲清洗儀超聲5min，混合均勻，放入4°C冰箱孵育Mh，得到預(yù)聚合體系；
4)將步驟3)的預(yù)聚合體系置于冰水浴中，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，然后用超聲清洗儀超聲5min，通入氮氣5min，并在氮氣氣氛或真空狀態(tài)下密封；所述的交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，作為優(yōu)選該交聯(lián)劑是三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入量為功能單體摩爾量的5倍，所述的引發(fā)劑是等摩爾比的過氧化苯甲酰和N， N- 二甲基苯胺，加入量為功能單體摩爾量的0. 2倍；
5)將步驟4)的反應(yīng)體系在攪拌和氮氣保護下慢慢滴加到步驟1)的三口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為10°C -30°C，聚合時間為^1-3 (優(yōu)選的引發(fā)溫度為18°C _25°C，聚合時間為12h-Mh)使其形成乳白色的微懸浮乳液，即為印跡聚合物；
6)將步驟5)中的印跡聚合物在丙酮中用濕篩法過分級篩，除去極少數(shù)粒徑較大和較小的微球，選取直徑為50//m-70//m的顆粒，用定量濾紙包好，用體積比為7:3的甲醇鹽酸混合溶劑索氏萃取，期間定時對提取液進行紫外掃描，直到無模板分子特征吸收時停止萃??； 然后將萃取后的聚合物微球60°C烘干至恒重，得到對常山酮具有識別能力的分子印跡聚合物；
7)稱取步驟6)所制備的分子印跡聚合物100mg-200mg，用濕法裝填固相萃取柱，依次用丙酮和甲醇潤洗，而后裝錫箔袋中備用。有益效果
本發(fā)明所提供的分子印跡固相萃取柱可用于動物可食性組織中常山酮的選擇性吸附和富集，較適合基層檢驗單位或現(xiàn)場處理樣品時使用。與普通的固相萃取柱相比，分子印跡固相萃取柱具有制備過程簡單易行、特異性和重復(fù)性好、分離效率和回收率高、吸附容量大、生產(chǎn)成本低、穩(wěn)定性好、精密度高等特點。
具體實施例方式以下實施例可使本專業(yè)技術(shù)人員全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1
(一).常山酮分子印跡聚合物的制備
稱取6g聚乙烯醇400加入150mL雙蒸水中，于90°C _95°C熱水中溶解，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)入至250mL三口燒瓶中。準確稱取模板分子(常山酮)0. 5mmol溶解于150mL乙腈中， 再加入功能單體甲基丙烯酸2mmol，使其充分溶解后超聲處理5min，然后置于4°C冰箱24h使其生成穩(wěn)定的復(fù)合物即完成預(yù)聚合。隨后加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯10 mmol，引發(fā)劑過氧化苯甲酰0. 4mmol，N，N- 二甲基苯胺0. 4mmol，超聲處理5min (除去氧氣) 后慢慢滴到400rpm轉(zhuǎn)速攪拌下且加熱溫度為20°C的上述三口瓶，引發(fā)聚合1 后形成乳白色的微懸浮乳液。所得微懸浮乳液在丙酮中用濕篩法過分級篩，除去極少數(shù)粒徑較大和較小的微球，選擇粒徑為50//m-70//m的顆粒，用定量濾紙包好，用體積比為7:3的甲醇鹽酸混合溶劑索氏萃取，期間定時對提取液進行紫外掃描，直到無模板分子特征吸收時停止萃取， 萃取時間為48h。隨后60°C烘干至恒重，即得到對常山酮具有識別能力的分子印跡聚合物。 非模板分子印跡聚合物的制備，即不加模板分子，不進行預(yù)聚合，其他操作步驟同上。(二).將模板分子的乙腈溶液作為吸附液，在25°C下，準確稱取10份50mg的模板分子印跡聚合物，測定它們對不同濃度模板分子的吸附量，以吸附量對模板分子濃度作圖，繪制等溫吸附曲線。為了比較模板分子印跡聚合物的吸附性能，同時測定非模板分子印跡聚合物的等溫吸附曲線，將獲得的數(shù)據(jù)用于式(1) Wkatchard分析。由katchard 曲線的斜率和截距可求得分子印跡聚合物的9_、KD。結(jié)果表明模板分子印跡聚合物存在兩類吸附位點，一類是具有高結(jié)合能和高選擇性的結(jié)合位點，另一類是具有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(其 Km=123. 2X Kr2 "mol/L，Qmaxl=7653. 8"mol/g ；KD2=2. 4X10>mol/ L，Qmax2=336.4//mol/g)。而非模板分子印跡聚合物僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點 (Kd=2. 2X10>mol/L, Qmax=187. 6Anol/g)；
S—方程Q = ^Q(O
C K11
式(1)中Kd 結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)，C 模板分子的平衡濃度，Qmax 最大表觀結(jié)合位點數(shù)。(三).分子印跡固相萃取柱的制備
分別稱取IOOmg的模板分子印跡聚合物或非模板分子印跡聚合物裝入3mL的固相萃取柱空柱管中，裝柱勻漿液為6mL體積比為2:1的甲醇異丙醇混合液。將分子印跡聚合物放入勻漿液中超聲5min制成混懸液。在裝柱之前，首先把下層的篩板放入，然后用3mL-5mL 甲醇對空柱管潤洗，將其放到固相萃取真空裝置上，封堵空余的接口，打開真空泵，徐徐加入勻漿好的印跡聚合物混懸液，邊加邊輕輕敲打柱體，待勻漿液快抽干前放入上層的篩板并壓緊。依次用IOmL丙酮和IOmL甲醇沖洗柱子，最后對其標記，放入錫箔袋中密封備用。(四).分子印跡固相萃取柱在實際樣品檢測中回收率的測定 1).雞肉和肝臟中常山酮的提取
