專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用石英晶體微天平檢測(cè)dna甲基化的方法
一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于DNA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化的檢測(cè)方法很多，主要可以分為基于化學(xué)修飾、DNA甲基化結(jié)合蛋白及甲基化敏感內(nèi)切酶三大類(lèi)，MSRE-PCR法是第三類(lèi)甲基化敏感酶方法的代表，具體過(guò)程主要是基因組DNA經(jīng)甲基化敏感內(nèi)切酶廣泛消化后，再設(shè)計(jì)與所選基因CpG兩側(cè)序列匹配的特異性的引物，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，對(duì)照組不進(jìn)行DNA酶切就擴(kuò)增，兩相比較即可同時(shí)、快速檢測(cè)多基因的DNA甲基化狀態(tài)。該法用很小量的DNA標(biāo)本即可檢測(cè)多基因的甲基化狀態(tài)。這一檢測(cè)方法具有成本低，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。QCM平臺(tái)檢測(cè)DNA甲基化的方法就是基于此方法基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)而成，結(jié)合MSRE-PCR的操作簡(jiǎn)便和QCM準(zhǔn)確和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，能夠快速準(zhǔn)確的測(cè)定DNA某一段序列上的甲基化狀況。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)速度快，效率高，重復(fù)性良好的利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法。該方法采用對(duì)質(zhì)量變化靈敏的QCM與傳統(tǒng)的甲基化酶切技術(shù)相結(jié)合，可以有效地區(qū)分DNA的甲基化狀況。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用石英晶體微天平檢測(cè) DNA甲基化的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟
步驟一、酶切消化待檢測(cè)的DNA，使所述待檢測(cè)DNA中未發(fā)生甲基化的CCGG位點(diǎn)被打斷；
步驟二、以步驟一中經(jīng)酶切消化后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到終產(chǎn)物；
步驟三、根據(jù)待檢測(cè)的DNA序列采用常規(guī)方法設(shè)計(jì)DNA探針?lè)肿?，然后采用常?guī)方法對(duì)DNA探針?lè)肿舆M(jìn)行巰基修飾，將金基底的QCM芯片用巰基修飾后的DNA探針?lè)肿尤芤悍跤?，得到固定探針?lè)肿拥腝CM芯片；
步驟四、將步驟三中所述固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片用6-巰基-1-己醇孵育；
步驟五、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率F1，然后向反應(yīng)器中通入對(duì)照物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2，計(jì)算頻率Fl和頻率F2的差值A(chǔ)F ；所述DNA雜交緩沖液為磷酸鉀鹽與氯化鈉的混合水溶液， 其中磷酸鉀鹽為磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀，所述混合水溶液中鉀離子的濃度為0. IM 0. 5M，氯化鈉的濃度為0. 5M 1. 5M，混合水溶液的pH值為7. 0 7. 4 ；所述對(duì)照物為不含 DNA模板的PCR擴(kuò)增體系和DNA雜交緩沖液以1 5 10的體積比混合而成；
步驟六、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率Fl'，然后向反應(yīng)器中通入檢測(cè)物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率 F2'，計(jì)算頻率Fl'和頻率F2'的差值A(chǔ)F'，最后計(jì)算AF'和步驟五中AF的差值的絕對(duì)值F，當(dāng)F > 30Hz時(shí)判定待檢測(cè)的DNA發(fā)生甲基化；所述DNA雜交緩沖液為磷酸鉀鹽與氯化鈉的混合水溶液，其中磷酸鉀鹽為磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀，所述混合水溶液中鉀離子的濃度為0. IM 0. 5M，氯化鈉的濃度為0. 5M 1. 5M，混合水溶液的pH值為7. 0 7. 4 ；所述檢測(cè)物為PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物、DEPC水和DNA雜交緩沖液以1 2 5 3 5的體積比混合而成。
上述步驟三中所述巰基修飾的DNA探針?lè)肿尤芤旱臐舛葹? μ M 2 μ M。
上述步驟三中所述孵育的時(shí)間為0.紐 池。
