專利名稱：一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法。
背景技術(shù)：
可卡因(cocaine)，別名古柯堿，是一種從古柯葉中分離出來的的生物堿。可卡因是一種強(qiáng)效局部麻醉劑，脂溶性高，對(duì)神經(jīng)組織親和性良好，屬中樞神經(jīng)興奮劑。因其毒性大并易于成癮，近來已被其他局部麻醉劑所取代，長期吸食可卡因身體和心理都會(huì)產(chǎn)生依賴性，對(duì)身體和心理造成極大傷害?？煽ㄒ虻目焖贆z測具有重要的意義。傳統(tǒng)檢測方法有高效液相色譜法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層色譜法及高效毛細(xì)管電泳法等。基于適配體的檢測方法，具有高分辨率與高親和力，彌補(bǔ)了現(xiàn)有抗體的不足。適配體(aptamer)是一類由SELEX篩選技術(shù)(指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))篩選產(chǎn)生的寡鏈核酸(DNA或RNA)。適配體能特異性地結(jié)合小分子，多肽，蛋白，乃至細(xì)胞，病毒或寄生蟲等配體。它們可以折疊成功能化的三維結(jié)構(gòu)，并形成口袋結(jié)構(gòu)，并與特定配體結(jié)合。適配體可以通過SELEX的方式從單鏈寡核苷酸庫中體外篩選得到。這一過程已經(jīng)自動(dòng)化了，目前篩選周期已經(jīng)從幾個(gè)月縮短到幾天。適配體具有以下特點(diǎn)1)靶分子廣，從小分子到蛋白及有機(jī)大分子到細(xì)胞層面；2)高分辨率，例如能分辨出分子結(jié)構(gòu)上只有一個(gè)甲基差別的茶堿與咖啡因；3)高親和力，篩得aptamer的解離常數(shù)可以達(dá)到nmol/L水平,甚至pmol/L水平4)可體外合成、易于修飾；5)篩選過程相對(duì)簡便、經(jīng)濟(jì)。適配體的出現(xiàn)提供了一種高效識(shí)別的研究平臺(tái)，展示了良好的應(yīng)用前景。目前，已有可卡因適配體被篩選出來，并被應(yīng)用于基于比色法(J. Am. Chem.Soc. 2002，124，9678-9679.)以及基于量子點(diǎn)(Anal. Chem.，2009，81，3051 - 3055)的檢測方法中。石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance,QCM)是一種利用單結(jié)晶石英的壓電電效應(yīng)的稱重裝置，當(dāng)施加一個(gè)外部電場時(shí)，會(huì)產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)，當(dāng)晶片厚度為電極機(jī)械振蕩波半波長的奇數(shù)倍時(shí)，發(fā)生共振。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速，實(shí)時(shí)檢測的利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法。該方法采用夾心法的方式在石英晶體微天平的表面固定可卡因的適配體，同時(shí)采用表面引發(fā)聚合的方式增大信號(hào)，能有效的節(jié)約人力，有望實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、配制DNA濃度為O. 2 μ M的DNA組裝液，然后采用DNA組裝液孵育清洗干凈的QCM芯片，得到表面自組裝DNA的QCM芯片；所述DNA為巰基修飾DNA，DNA序列(SEQID NO. I)為5，-TCA CAG ATGAGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步驟二、采用濃度為2μ M的巰基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步驟一中所述表面自組裝DNA的QCM芯片使芯片表面的多余位點(diǎn)封閉；步驟三、制備引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液；步驟四、采用適配體DNA溶液和步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液共同孵育步驟二中封閉后的QCM芯片，用緩沖溶液沖洗孵育后的芯片表面，得到固定有適配體DNA的QCM芯片；將所述固定有適配體DNA的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ;所述適配體DNA的序列(SEQ ID NO. 2)為 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGA GACAAG GAT AAA TCC TTC AATGAA GTG GGT CTC CC ;所述緩沖液為O. IM pH值為7. O的PBS緩沖液；步驟五、將步驟四中裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中的QCM芯片取出，氮?dú)獯蹈珊笾糜诒砻嬉l(fā)聚合反應(yīng)液中，并將整個(gè)反應(yīng)體系移至手套箱中，室溫下反應(yīng)2h 4h后將QCM芯片從表面引發(fā)聚合反應(yīng)液中取出，用PBS溶液沖洗QCM芯片，然后用氮?dú)獯蹈桑?