專利名稱：同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)、食品安全領(lǐng)域，具體地說，是涉及同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚 氰酸的固相萃取小柱及制備方法和應(yīng)用，并主要用于各類食品(包括原料乳、奶制品、動(dòng)物 源性食品、植物源性食品等)和飼料中三聚氰胺和三聚氰酸殘留的高選擇性分離、富集和 純化。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)，化學(xué)式C3H6N6，俗稱蜜胺、蛋白精，IUPAC命名為“ 1，3， 5-三氨基_2，4，6-三嗪”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料，廣泛應(yīng)用 于造紙、日用品、印刷、塑料制品等和人類日常生活息息相關(guān)的產(chǎn)品中。食品工業(yè)中常常需 要測(cè)定食品的蛋白質(zhì)含量，由于直接測(cè)量蛋白質(zhì)技術(shù)上比較復(fù)雜，所以常用一種叫做凱氏 定氮法的方法，通過測(cè)定氮原子的含量來間接推算食品中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺 (含氮量66%)與蛋白質(zhì)(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造 假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白質(zhì)含量較高的假象，從而造成嚴(yán)重的食物安全事 故。三聚氰胺的毒性事實(shí)上是低的，單獨(dú)攝入體內(nèi)并不造成很嚴(yán)重的后果，它遇強(qiáng)酸或強(qiáng) 堿水溶液水解，氨基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺，然后進(jìn)一步水解生成三聚氰酸 一酰胺，最后生成三聚氰酸(Cyanuric Acid)。當(dāng)三聚氰胺和三聚氰酸同時(shí)存在時(shí)，二者能 夠依靠分子結(jié)構(gòu)上的氫氧基與氨基之間形成水合鍵，最后生成氰尿酸三聚氰胺。氰尿酸三 聚氰胺很難溶于水，被攝入人體后，由于胃液的酸性作用，氰尿酸三聚氰胺解離，這種復(fù)合 物被破壞，三聚氰胺和三聚氰酸于是分別被吸收入血。由于人體無法轉(zhuǎn)化這兩種物質(zhì)，最 終三聚氰胺和三聚氰酸被血液運(yùn)送到腎臟，兩種物質(zhì)又一次相遇，于是又進(jìn)行了相互作用， 以網(wǎng)格結(jié)構(gòu)重新形成不溶于水的大分子氰尿酸三聚氰胺，大量氰尿酸三聚氰胺聚集于此形 成結(jié)石，造成腎小管的物理阻塞，導(dǎo)致尿液無法順利排除，使腎臟積水，最終導(dǎo)致腎臟衰竭。 2007年美國(guó)寵物食品受污染事件，調(diào)查結(jié)果認(rèn)為摻雜了<6. 6%三聚氰胺的小麥蛋白粉 是寵物食品導(dǎo)致中毒的原因。2008年爆發(fā)的“嬰兒奶粉中三聚氰胺事件”給處于輝煌時(shí)期 的中國(guó)乳業(yè)造成了毀滅性的打擊，并導(dǎo)致乳制品國(guó)際貿(mào)易蒙受重大損失，包括歐盟、美國(guó)在 內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)一度對(duì)我國(guó)出口的乳及含乳制品設(shè)置了嚴(yán)格的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和壁壘。目 前我國(guó)僅出臺(tái)了原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22388-2008和GB/ T2M00-2008)，對(duì)于三聚氰酸檢測(cè)的報(bào)道較少見，而對(duì)于除乳及乳制品外的含蛋白食品中 的三聚氰胺的檢測(cè)也是參照原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。由于各類食 品基質(zhì)非常復(fù)雜，為了避免不同復(fù)雜基質(zhì)的影響，樣品前處理就非常重要了。采用固相萃取 法對(duì)食品中的三聚氰胺和三聚氰酸進(jìn)行預(yù)處理，簡(jiǎn)單、方便、去除干擾雜質(zhì)效果好。但是，由 于弱堿性的三聚氰胺(PKa 8. 95)和弱酸性的三聚氰酸(pKa 5.0)是兩種完全不同性質(zhì)的 化合物，目前通常采用美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的官方推薦方法，即利用兩種不同 性質(zhì)的固相萃取小柱(強(qiáng)陽離子交換小柱和強(qiáng)陰離子交換小柱)，分別萃取三聚氰胺和三
5聚氰酸，再分開檢測(cè)。但該方法操作復(fù)雜，耗費(fèi)大量的時(shí)間以及人力和物力，同時(shí)方法的適 用基質(zhì)也僅限于乳及含乳制品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸 的固相萃取小柱及制備方法和應(yīng)用，以方便、快捷、準(zhǔn)確、高效地選擇性萃取各類食品中的 三聚氰胺和三聚氰酸，結(jié)合質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)快速分析，使三聚氰胺和三聚氰酸的定性和定量 更準(zhǔn)確更高效。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱，由聚丙烯外殼、聚乙烯篩板 和填料組成，其特征在于所述填料為強(qiáng)陽離子交換填料和親水性鍵合相硅膠。進(jìn)一步地，所述強(qiáng)陽離子交換填料為選自苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、丙 磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、苯磺酸鍵合硅膠、丙磺酸鍵合硅膠中的至少一種；所述親 水性鍵合相硅膠為選自乙二胺基-N-丙基鍵合硅膠、氨丙基鍵合硅膠、氰基鍵和硅膠、二醇 基鍵和硅膠中的至少一種。上述強(qiáng)陽離子交換填料和所述親水性鍵合相硅膠的比例為重量比1 0.5 1 10。同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法，包括以下步驟分別 稱取一定量30 100微米強(qiáng)陽離子交換填料和40 100微米親水性鍵合相硅膠，填充于 底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定。