專利名稱：多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
1993年，Lancet首次報道降鈣素原(前降鈣素，PCT)水平在敗血癥時顯著升高，血PCT濃度大于O. 5ng/ml時提示敗血癥可能,大于2ng/ml提示敗血癥的存在,大于10ng/ml則提示嚴重的膿毒敗血癥或休克，PCT可作為診斷膿毒敗血癥的特異性指標。近年，隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，細菌感染早期往往已經(jīng)有PCT的低水平升 高(O. lng/ml O. 5ng/ml), PCT升高水平與細菌性感染嚴重程度及范圍有關(guān)，PCT水平大于O. 25ng/ml時即建議使用抗生素治療。正常健康人群PCT水平極低(小于O. 05ng/ml)，非細菌性感染或炎癥(如病毒性感染，真菌性感染或自身免疫性炎癥等)往往不伴隨PCT的升高或輕微升高，因此PCT不僅能作為敗血癥的診斷指標，更廣泛應(yīng)用于細菌性感染的早期診斷和鑒別診斷，指導(dǎo)臨床抗生素使用，并用于治療療效及預(yù)后監(jiān)測。采用膠體金標記的降鈣素原檢測試劑盒有檢測快速、操作簡便的特點，但常規(guī)技術(shù)下的降鈣素原膠體金免疫層析試劑檢測靈敏度很難達到O. 25ng/mL·申請?zhí)枮?3118343. X (
公開日1993·8· 19)的專利文件披露了一種用于實現(xiàn)早期檢測敗血癥并對治療進行跟蹤的方法的藥盒，該藥盒能夠測定前降鈣素含量為O. I 500ng/ml血清或血漿，進而判斷敗血癥的存在，嚴重程度以及/或者對敗血癥的治療效果；該藥盒具體包含兩種抗體(I) 一個或多個固定在載體上用以與樣品中的前降鈣素結(jié)合的第一單克隆或多克隆抗體；(2)另一攜帶標記并且與前降鈣素在不同于第一抗體的結(jié)合區(qū)域的另一區(qū)域相結(jié)合的抗體。該藥盒能夠?qū)崿F(xiàn)的技術(shù)效果是通過測定患者體液樣品中的肽前降鈣素和/或其形成的非完整降鈣素片斷的含量，通過測定這種確定的肽是否存在，含量的多少，得出有關(guān)是否有敗血癥，敗血癥的嚴重程度以及/或者治療效果的結(jié)論。然而，前述專利文獻披露的技術(shù)方案存在諸多技術(shù)缺陷，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常識很明顯可以知曉，前述專利中的所謂的“一個或多個固定在載體上用以與樣品中的前降鈣結(jié)合的第一單克隆或多克隆抗體”，其本質(zhì)是前降鈣素的捕獲抗體，但是，在該技術(shù)方案中，對應(yīng)的標記抗體僅為一種。專利文獻在其說明書第4頁指出本發(fā)明意義上的“前降鈣素”表示一種或多種肽；所有這些肽都包含由57個以上氨基酸組成的肽序列，特別是象完整的前降鈣素那樣的116個氨基酸序列，它們或與已知的序列一致，或者部分一致，只是在相應(yīng)于前降鈣素的第108至116個氨基酸區(qū)域可能存在差異。顯然，專利文獻中所述的僅一種標記抗體是無法實現(xiàn)對多種“前降鈣素”片段進行有效標記的，從而無法保證盡可能多位點結(jié)合的“前降鈣素”被檢測出來，如果在此專利技術(shù)上采用膠體金、彩色磁珠等顯色劑作為標記物標記單個抗體，將導(dǎo)致檢測的靈敏度偏低，實踐應(yīng)用效果大打折扣。例如來自于該專利技術(shù)的降鈣素原膠體金免疫層析試劑PCT-Q所能實現(xiàn)的檢測下限僅僅為O. 5ng/ml,該專利為德國B. R. A. H. M. S所用，只可以滿足敗血癥的篩查診斷,而不能達到用于細菌感染診斷和指導(dǎo)抗生素應(yīng)用的O. lng/ml的檢測靈敏度需求；分析其原因，通過膠體金、彩色磁珠等標記抗體實現(xiàn)檢測，是基于膠體金、彩色磁珠具有顯色性，當一定量的膠體金或彩色磁珠通過被標記抗體與待測抗原結(jié)合后，通過待測抗原與捕獲抗體的結(jié)合使得膠體金顆?