上述步驟四中所述6-巰基-1-己醇的濃度為0. 5mM 5mM。
上述步驟四中所述孵育的時(shí)間為0.紐 池。
本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測(cè)工具，石英晶體微天平(Quartzcrystal microbalance, QCM)利用石英晶體的壓電效應(yīng)檢測(cè)表面質(zhì)量和厚度的微小變化。QCM被廣泛應(yīng)用于真空、氣態(tài)和液相中。Sauerbrey方程提出QCM頻率變化和單位面積上的質(zhì)量變化成簡(jiǎn)單線性關(guān)系后，QCM在真空鍍膜領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用。但是在液相條件下，Sauerbrey 方程雖然繼續(xù)成立但卻局限于較小的檢測(cè)厚度范圍內(nèi)，而實(shí)際上由于在液相條件下生物高分子的溶脹行為造成檢測(cè)厚度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這一范圍，因此導(dǎo)致液相條件下QCM的使用變得復(fù)雜。本發(fā)明根據(jù)在液相高頻振動(dòng)情況下，固定于QCM表面的生物大分子能夠帶動(dòng)周?chē)娜芤阂黄鹫駝?dòng)，從而可將QCM芯片表面的致密分子層攜帶周?chē)后w分子一起振動(dòng)的情況視為芯片表面形成特殊“固化水”層，QCM頻率變化取決于固化層的厚度和密度，液相條件下微小的厚度變化可以被高分子的溶脹行為放大，由此提出了 QCM “固化水”模型。本發(fā)明通過(guò) DNA體系的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)QCM頻率IHz的響應(yīng)可測(cè)量QCM芯片表面0. 18nm的厚度變化，使得液相條件下采用QCM檢測(cè)生物高分子更加靈敏和簡(jiǎn)便易行。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明采用對(duì)質(zhì)量變化靈敏的QCM與傳統(tǒng)的甲基化酶切技術(shù)相結(jié)合，可以有效的區(qū)分DNA的甲基化狀況，在檢測(cè)過(guò)程中沒(méi)有毒性試劑摻雜，檢測(cè)速度快，效率高，重復(fù)性良好。
2、本發(fā)明采用甲基化敏感的內(nèi)切酶對(duì)被檢測(cè)的DNA進(jìn)行酶切，DNA甲基化的位點(diǎn)得以保留，未甲基化位點(diǎn)被切斷，然后通過(guò)PCR將保留的完整序列擴(kuò)增，而未甲基化序列被打斷后無(wú)法擴(kuò)增，隨后將檢測(cè)物通過(guò)固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)物頻率變化與對(duì)照物頻率變化的差值可直接判斷待檢測(cè)DNA序列是否甲基化。
3、本發(fā)明適用于區(qū)分某一位點(diǎn)或若干位點(diǎn)的DNA甲基化，可以做精確的基因組上的甲基化定位，因而適合于基因水平的甲基化研究。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的QCM檢測(cè)圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的PCR終產(chǎn)物的電泳圖。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例2的QCM檢測(cè)圖。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例2的PCR終產(chǎn)物的電泳圖。
圖5為本發(fā)明實(shí)施例3的QCM檢測(cè)圖。
圖6為本發(fā)明實(shí)施例3的PCR終產(chǎn)物的電泳圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
He 1 a細(xì)胞ρ 16基因DNA甲基化檢測(cè)
步驟一、酶切消化待檢測(cè)的DNA 收集80%鋪滿(mǎn)的Hela細(xì)胞約100萬(wàn)個(gè)，采用天根試劑盒抽提基因組后，使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證基因組抽提成功；將基因組稀釋100倍后， 在DNA的稀釋液10μ L中加入5μ L的10 XFastDigest緩沖液和5 μ L的FastDigest HpaII 酶，30 μ L DEPC水，37°C酶切消化5分鐘后，于65°C下滅活10分鐘；
步驟二、PCR擴(kuò)增以步驟一中經(jīng)酶切消化后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下
GC 緩沖液 12. 5μ L
DEPC 7jC 9. 5 μ L
模板 DNA 1 μ L
dNTP 混合體系 1 μ L
引物(10μΜ)0· 5μ L
Tag DNA 聚合酶 0· 25 μ L ；
擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，PCR終產(chǎn)物濃度為80g/L ；
步驟三、設(shè)計(jì)DNA探針?lè)肿有蛄?SEQID NO. 1)為5' -TTT TTT TTTTTT TTT GCC CCT CCT CTT TCT TCC TC-3'，對(duì)DNA探針?lè)肿?'端進(jìn)行巰基修飾，將金基底的QCM芯片用濃度為ι μ M的巰基修飾的DNA探針?lè)肿尤芤悍跤?，得到固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片；