利用上述的固相萃取小柱同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，包括以下 步驟a、從樣品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液；b、固相萃取小柱的活化將所述固相萃取小柱依次用2 6mL甲醇、2 6mL乙 腈-水活化；C、過柱轉(zhuǎn)移所述待凈化液至所述固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱，用 1 3mL乙腈-水淋洗小柱，低真空抽干固相萃取柱后，依次用1 3mL甲醇和1 3mL 5% 氨水甲醇溶液洗脫柱上的待分析成分，合并收集洗脫液，在氮吹濃縮裝置上蒸干后供液相 色譜-質(zhì)譜測(cè)定。上述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其中所述樣品為食品(飲 料)和飼料；優(yōu)選地，所述食品是原料乳及乳制品，或植物源性食品，或動(dòng)物源性食品如豬 肉、肝臟、腸衣、水產(chǎn)品，或蜂蜜，其既可以是液態(tài)的，如液態(tài)奶、豆?jié){，也可以是固態(tài)的，如奶 粉、乳酪、煉乳、奶油、奶糖、豆奶粉、豆粉、蛋白粉。上述同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，可通過以下步驟從所述動(dòng)物源 性食品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液稱取1 2g試樣于具塞塑料離心管中， 加4 8mL乙腈水(1 1)和200 500 μ L 2moL/L鹽酸，超聲提取，冷凍離心5 8min， 取上清液；殘?jiān)儆? SmL乙腈水(1 1)提取超聲，冷凍離心5 8min，取上清液； 合并兩次提取液，加入5 IOmL乙腈飽和正己烷，混勻后冷凍離心5 8min，棄去正己烷 層，下層經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈水(1 1)稀釋后作待凈化液。
可通過以下步驟從所述液態(tài)食品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液稱取 1 2g試樣于具塞塑料離心管中，加2 4mL乙腈和50 500 μ L 2moL/L鹽酸溶液，超聲 提取，冷凍離心5 8min，取上清液；經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈水 (1 1)稀釋后作待凈化液?？赏ㄟ^以下步驟從蜂蜜中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液稱取1 2g試 樣于具塞塑料離心管中，加4 SmL乙腈水(1 1)和50 500 μ L2moL/L鹽酸溶液，超 聲提取，冷凍離心5 8min，取上清液；經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈水 (1 1)稀釋后作待凈化液?？赏ㄟ^以下步驟從固體食品或飼料中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液稱 取1 2g試樣于具塞塑料離心管中，加2 4mL去離子水溶解，然后加2 4mL乙腈和50 500 μ L 2moL/L鹽酸溶液，超聲提取，冷凍離心5 8min，取上清液；經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn) 濕的濾紙過濾后用乙腈水(1 1)稀釋后作待凈化液。上述的固相萃取小柱以及上述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法可 以應(yīng)用于三聚氰胺和三聚氰酸含量測(cè)定中。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，使之與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)和積 極效果本發(fā)明所制得的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，用于萃取各 類食品基質(zhì)中的三聚氰胺和三聚氰酸，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、高效。與以往的方法比較，前處理 的萃取過程由兩根不同的固相萃取柱(強(qiáng)陽離子交換小柱和強(qiáng)陰離子交換小柱)分開萃取 簡(jiǎn)化成一根固相萃取柱一次性萃取，節(jié)省了一半以上的時(shí)間，一根同時(shí)萃取三聚氰胺和三 聚氰酸分子的固相萃取小柱的價(jià)格也只有不到兩根離子交換萃取柱總價(jià)格的一半，總的效 率比FDA方法高了 75%以上，使三聚氰胺和三聚氰酸的定性和定量更準(zhǔn)確更高效更穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取IOOmg 40微米丙磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和50mg 50微米乙二 胺基-N-丙基鍵合硅膠，充分混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取150mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于牛奶中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取2g(精確至O.Olg)液體試樣于50mL具塞塑料離心管中，加4mL乙腈和 500 μ L 2moL/L鹽酸，混勻后超聲提取15min，在4°C下9500r/min冷凍離心5min，取上清 液，經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用去離子水稀釋至SmL作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移SmL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水(1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)螅^0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)牛奶中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克牛奶加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為25 μ g/kg，1000 μ g/kg，2500 μ g/kg， 三聚氰酸為50 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-1%和三聚氰酸」％為 內(nèi)標(biāo)，濃度分別為100 μ g/kg和200μ g/kg，以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色 譜-質(zhì)譜儀上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為82.3%，78. 