步驟六、將步驟五中吹干后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，再向反應(yīng)器中通入檢測物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測到的頻率F3，計(jì)算頻率F2和步驟四中所述頻率Fl的差值，頻率F2和頻率F3的差值A(chǔ)F"，當(dāng)AF" /ΛΓ彡30%時(shí)判定檢測物中含有可卡因；所述緩沖液為O. IM pH值為7. O的PBS緩沖液。上述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，步驟一中所述DNA組裝液由DNA、NaCl和濃度為O. IM的pH值為7. 2的PBS緩沖液混合均勻制成，DNA組裝液中NaCl的濃度為O. 2M。上述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液的制備方法為將10 μ L濃度為10mg/mL新鮮配置的NHS-酰溴溶液與5 μ L濃度為IM的pH值為9的NaHC03/Na2C03溶液混合均勻，并加水稀釋至40 μ L，隨后加入3 μ L濃度為100 μ M的氨基修飾DNA，加水稀釋至50 μ L，25°C下反應(yīng)lh，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用含O. 2MNaCl的濃度為O. IM的PBS緩沖溶液稀釋至600 μ L得到引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液。上述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，所述氨基修飾DNA為5’氨基功能化 DNA, DNA 序列(SEQ ID NO. 3)為 5，-GTC TCCCGA GAT-3’。上述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，步驟四中所述適配體DNA溶液為含100 μ M適配體DNA的O. IM的PBS溶液，適配體DNA溶液與引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液的體積比為I : 25。上述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，步驟四中所述孵育的溫度為25°C，孵育的時(shí)間為O. 5h 2h。上述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，步驟五中所述表面引發(fā)聚合反應(yīng)液的制備方法為配制去離子水與甲醇體積比為I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-聯(lián)卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_輕基乙酯，混合均勻后加入O. 004mmol的氯化銅和O. Imol氯化鈉，得到淡藍(lán)色溶液，對(duì)淡藍(lán)色溶液除氧IOmin 30min,隨后向每升除氧后的淡藍(lán)色溶液中加入O. 004mmol抗壞血酸,保持氮?dú)夥諊?，得到紅色的表面弓I發(fā)聚合反應(yīng)液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測工具，將適配體固定在QCM芯片表面，同時(shí)接枝高分子，以放大信號(hào)，本發(fā)明基于QCM的固化水模型，采用高分子放大信號(hào)，提供了一種新的思路。2、本發(fā)明使用引發(fā)劑標(biāo)記的DNA參與聚合反應(yīng)，并且摸索了相應(yīng)的條件。3、本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測工具，具有實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)勢，所用方法適于大規(guī)模應(yīng)用，同時(shí)，本方法所得芯片其性能能在長時(shí)間內(nèi)得以保存。4、本發(fā)明采用夾心法的方式在石英晶體微天平的表面固定可卡因的適配體，同時(shí)采用表面引發(fā)聚合的方式增大信號(hào)，能有效的節(jié)約人力，有望實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化，也能夠有效地降低成本。下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I步驟一、將清洗干凈的金基底的QCM芯片浸泡到100 μ L DNA組裝液中孵育2h，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，得到表面自組裝DNA的QCM芯片；所述DNA組裝液由DNA、NaCl和濃度為O. IM的pH值為7. 2的PBS緩沖液混合均勻制成，DNA組裝液中NaCl的濃度為O. 2M，DNA的濃度為O. 2 μ M ;所述DNA為巰基修飾DNA，DNA序列(SEQ IDNO. I)為5，-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步驟二、在室溫下，采用濃度為2μ M的巰基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步驟一中所述表面自組裝DNA的QCM芯片2h使芯片表面的多余位點(diǎn)封閉，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈桑徊襟E三、將O. Imol (11. 5g) NHS溶于250mL 二氯甲烷中，在氮?dú)夥諊麓艛嚢?