步驟四、將步驟三中所述固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片用濃度為0. 5mM的6_巰基-I-己醇孵育濁；
步驟五、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液(磷酸氫二鉀與氯化鈉的混合水溶液，混合水溶液中鉀離子的濃度為0. 1M，氯化鈉的濃度為0. 5M，混合水溶液的pH值為7. 4)，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率F1，然后向反應(yīng)器中通入對(duì)照物(不含模板的PCR擴(kuò)增體系和 DNA雜交緩沖液以1 5的體積比混合而成)，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2，計(jì)算頻率Fl和頻率F2的差值Δ F (見(jiàn)圖1)；
步驟六、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液(磷酸氫二鉀與氯化鈉的混合水溶液，混合水溶液中鉀離子的濃度為0. 1Μ，氯化鈉的濃度為0. 5Μ，混合水溶液的pH值為7. 4)，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率Fl'，然后向反應(yīng)器中通入檢測(cè)物(PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物、DEPC水和 DNA雜交緩沖液以1 2 3的體積比混合而成)，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2'，計(jì)算頻率Fl'和頻率F2'的差值A(chǔ)F'(見(jiàn)圖1)，計(jì)算AF'和步驟五中Δ F的差值的絕對(duì)值F，得到F為40Hz > 30Hz，判定Hela細(xì)胞pl6基因DNA發(fā)生甲基化。5
圖2是本實(shí)施例的PCR終產(chǎn)物的電泳圖，圖中1為本實(shí)施例酶切后的PCR終產(chǎn)物， 2為以未進(jìn)行酶切的Hela細(xì)胞基因組為模板得到的pl6基因的PCR產(chǎn)物，3為分子量為11Λ 的DNA對(duì)照物，從圖中可以看出，本實(shí)施例的Hela細(xì)胞pl6基因DNA發(fā)生甲基化，與本發(fā)明方法檢測(cè)的結(jié)果一致。
實(shí)施例2
Hela細(xì)胞GALR2基因DNA甲基化檢測(cè)
步驟一、酶切消化待檢測(cè)的DNA 收集80%鋪滿(mǎn)的H印G2細(xì)胞100萬(wàn)個(gè)，采用天根試劑盒抽提基因組后，使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證基因組抽提成功；將基因組稀釋100倍后， 在 DNA 的稀釋液 10μ L 中力口入 5μ L 的 IOXFastDigest buffer 禾口 5 μ L 的FastDigest HpaII 酶，30 μ L DEPC水，37°C下酶切消化5分鐘后，于65°C下滅活10分鐘；
步驟二、PCR擴(kuò)增以步驟一中經(jīng)酶切消化后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下
GC 緩沖液 12. 5μ L
DEPC 7jC 9. 5 μ L
模板 DNA 1 μ L
dNTP 混合體系 1 μ L
引物(10μΜ)0· 5μ L
Tag DNA 聚合酶 0. 25 μ L ；
擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，PCR終產(chǎn)物濃度為80g/L ；
步驟三、設(shè)計(jì)DNA探針?lè)肿有蛄?SEQID NO. 2)為5' -TTT TTT TTTTTT TAT CTC CCA GGG GTC CTC TTT TC-3'，對(duì)DNA探針?lè)肿?'端進(jìn)行巰基修飾，將金基底的QCM芯片用濃度為2 μ M的巰基修飾的DNA探針?lè)肿尤芤悍跤?. 5h,得到固定有巰基修飾的DNA探針?lè)肿拥腝CM芯片；
步驟四、將步驟三中所述固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片用濃度為5mM的6-巰基-I-己醇孵育0. 5h ；
步驟五、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液(磷酸二氫鉀與氯化鈉的混合水溶液，混合水溶液中鉀離子的濃度為0. 5M，氯化鈉的濃度為1. 5M，混合水溶液的pH值為7. 2)，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率F1，然后向反應(yīng)器中通入對(duì)照物(不含DNA模板的PCR擴(kuò)增體系和DNA雜交緩沖液以1 10的體積比混合而成)，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2，計(jì)算頻率Fl和頻率F2的差值Δ F (見(jiàn)圖3)；