1%，78.5%，三 聚氰酸的相對(duì)回收率為83. 2 %，80. 5 %，79. 6 %。實(shí)施例2.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取120mg 40微米苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和80mg 50微米乙二 胺基-N-丙基鍵合硅膠，充分混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取200mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于豬肉中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取2g(精確至O.Olg)試樣于50mL具塞塑料離心管中，加4mL乙腈水 (1 1) ^P 500 μ L 2moL/L 鹽酸，超聲提取 15min，在 4°C下 9500r/min 冷凍離心 5min，取 上清液。殘?jiān)儆?mL乙腈水(1 1)提取一次，超聲15min，9500r/min離心5min，取 上清液，合并兩次提取液，加入5mL乙腈飽和正己烷，混勻anin，4°C下9500r/min冷凍離心 5min，棄去正己烷層，下層經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈水(1 1)稀釋 至SmL后作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移SmL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)?，過0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)豬肉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克豬肉加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為25μ g/kg，75y g/kg，100y g/kg，三聚 氰酸為50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3為內(nèi)標(biāo)，濃 度分別為50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色譜-質(zhì)譜儀上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為82. 9 %，88. 1 %，78. 9%，三聚氰酸的相 對(duì)回收率為 93. 4%,90. 3%,95. 6%。實(shí)施例3.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取IOOmg 50微米苯磺酸鍵合硅膠和IOOmg 50微米氨丙基鍵合硅膠，充分 混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取200mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于蝦肉中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取2g(精確至O.Olg)試樣于50mL具塞塑料離心管中，加4mL乙腈水 (1 1) ^P 500 μ L 2moL/L 鹽酸，超聲提取 15min，在 4°C下 9500r/min 冷凍離心 5min，取 上清液。殘?jiān)儆?mL乙腈水(1 1)提取一次，超聲15min，9500r/min離心5min，取 上清液，合并兩次提取液，加入5mL乙腈飽和正己烷，混勻anin，4°C下9500r/min冷凍離心 5min，棄去正己烷層，下層經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈水(1 1)稀釋 至SmL后作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移SmL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)螅^0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)蝦肉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克蝦肉加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為25 μ g/kg，75 μ g/kg，100 μ g/kg，三聚 氰酸為50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3為內(nèi)標(biāo)，濃 度分別為50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色譜-質(zhì)譜儀 上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為94. 6 %，90. 6 %，90. 1 %，三聚氰酸的相 對(duì)回收率為 97. 9%,92. 3%, 100. 2%。實(shí)施例4.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取50mg 50微米丙磺酸鍵合硅膠和200mg 50微米氨丙基鍵合硅膠，充分混 勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取250mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于蜂蜜中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取Ig試樣于50mL具塞塑料離心管中，加8mL乙腈水(1 1) ^P 50 μ L 2moL/L鹽酸，混勻后超聲提取15min，經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移SmL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)?，過0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)蜂蜜中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克蜂蜜加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為25 μ g/kg，75 μ g/kg，100 μ g/kg，三聚 氰酸為50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3為內(nèi)標(biāo)，濃 度分別為50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色譜-質(zhì)譜儀 上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為83. 