，并緩慢加?8. ImL三乙胺，冰浴，待完全溶解后加入13. 9mL2-溴代異丁酰溴，反應(yīng)45min后等待液體至室溫，再加入150mL乙醚萃取，其中有機(jī)相使用150mL Na2CO3飽和溶液洗滌，并反復(fù)萃取2次，產(chǎn)物使用無水硫酸鎂干燥后過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的白色固體NHS-酰溴；將制備的NHS-酰溴配制成濃度為10mg/mL的NHS-酰溴溶液，然后將IOyL濃度為10mg/mL新鮮配置的NHS-酰溴溶液與5 μ L濃度為IM的pH值為9的NaHC03/Na2C03溶液混合均勻，并加水稀釋至40 μ L,隨后加入3 μ L濃度為100 μ M的氨基修飾DNA，加水稀釋至50 μ L, 25°C下反應(yīng)lh，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用含O. 2M NaCl的濃度為O. IM的PBS緩沖溶液稀釋至600 μ L得到引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液；所述氨基修飾DNA為5’氨基功能化DNA，DNA序列(SEQ IDNO. 3)為 5，-GTC TCC CGA GAT-3，；步驟四、將適配體DNA溶液和步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液按照I : 25的體積比混合均勻后，在溫度為25°C的條件下共同孵育步驟二中封閉后的QCM芯片2h，用緩沖溶液沖洗孵育后的芯片表面，得到固定有適配體DNA的QCM芯片；將所述固定有適配體DNA的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入O. IM pH值為7.0的PBS緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ;所述適配體DNA的序列(SEQ ID NO. 2)為 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGAGAC AAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTGGGT CTC CC ；步驟五、配制去離子水與甲醇體積比為I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-聯(lián)卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_輕基乙酯，混合均勻后加入O. 004mmol的氯化銅和O. Imol氯化鈉,得到淡藍(lán)色溶液,對(duì)淡藍(lán)色溶液除氧IOmin 30min,隨后向每升除氧后的淡藍(lán)色溶液中加入O. 004mmol抗壞血酸,保持氮?dú)夥諊玫郊t色的表面引發(fā)聚合反應(yīng)液；將步驟四中裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中的QCM芯片取出，氮?dú)獯蹈珊笾糜诒砻嬉l(fā)聚合反應(yīng)液中，并將整個(gè)反應(yīng)體系移至手套箱中，室溫下反應(yīng)2h后將QCM芯片從表面引發(fā)聚合反應(yīng)液中取出，用PBS溶液沖洗QCM芯片，然后用氮?dú)獯蹈?；步驟六、將步驟五中沖洗干凈后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入O. IM pH值為7. O的PBS緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，然后向反應(yīng)器中通入序列與可卡因適配體完全互補(bǔ)的DNA溶液，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測到的頻率F3，計(jì)算頻率F2和頻率Fl的差值△ Fi，頻率 F2 和頻率 F3 的差值 AF"，AF' =745.3Hz，AF" =643Hz, AF" /AF' =86. 3%, BP在芯片上修飾的DNA分子及高分子引起了 745. 3Hz的頻率響應(yīng)，而其中86. 3%的隨著互補(bǔ)DNA的加入而解鏈掉落。 實(shí)施例2步驟一、將清洗干凈的金基底的QCM芯片浸泡到100 μ L DNA組裝液中孵育2h，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，得到表面自組裝DNA的QCM芯片；所述DNA組裝液由DNA、NaCl和濃度為O. IM的pH值為7. 2的PBS緩沖液混合均勻制成，DNA組裝液中NaCl的濃度為O. 2M，DNA的濃度為O. 2 μ M ;所述DNA為巰基修飾DNA，DNA序列(SEQ IDNO. I)為5，-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步驟二、在室溫下，采用濃度為2μ M的巰基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步驟一中所述表面自組裝DNA的QCM芯片2h使芯片表面的多余位點(diǎn)封閉，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈桑徊襟E三、將O. Imol (11. 5g) NHS溶于250mL 二氯甲烷中，在氮?dú)夥諊麓艛嚢?，并緩慢加?8. ImL三乙胺，冰浴，待完全溶解后加入13. 