步驟六、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液(磷酸二氫鉀與氯化鈉的混合水溶液，混合水溶液中鉀離子的濃度為0. 5Μ，氯化鈉的濃度為1. 5Μ，混合水溶液的pH值為7. 2)，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率Fl'，然后向反應(yīng)器中通入檢測(cè)物(PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物、DEPC水和 DNA雜交緩沖液以1 5 5的體積比混合而成)，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2'，計(jì)算頻率Fl'和頻率F2'的差值A(chǔ)F'(見(jiàn)圖幻，計(jì)算AF'和步驟五中AF的差值的絕對(duì)值F，得到F為30Hz，判定Hela細(xì)胞GALR2基因DNA發(fā)生甲基化。
圖4是本實(shí)施例的PCR終產(chǎn)物的電泳圖，圖中1為分子量為11Λ的DNA對(duì)照物，2 為本實(shí)施例酶切后的PCR終產(chǎn)物，3為以未進(jìn)行酶切的Hela細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增出 GALR2基因的PCR產(chǎn)物，從圖中可以看出，本實(shí)施例的Hela細(xì)胞GALR2基因DNA發(fā)生甲基化，與本發(fā)明方法檢測(cè)的結(jié)果一致。
實(shí)施例3
HepG2細(xì)胞GALR2基因DNA甲基化檢測(cè)
步驟一、酶切消化待檢測(cè)的DNA 收集80%鋪滿(mǎn)的H印G2細(xì)胞100萬(wàn)個(gè)，采用天根試劑盒抽提基因組后，使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證基因組抽提成功；將基因組稀釋100倍后，在 IOyL DNA 的稀釋液中力口入 5μ L 的 IOXFastDigest buffer 禾口 5 μ L 的 FastDigest HpaII酶，30 μ LDEPC水，37°C下酶切消化5分鐘后，于65°C下滅活10分鐘；
步驟二、PCR擴(kuò)增以步驟一中經(jīng)酶切消化后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下
GC 緩沖液 12. 5μ L
DEPC 7jC 9. 5 μ L
模板 DNA 1 μ L
dNTP 混合體系 1 μ L
引物(10μΜ)0· 5μ L
Tag DNA 聚合酶 0· 25 μ L ；
擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，PCR終產(chǎn)物濃度為60g/L ；
步驟三、設(shè)計(jì)DNA探針?lè)肿有蛄?SEQID NO. 2)為5' -TTT TTT TTTTTT TAT CTC CCA GGG GTC CTC TTT TC-3'，對(duì)DNA探針?lè)肿?'端進(jìn)行巰基修飾，將金基底的QCM芯片用濃度為1. 5 μ M的巰基修飾的DNA探針?lè)肿尤芤悍跤齦h，得到固定有巰基修飾的DNA探針?lè)肿拥腝CM芯片；
步驟四、將步驟三中所述固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片用濃度為2mM的6-巰基-1-己醇溶液孵育Ih ；
步驟五、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液(磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和氯化鈉的混合水溶液，混合水溶液中鉀離子的濃度為0. 3M，氯化鈉的濃度為1M，混合水溶液的pH值為7. 0)，待基線平穩(wěn)后， 讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率F1，然后向反應(yīng)器中通入對(duì)照物(不含DNA模板的PCR 擴(kuò)增體系和DNA雜交緩沖液以1 8的體積比混合而成)，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2，計(jì)算頻率Fl和頻率F2的差值Δ F (見(jiàn)圖5)；
步驟六、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液(磷酸二氫鉀與氯化鈉的混合水溶液，混合水溶液中鉀離子的濃度為0. 3Μ，氯化鈉的濃度為1Μ，混合水溶液的pH值為7. 0)，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率Fl'，然后向反應(yīng)器中通入檢測(cè)物(PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物、DEPC水和DNA 雜交緩沖液以1 4 4的體積比混合而成)，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2'，計(jì)算頻率Fl'和頻率F2'的差值A(chǔ)F'(見(jiàn)圖幻，計(jì)算AF'和步驟五中Δ F的差值的絕對(duì)值F，得到F為8Hz < 30Hz，判定H印G2細(xì)胞GALR2基因DNA沒(méi)有發(fā)生甲基化。