6 %，76. 2 %，89. 5%，三聚氰酸的相 對(duì)回收率為 85. 9%,78. 3%,78. 5%。實(shí)施例5.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取50mg 40微米丙磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和500mg 50微米氨丙 基鍵合硅膠，充分混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取550mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于奶粉中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取lg(精確至O.Olg)奶粉于50mL具塞塑料離心管中，加入4mL去離子水 溶解，然后加4mL乙腈和500 μ L 2moL/L鹽酸，混勻后超聲提取15min，在4°C下9500r/min 冷凍離心5min，取上清液2mL，經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用去離子水稀釋5mL 作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移5mL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)?，過0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)奶粉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克奶粉加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為50 μ g/kg，1000 μ g/kg，2500 μ g/kg， 三聚氰酸為100 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-1%和三聚氰酸」％為 內(nèi)標(biāo)，濃度分別為100 μ g/kg和200μ g/kg，以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色 譜-質(zhì)譜儀上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為82.3%，78. 1%，75.5%，三 聚氰酸的相對(duì)回收率為113.2%,110.5%,109.6%o實(shí)施例6.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取50mg 30微米苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和IOOmg 50微米乙二 胺基-N-丙基鍵合硅膠，充分混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取150mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于飼料中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取lg(精確至0. Olg)飼料于50mL具塞塑料離心管中，加入4mL去離子水混 合，然后加4mL乙腈和500 μ L 2moL/L鹽酸，混勻后超聲提取15min，在4°C下9500r/min冷 凍離心5min，取上清液，經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用去離子水稀釋至SmL作待 凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移SmL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)?，過0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)飼料中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克飼料加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為50 μ g/kg, 1000 μ g/kg, 2500 μ g/kg, 三聚氰酸為100 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-1%和三聚氰酸」％為 內(nèi)標(biāo)，濃度分別為100 μ g/kg和200μ g/kg，以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色 譜-質(zhì)譜儀上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為92. 3%，98. 1%，91.5%，三 聚氰酸的相對(duì)回收率為103. 2%, 100. 5%, 109. 6%0實(shí)施例7.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備
分別稱取IOOmg 50微米苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和150mg 60微米氰基 鍵合硅膠，充分混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取250mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于腸衣中三聚氰胺 和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取2g(精確至O.Olg)試樣于50mL具塞塑料離心管中，加4mL乙腈水 (1 1) ^P 500 μ L 2moL/L 鹽酸，超聲提取 15min，在 4°C下 9500r/min 冷凍離心 5min，取 上清液。