9mL2-溴代異丁酰溴，反應(yīng)45min后等待液體至室溫，再加入150mL乙醚萃取，其中有機(jī)相使用150mL Na2CO3飽和溶液洗滌，并反復(fù)萃取2次，產(chǎn)物使用無水硫酸鎂干燥后過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的白色固體NHS-酰溴；將制備的NHS-酰溴配制成濃度為10mg/mL的NHS-酰溴溶液，然后將IOyL濃度為10mg/mL新鮮配置的NHS-酰溴溶液與5 μ L濃度為IM的pH值為9的NaHC03/Na2C03溶液混合均勻，并加水稀釋至40 μ L,隨后加入3 μ L濃度為100 μ M的氨基修飾DNA，加水稀釋至50 μ L, 25°C下反應(yīng)lh，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用含O. 2M NaCl的濃度為O. IM的PBS緩沖溶液稀釋至600 μ L得到引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液；所述氨基修飾DNA為5’氨基功能化DNA，DNA序列(SEQ IDNO. 3)為 5，-GTC TCC CGA GAT-3，；步驟四、將適配體DNA溶液和步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液按照I : 25的體積比混合均勻后，在溫度為25°C的條件下共同孵育步驟二中封閉后的QCM芯片O. 5h，用緩沖溶液沖洗孵育后的芯片表面，得到固定有適配體DNA的QCM芯片；將所述固定有適配體DNA的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入O. IM pH值為7.0的PBS緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ;所述適配體DNA的序列(SEQ ID NO. 2)為 ACT CAT CTG TGA ATC TCGGGA GAC AAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTGGGT CTC CC ；
步驟五、配制去離子水與甲醇體積比為I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-聯(lián)卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_輕基乙酯，混合均勻后加入O. 004mmol的氯化銅和O. Imol氯化鈉,得到淡藍(lán)色溶液,對(duì)淡藍(lán)色溶液除氧IOmin 30min,隨后向每升除氧后的淡藍(lán)色溶液中加入O. 004mmol抗壞血酸,保持氮?dú)夥諊?，得到紅色的表面引發(fā)聚合反應(yīng)液；將步驟四中裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中的QCM芯片取出，氮?dú)獯蹈珊笾糜诒砻嬉l(fā)聚合反應(yīng)液中，并將整個(gè)反應(yīng)體系移至手套箱中，室溫下反應(yīng)2h后將QCM芯片從表面弓I發(fā)聚合反應(yīng)液中取出，用PBS溶液沖洗QCM芯片，然后用氮?dú)獯蹈?；步驟六、將步驟五中沖洗干凈后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入O. IM pH值為7. O的PBS緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，然后向反應(yīng)器中通入10 μ M可卡因，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測到的頻率F3，計(jì)算頻率F2和頻率Fl的差值A(chǔ)Fi，頻率F2和頻率F3的差值 AF"，AF' = 721.6Hz, AF" =539. OHz, AF" /AF' =74. 7%，即在芯片上修飾的 DNA分子及高分子引起了 721. 6Hz的頻率響應(yīng)，而隨后加入10 μ M的可卡因，使部分雙鏈DNA解 鏈，其造成的頻率變化為539. OHz,即可以認(rèn)為10 μ M的可卡因造成74. 7%的高分子脫落，判定檢測物中含有可卡因。實(shí)施例3步驟一、將清洗干凈的金基底的QCM芯片浸泡到100 μ L DNA組裝液中孵育2h，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，得到表面自組裝DNA的QCM芯片；所述DNA組裝液由DNA、NaCl和濃度為O. IM的pH值為7. 2的PBS緩沖液混合均勻制成，DNA組裝液中NaCl的濃度為O. 2M，DNA的濃度為O. 2 μ M ;所述DNA為巰基修飾DNA，DNA序列(SEQ IDNO. I)為5，-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA ΑΑΑ-3’ ；步驟二、在室溫下，采用濃度為2μ M的巰基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步驟一中所述表面自組裝DNA的QCM芯片2h使芯片表面的多余位點(diǎn)封閉，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈桑徊襟E三、將O. Imol (11. 5g) NHS溶于250mL 二氯甲烷中，在氮?dú)夥諊麓艛嚢?，并緩慢加?8. ImL三乙胺，冰浴，待完全溶解后加入13. 