稱取5g空白組織，勻漿，添加常山酮標準品使其在組織中的濃度達到農(nóng)業(yè)部235公告規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、1倍和2倍，加入2mL 25mg/mL的胰蛋白酶水溶液，用10%碳酸鈉水溶液調(diào)節(jié)PH至8，渦旋，用30mL乙酸乙酯溶液分3次提取(第三次再加ImL 10%碳酸鈉水溶液)，離心，合并上清液。用0. 125mol/L pH4. 9的醋酸銨溶液45mL進行液液萃取，收集水層，加入IOmL正己烷振蕩混勻，而后去除正己烷相以及溶入其中的乙酸乙酯。2).樣品的凈化
分子印跡固相萃取柱首先用IOmL甲醇和IOmL甲醇水依次潤洗，0. 125mol/L pH4. 9的醋酸銨溶液5mL進行平衡。加入濃縮后的樣品提取液的水相5mL，經(jīng)10%甲醇水5mL淋洗
5后，用甲醇乙酸混合液(9:1，V/V)8mL洗脫。洗脫液過0. 22//m的有機膜后35°C減壓蒸干， 殘渣用ImL的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。3).高效液相色譜法測定回收率
標準溶液的配制分別配成濃度為0. IMgfmUQ. 2//g/mL、0. 5//g/mL、l//g/mL、2//g/mL和 5//g/mL的標準工作液。每個濃度點做5個重復(fù)，共重復(fù)5天，做校正曲線。
色譜條件色譜柱 Angilent Zarbax SB C18,250mmX4. 6mm (i. d.)，流動相乙腈-0. 125mol/L乙酸銨(1:5，V/V)，檢測波長M3nm，進樣量20//L，柱溫為室溫，流速ImL/ min0經(jīng)測定，其在不同基質(zhì)中的回收率見表1 (每個樣品平行測定3次)。表1分子印跡固相萃取柱在不同基質(zhì)中的回收率
權(quán)利要求
1.常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于其具體操作步驟如下1)先將聚乙烯醇400加入蒸餾水中，加熱至95°C使其溶解，形成濃度為3%-8%聚乙烯醇400溶液，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)至三口燒瓶中；2)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，得到混合溶液；所述的模板分子為常山酮，致孔劑為乙腈，功能單體為甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:3-6，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為2. 5mmol/L-5mmol/L ；3)將步驟2)的混合溶液用超聲清洗儀超聲5min，混合均勻，放入4°C冰箱孵育Mh，得到預(yù)聚合體系；4)將步驟3)的預(yù)聚合體系置于冰水浴中，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，然后用超聲清洗儀超聲5min，通入氮氣5min，并在氮氣氣氛或真空狀態(tài)下密封；所述的交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，加入量為功能單體摩爾量的5倍，所述的引發(fā)劑是等摩爾比的過氧化苯甲酰和N，N- 二甲基苯胺，加入量為功能單體摩爾量的0. 2倍；5)將步驟4)形成的反應(yīng)體系在攪拌和氮氣保護下慢慢滴加到步驟1)的三口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為10°C -30°C，聚合時間為他-3他，使其形成乳白色的微懸浮乳液，即為印跡聚合物；6)將步驟5)中的印跡聚合物在丙酮中用濕篩法過分級篩，除去極少數(shù)粒徑較大和較小的微球，選直徑為50//m-70//m的顆粒，用定量濾紙包好，用體積比為7:3的甲醇鹽酸混合溶劑索氏萃取，期間定時對提取液進行紫外掃描，直到無模板分子特征吸收停止萃??；然后將所得聚合物微球60°C烘干至恒重，得到對常山酮具有識別能力的分子印跡聚合物；7)稱取步驟6)所制備的分子印跡聚合物100mg-200mg，用濕法裝填固相萃取柱，依次用丙酮和甲醇潤洗，而后裝錫箔袋中，即制備成常山酮分子印跡固相萃取小柱。
2.權(quán)利要求1所述的常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于所述的聚乙烯醇400溶液的濃度為4%-6%。
3.權(quán)利要求1所述的常山酮分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)溫度為18°C -25°C，聚合時間為12h-Mh。
4.權(quán)利要求1所述的常山酮分子印跡固相萃取小柱應(yīng)用，其特征在于用于動物性食品中殘留常山酮的選擇性吸附和富集。
全文摘要
常山酮分子印跡固相萃取柱的制備方法和應(yīng)用，涉及分析化學(xué)領(lǐng)域。該分子印跡固相萃取柱是以常山酮為模板分子，將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體于低溫下進行預(yù)聚合。而后按照模板分子:功能單體:交聯(lián)劑為1:3-6:15-30的摩爾比混合，采用懸浮聚合法低溫引發(fā)聚合制備分子印跡聚合物微球，所得微球經(jīng)漂洗、過篩、洗脫和干燥等一系列處理后，濕法填充于固相萃取柱空柱管中，而后經(jīng)丙酮和甲醇依次潤洗后可用于動物源性食品中殘留常山酮的選擇性吸附、富集和純化。本發(fā)明所制備的常山酮分子印跡固相萃取柱較已有的固相萃取柱具有特異性強、制備簡便、識別性能好、成本低廉、所需儀器和反應(yīng)條件容易實現(xiàn)等特點。
文檔編號G01N30/08GK102539587SQ20121000074
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者侯玉澤, 劉世磊, 張敏, 徐航, 李兆周, 李志康, 李文榮, 李道敏 申請人:河南科技大學(xué)