殘?jiān)儆?mL乙腈水(1 1)提取一次，超聲15min，9500r/min離心5min，取 上清液，合并兩次提取液，加入5mL乙腈飽和正己烷，混勻anin，4°C下9500r/min冷凍離心 5min，棄去正己烷層，下層經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈水(1 1)稀釋 至SmL后作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移SmL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入1. OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)螅^0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)腸衣中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富集 和純化，對(duì)每克腸衣加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為25 μ g/kg，75 μ g/kg，100 μ g/kg，三聚 氰酸為50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3為內(nèi)標(biāo)，濃 度分別為50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色譜-質(zhì)譜儀 上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為79. 9 %，85. 3 %，80. 9%，三聚氰酸的相 對(duì)回收率為 103. 5%, 100. 3%, 105. 8% 0實(shí)施例8.一、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法(1)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制備分別稱取200mg 30微米丙磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和150mg 40微米二醇 基鍵合硅膠，充分混勻。(2)同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制備稱取350mg上述功能性填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上 端再以聚乙烯篩板固定。二、同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱，應(yīng)用于蛋白粉中三聚氰 胺和三聚氰酸的分離、富集和純化(1)稱取Ig (精確至0. Olg)蛋白粉于50mL具塞塑料離心管中，加入4mL去離子水 溶解，然后加4mL乙腈和500 μ L 2moL/L鹽酸，混勻后超聲提取15min，在4°C下9500r/min
12冷凍離心5min，取上清液2mL，經(jīng)乙腈水(1 1)潤(rùn)濕的濾紙過濾后用去離子水稀釋5mL 作待凈化液。(2)將同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化備用。(3)轉(zhuǎn)移5mL樣液至固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱，低真空抽干后，依次用2mL甲醇和兩次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱上 的待分析成分，合并收集洗脫液。(4)洗脫液在氮吹濃縮裝置上40°C的溫度下蒸干，加入l.OmL 100mmol/L甲酸 銨乙腈(1 9) pH3. 2振蕩溶解殘?jiān)?，過0.22 μ m濾膜。濾液供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱對(duì)蛋白粉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有專一選擇性的富 集和純化，對(duì)每克蛋白粉加標(biāo)三個(gè)添加濃度(三聚氰胺為50 μ g/kg，1000 μ g/kg，2500 μ g/ kg,三聚氰酸為100 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg)，選擇三聚氰胺-15N3和三聚氰酸」％ 為內(nèi)標(biāo)，濃度分別為100μ g/kg和200μ g/kg，以三聚氰胺和三聚氰酸與其內(nèi)標(biāo)物在液相色 譜-質(zhì)譜儀上響應(yīng)值的比值作對(duì)照，三聚氰胺的相對(duì)回收率為92. 2 %，88. 5 %，95. 6 %，三 聚氰酸的相對(duì)回收率為109. 3%, 106. 5%,99.8%0
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱，包括外殼、篩板和填料，其特征 在于所述填料為強(qiáng)陽離子交換填料和親水性鍵合相硅膠。
2.如權(quán)利要求1所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱，其特征在于， 所述強(qiáng)陽離子交換填料為選自苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、丙磺酸化的苯乙烯二乙 烯苯聚合物、苯磺酸鍵合硅膠、丙磺酸鍵合硅膠中的至少一種。
3.如權(quán)利要求2所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱，其特征在于， 所述強(qiáng)陽離子交換填料粒徑為30 100微米。
4.如權(quán)利要求1所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱，其特征在于， 所述親水性鍵合相硅膠為選自乙二胺基-N-丙基鍵合硅膠、氨丙基鍵合硅膠、氰基鍵和硅 膠、二醇基鍵和硅膠中的至少一種。
5.如權(quán)利要求4所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱，其特征在于， 所述親水性鍵合相硅膠粒徑為40 100微米。
6.如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取 小柱，其特征在于，所述強(qiáng)陽離子交換填料和所述親水性鍵合相硅膠的重量比為1 0.5 1 10。
7.一種同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法，其特征在于包括以 下步驟分別稱取強(qiáng)陽離子交換填料和親水性鍵合相硅膠，填充于底端具有篩板的小柱內(nèi)， 填料上端再以篩板固定。
8.如權(quán)利要求7所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法，其 特征在于，所述強(qiáng)陽離子交換填料為選自苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、丙磺酸化的 苯乙烯二乙烯苯聚合物、苯磺酸鍵合硅膠、丙磺酸鍵合硅膠中的至少一種。
9.如權(quán)利要求7所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法，其 特征在于，所述強(qiáng)陽離子交換填料粒徑為30 100微米。
10.如權(quán)利要求7所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法， 其特征在于，所述親水性鍵合相硅膠為選自乙二胺基-N-丙基鍵合硅膠、氨丙基鍵合硅膠、 氰基鍵和硅膠、二醇基鍵和硅膠中的至少一種。