9mL2-溴代異丁酰溴，反應(yīng)45min后等待液體至室溫，再加入150mL乙醚萃取，其中有機(jī)相使用150mL Na2CO3飽和溶液洗滌，并反復(fù)萃取2次，產(chǎn)物使用無水硫酸鎂干燥后過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的白色固體NHS-酰溴；將制備的NHS-酰溴配制成濃度為10mg/mL的NHS-酰溴溶液，然后將IOyL濃度為10mg/mL新鮮配置的NHS-酰溴溶液與5 μ L濃度為IM的pH值為9的NaHC03/Na2C03溶液混合均勻，并加水稀釋至40 μ L,隨后加入3 μ L濃度為100 μ M的氨基修飾DNA，加水稀釋至50 μ L, 25°C下反應(yīng)lh，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用含O. 2M NaCl的濃度為O. IM的PBS緩沖溶液稀釋至600 μ L得到引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液；所述氨基修飾DNA為5’氨基功能化DNA，DNA序列(SEQ IDNO. 3)為 5，-GTC TCC CGA GAT-3，；步驟四、將適配體DNA溶液和步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液按照I : 25的體積比混合均勻后，在溫度為25°C的條件下共同孵育步驟二中封閉后的QCM芯片lh，用緩沖溶液沖洗孵育后的芯片表面，得到固定有適配體DNA的QCM芯片；將所述固定有適配體DNA的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入O. IM pH值為7.0的PBS緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ;所述適配體DNA的序列(SEQ ID NO. 2)為 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGAGAC AAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTGGGT CTC CC ；步驟五、配制去離子水與甲醇體積比為I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2’-聯(lián)卩比卩定、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸_2_輕基乙酯，混合均勻后加入O. 004mmol的氯化銅和O. Imol氯化鈉,得到淡藍(lán)色溶液,對(duì)淡藍(lán)色溶液除氧IOmin 30min,隨后向每升除氧后的淡藍(lán)色溶液中加入O. 004mmol抗壞血酸,保持氮?dú)夥諊玫郊t色的表面引發(fā)聚合反應(yīng)液；將步驟四中裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中的QCM芯片取出，氮?dú)獯蹈珊笾糜诒砻嬉l(fā)聚合反應(yīng)液中，并將整個(gè)反應(yīng)體系移至手套箱中，室溫下反應(yīng)2h后將QCM芯片從表面引發(fā)聚合反應(yīng)液中取出，用PBS溶液沖洗QCM芯片，然后用氮?dú)獯蹈?；步驟六、將步驟五中沖洗干凈后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入O. IM pH值為7. O的PBS緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平 監(jiān)測到的頻率F2，然后向反應(yīng)器中通入I μ M可卡因，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測到的頻率F3，計(jì)算頻率F2和頻率F I的差值A(chǔ)Fi，頻率F2和頻率F3的差值A(chǔ)F"，AF' = 718.2Hz, AF" =332. 1Hz, AF" /AF' =43. 6%，即在芯片上修飾的 DNA 分子及高分子引起了 718. 2Hz的頻率響應(yīng)，而隨后加入I μΜ的可卡因，使部分雙鏈DNA解鏈，其造成的頻率變化為332. IHz,即可以認(rèn)為I μ M的可卡因造成43. 6%的高分子脫落，判定檢測物中含有可卡因。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 步驟一、配制DNA濃度為0. 2 ii M的DNA組裝液，然后采用DNA組裝液孵育清洗干凈的QCM芯片，得到表面自組裝DNA的QCM芯片；所述DNA為巰基修飾DNA，DNA序列為5’ -TCACAG ATG AGT AAA AAAAAA AAA-3，； 步驟二、采用濃度為2 ii M的巰基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步驟一中所述表面自組裝DNA的QCM芯片使芯片表面的多余位點(diǎn)封閉； 步驟三、制備引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液； 步驟四、采用適配體DNA溶液和步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液共同孵育步驟二中封閉后的QCM芯片，用緩沖溶液沖洗孵育后的芯片表面，得到固定有適配體DNA的QCM芯 片；將所述固定有適配體DNA的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ;所述適配體DNA的序列為 ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGA GAC AAG GAT AAATCC TTC AAT GAA GTG GGT CTC CC ；所述緩沖液為0. IM pH值為7. 