圖6是本實(shí)施例的PCR終產(chǎn)物的電泳圖，圖中1為以未進(jìn)行酶切的HepG2細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的GALR2基因的PCR產(chǎn)物，2為本實(shí)施例酶切后的PCR終產(chǎn)物，3 為分子量為11Λ的DNA對(duì)照物，從圖中可以看出，本實(shí)施例的H印G2細(xì)胞GALR2基因DNA沒(méi)有發(fā)生甲基化，與本發(fā)明方法檢測(cè)的結(jié)果一致。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、酶切消化待檢測(cè)的DNA，使所述待檢測(cè)DNA中未發(fā)生甲基化的CCGG位點(diǎn)被打斷；步驟二、以步驟一中經(jīng)酶切消化后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到終產(chǎn)物； 步驟三、根據(jù)待檢測(cè)的DNA序列采用常規(guī)方法設(shè)計(jì)DNA探針?lè)肿?，然后采用常?guī)方法對(duì) DNA探針?lè)肿舆M(jìn)行巰基修飾，將金基底的QCM芯片用巰基修飾后的DNA探針?lè)肿尤芤悍跤?得到固定探針?lè)肿拥腝CM芯片；步驟四、將步驟三中所述固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片用6-巰基-1-己醇孵育； 步驟五、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率F1，然后向反應(yīng)器中通入對(duì)照物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2，計(jì)算頻率Fl和頻率F2的差值A(chǔ)F ；所述DNA雜交緩沖液為磷酸鉀鹽與氯化鈉的混合水溶液，其中磷酸鉀鹽為磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀，所述混合水溶液中鉀離子的濃度為0. IM 0. 5M，氯化鈉的濃度為0. 5M 1. 5M，混合水溶液的pH值為7. 0 7. 4 ；所述對(duì)照物為不含 DNA模板的PCR擴(kuò)增體系和DNA雜交緩沖液以1 5 10的體積比混合而成；步驟六、將步驟四中孵育后的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中通入DNA雜交緩沖液，待基線平穩(wěn)后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測(cè)到的頻率Fl'，然后向反應(yīng)器中通入檢測(cè)物，待石英晶體微天平頻率變化曲線平穩(wěn)后讀取監(jiān)測(cè)到的頻率F2'，計(jì)算頻率Fl'和頻率F2'的差值A(chǔ)F'，最后計(jì)算AF'和步驟五中ΔF的差值的絕對(duì)值F， 當(dāng)F > 30Hz時(shí)判定待檢測(cè)的DNA發(fā)生甲基化；所述DNA雜交緩沖液為磷酸鉀鹽與氯化鈉的混合水溶液，其中磷酸鉀鹽為磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀，所述混合水溶液中鉀離子的濃度為0. IM 0. 5M，氯化鈉的濃度為0. 5M 1. 5M，混合水溶液的pH值為7. 0 7. 4 ；所述檢測(cè)物為PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物、DEPC水和DNA雜交緩沖液以1 2 5 3 5的體積比混合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，步驟三中所述巰基修飾的DNA探針?lè)肿尤芤旱臐舛葹? μ M 2 μ M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，步驟三中所述孵育的時(shí)間為0. 5h 池。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，步驟四中所述6-巰基-1-己醇的濃度為0. 5mM 5mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，步驟四中所述孵育的時(shí)間為0. 5h 池。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用石英晶體微天平檢測(cè)DNA甲基化的方法，該方法為一、酶切消化待檢測(cè)的DNA；二、PCR擴(kuò)增；三、制備固定有探針?lè)肿拥腝CM芯片；四、將芯片用6-巰基-1-己醇孵育；五、將芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，向反應(yīng)器中通入對(duì)照物，計(jì)算頻率差值ΔF；六、將芯片裝入石英晶體微天平的反應(yīng)器中，向反應(yīng)器中通入檢測(cè)物，計(jì)算頻率差值ΔF′，計(jì)算ΔF′與ΔF的差值的絕對(duì)值F，當(dāng)F≥30Hz時(shí)判定待檢測(cè)的DNA發(fā)生甲基化。本發(fā)明采用對(duì)質(zhì)量變化靈敏的QCM與傳統(tǒng)的甲基化酶切技術(shù)相結(jié)合，可有效區(qū)分DNA的甲基化狀況，在檢測(cè)過(guò)程中沒(méi)有毒性試劑摻雜，檢測(cè)速度快，效率高，重復(fù)性良好。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102505043SQ201110327039
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者朱志強(qiáng), 汪杰, 馬宏偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所