11.如權(quán)利要求7所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制備方法， 其特征在于，所述親水性鍵合相硅膠粒徑為40 100微米。
12.如權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相 萃取小柱的制備方法，其特征在于，所述強(qiáng)陽離子交換填料和所述親水性鍵合相硅膠的比 例為重量比1 0. 5 1 10。
13.一種利用如權(quán)利要求1所述的固相萃取小柱同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法，其特征在于包括以下步驟a、從樣品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液；b、將所述固相萃取小柱依次用2 6mL甲醇、2 6mL乙腈-水活化；c、轉(zhuǎn)移所述待凈化液至所述固相萃取柱的頂部，以每秒一滴的流速過柱，用1 3mL乙 腈-水淋洗小柱，低真空抽干固相萃取柱后，依次用1 3mL甲醇和1 3mL 5%氨水甲醇 溶液洗脫柱上的待分析成分，合并收集洗脫液，在氮吹濃縮裝置上蒸干后供液相色譜-質(zhì) 譜測(cè)定。
14.如權(quán)利要求13所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其特征在于， 所述乙腈-水中乙腈與水的體積比為1 1。
15.如權(quán)利要求13所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其特征在于， 用1 3mL 5%氨水甲醇溶液洗脫2次。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法，其特征在于，所述樣品是動(dòng)物源性食品。
17.如權(quán)利要求16所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其特征在于可 通過以下步驟從樣品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液a、稱取1 2g試樣于具塞塑料離心管中，加4 SmL乙腈-水和50 500μ L鹽酸溶 液，超聲提取，冷凍離心5 8min，取上清液；b、殘?jiān)儆? SmL乙腈-水提取超聲，冷凍離心5 8min，取上清液；c、合并兩次提取液，加入5 IOmL乙腈飽和正己烷，混勻后冷凍離心5 8min，棄去正 己烷層，下層經(jīng)乙腈-水潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈-水稀釋后作待凈化液。
18.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法，其特征在于，所述樣品是液態(tài)食品。
19.如權(quán)利要求18所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其特征在于可 通過以下步驟從樣品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液a、稱取1 2g試樣于具塞塑料離心管中，加2 4mL乙腈和50 500μ L鹽酸溶液， 超聲提取，冷凍離心5 8min，取上清液；b、經(jīng)乙腈-水潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈-水稀釋后作待凈化液。
20.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法，其特征在于，所述樣品是蜂蜜。
21.如權(quán)利要求20所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其特征在于可 通過以下步驟從樣品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液a、稱取1 2g試樣于具塞塑料離心管中，加4 SmL乙腈-水和50 500μ L鹽酸溶 液，超聲提取，冷凍離心5 8min，取上清液；b、經(jīng)乙腈-水潤(rùn)濕的濾紙過濾后用乙腈-水稀釋后作待凈化液。
22.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法，其特征在于，所述樣品是選自固體食品和飼料的至少一種。
23.如權(quán)利要求22所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法，其特征在于可 通過以下步驟從樣品中提取三聚氰胺和三聚氰酸獲得待凈化液a、稱取1 2g試樣于具塞塑料離心管中，加2 4mL去離子水溶解，然后加2 4mL 乙腈和50 500 μ L鹽酸溶液，超聲提取，冷凍離心5 8min，取上清液；b、經(jīng)乙腈-水潤(rùn) 濕的濾紙過濾后用乙腈-水稀釋后作待凈化液。
24.如權(quán)利要求17、19、21、23中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三 聚氰酸的方法，其特征在于，所述鹽酸溶液的濃度為2mol/L，所述乙腈-水中乙腈與水的體 積比為1 1。
25.如權(quán)利要求1所述的固相萃取小柱在三聚氰胺和三聚氰酸含量測(cè)定中的應(yīng)用。
26.如權(quán)利要求13所述的同時(shí)萃取樣品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法在三聚氰胺和三聚氰酸含量測(cè)定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析化學(xué)、食品安全領(lǐng)域，具體涉及同時(shí)萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱及制備方法和應(yīng)用，該固相萃取小柱包括強(qiáng)陽離子交換填料和親水性鍵合相硅膠，制備時(shí)分別稱取一定量30～100微米強(qiáng)陽離子交換填料和40～100微米親水性鍵合相硅膠，填充于底端具有篩板的小柱內(nèi)，填料上端再以篩板固定。本發(fā)明萃取小柱可應(yīng)用于各類食品和飼料中三聚氰胺和三聚氰酸的分離、富集和純化，主要包括提取和凈化兩個(gè)步驟。本發(fā)明能夠快速、準(zhǔn)確、高效地萃取各類食品中的三聚氰胺和三聚氰酸，結(jié)合質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)快速同時(shí)檢測(cè)，使三聚氰胺和三聚氰酸的定性和定量更準(zhǔn)確更高效。
文檔編號(hào)B01D15/22GK102133488SQ20101010130
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者夏敏勇, 張曉梅, 趙善貞, 鄧曉軍, 郭德華 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 上海安譜科學(xué)儀器有限公司