0的PBS緩沖液； 步驟五、將步驟四中裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中的QCM芯片取出，氮?dú)獯蹈珊笾糜诒砻嬉l(fā)聚合反應(yīng)液中，并將整個(gè)反應(yīng)體系移至手套箱中，室溫下反應(yīng)2h 4h后將QCM芯片從表面引發(fā)聚合反應(yīng)液中取出，用PBS溶液沖洗QCM芯片，然后用氮?dú)獯蹈桑? 步驟六、將步驟五中吹干后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，再向反應(yīng)器中通入檢測物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測到的頻率F3，計(jì)算頻率F2和步驟四中所述頻率Fl的差值A(chǔ)F'，頻率F2和頻率F3的差值A(chǔ)F"，當(dāng)AF" /AF'彡30%時(shí)判定檢測物中含有可卡因；所述緩沖液為0. IM pH值為7. 0的PBS緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，步驟一中所述DNA組裝液由DNA、NaCl和濃度為0. IM的pH值為7. 2的PBS緩沖液混合均勻制成，DNA組裝液中NaCl的濃度為0. 2M。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，步驟三中所述引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液的制備方法為將IOuL濃度為lOmg/mL新鮮配置的NHS-酰溴溶液與5 u L濃度為IM的pH值為9的NaHC03/Na2C03溶液混合均勻，并加水稀釋至40 ii L，隨后加入3 ii L濃度為100 u M的氨基修飾DNA，加水稀釋至50 u L，25°C下反應(yīng)lh，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用含0. 2M NaCl的濃度為0. IM的PBS緩沖溶液稀釋至600 u L得到引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，所述氨基修飾DNA為5’氨基功能化DNA，DNA序列為5’ -GTC TCC CGA GAT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，步驟四中所述適配體DNA溶液為含100 u M適配體DNA的0. IM的PBS溶液，適配體DNA溶液與引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液的體積比為I : 25。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，步驟四中所述孵育的溫度為25°C，孵育的時(shí)間為0. 5h 2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，其特征在于，步驟五中所述表面引發(fā)聚合反應(yīng)液的制備方法為配制去離子水與甲醇體積比為I : I的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2, 2’ -聯(lián)卩比唳、5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯和5mmol甲基丙烯酸-2-輕基乙酯,混合均勻后加入0. 004mmol的氯化銅和0. Imol氯化鈉，得到淡藍(lán)色溶液，對(duì)淡藍(lán)色溶液除氧IOmin 30min，隨后向每升除氧后的淡藍(lán)色溶液中加入0. 004mmol抗壞血酸，保持氮?dú)夥諊?得到紅色的表面引發(fā)聚合反應(yīng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用石英晶體微天平檢測可卡因的方法，該方法為一、制備表面自組裝DNA的QCM芯片；二、封閉芯片表面的多余位點(diǎn)；三、制備引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液；四、采用適配體DNA溶液和引發(fā)劑標(biāo)記的DNA溶液共同孵育封閉后的芯片，裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，通入緩沖液，讀取頻率F1；五、取出芯片進(jìn)行表面引發(fā)聚合反應(yīng)；六、將表面引發(fā)聚合反應(yīng)后的芯片置于反應(yīng)器中，通入緩沖液，讀取頻率F2，再通入檢測物，讀取頻率F3，計(jì)算F2與F1及F2與F3的差值ΔF′和ΔF″，當(dāng)ΔF″/ΔF′≥30%時(shí)，判定檢測物中含有可卡因。本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測工具，具有實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)勢。
文檔編號(hào)G01N5/02GK102967523SQ20121046463
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月18日
發(fā)明者馬宏偉, 朱志強(qiáng), 汪杰 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所