；虿噬胖轭w粒聚集在一起，則形成肉眼可見的線條，當待測抗原濃度越高，則聚集在一起的膠體金或磁珠越多，線條的強度就越強，通過配套的儀器進行分析判讀，就可測出待測抗原的濃度。以膠體金為例，常規(guī)用于抗體標記的膠體金顆粒的直徑多在20 40nm，膠體金顆粒之間存在空間位阻，如果只是標記針對降鈣素原某一個區(qū)域的一個抗體，那么能結(jié)合在抗體上的膠體金的數(shù)量是有限的，當待測降鈣素原的濃度很低時，能夠結(jié)合的這一個標記抗體的數(shù)量也是很少的，因此即便采用多個抗體作為捕獲抗體，能夠通過標記抗體而被捕獲聚集的膠體金的數(shù)量也較少，難以形成肉眼可見的線條，因此難以達到較高的檢測靈敏度。而采用本技術(shù)方案進行不同區(qū)域的多抗體標記，待測的降鈣素原可以結(jié)合不同區(qū)域的標記抗體，那么能夠結(jié)合在降鈣素原上的膠體金顆粒更多，即便在檢測濃度很低的降鈣素原時，其能夠聚集的膠體金顆粒更多更易產(chǎn)生可被分析的線條，從而 顯著提高檢測靈敏度。中國發(fā)明專利申請CN101029897A (
公開日2007· 9. 5)披露了一種降鈣素原測試試劑盒及其測試方法，該方法采用納米免疫磁性微珠作為分離試劑，發(fā)光標記物采用抗PCT單克隆抗體標記異魯米諾衍生物，采用本發(fā)明所述的PCT試劑盒及其測試方法，基于化學發(fā)光法檢測靈敏度可達到pg/ml級別的特點，雖然其標記抗體僅為一種，但其仍可具備較高的靈敏度，可實現(xiàn)PCT在細菌感染診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，但是，化學發(fā)光試劑需要配套的大型化學發(fā)光儀器，且不能直接檢測全血，檢測時需要標本離心、稀釋、校準等多重步驟，操作過程繁復(fù)，檢測時間長，不適合快速診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，能實現(xiàn)O. I 200ng/ml濃度范圍的PCT檢測，用于細菌性感染的診斷、鑒別診斷、治療療效監(jiān)測及預(yù)后評估。同時標記針對降鈣素原不同位點的抗體，可更好地克服膠體金等標記物的空間位阻影響，使得不同區(qū)域的標記抗體可最大化地與降鈣素原結(jié)合，提高靈敏度，并且由于配伍的抗體對中含有針對降鈣素原特異性肽片段的抗體，可特異性識別降鈣素原，并將其與降鈣素區(qū)分開來，從而實現(xiàn)高靈敏度及高特異性檢測的性能。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒；所述試劑盒包含常規(guī)載體以及(I)固定在所述常規(guī)載體上的對應(yīng)降鈣素原不同區(qū)域的單克隆或多克隆的捕獲抗體；以及(2)與(I)所述的捕獲抗體配伍的，以合適標記物標記的多個針對降鈣素原相同或不同區(qū)域的單克隆或多克隆抗體。優(yōu)選地，所述捕獲抗體對應(yīng)降鈣素原不同區(qū)域指的是降鈣素原的N端區(qū)域或C端區(qū)域。優(yōu)選地，所述與捕獲抗體配伍的單或多克隆抗體針對的降鈣素原相同或不同區(qū)域指的是降鈣素區(qū)域和C端區(qū)域，或降鈣素區(qū)域和N端區(qū)域。優(yōu)選地，所述試劑盒中，每種被標記抗體的用量均小于該抗體單獨標記時且能穩(wěn)定標記物溶液的最低用量，進而保證每種抗體能夠被標記物有效標記。優(yōu)選地，所述標記物為膠體金、彩色磁珠或乳膠顆粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，通過標記與包被多抗體對的不同識別區(qū)域及空間配伍，能夠最大限度地捕捉樣本中降鈣素原，提高檢測靈敏度；本發(fā)明的試劑盒將PCT的檢測靈敏度由O. 5ng/ml提高O. lng/ml,能實現(xiàn)O. I 200ng/ml的PCT，檢測拓展了 PCT快速檢測試劑在細菌性感染診斷、鑒別診斷及治療中的應(yīng)用價值及范圍，可用于細菌性感染的診斷、鑒別診斷、治療療效監(jiān)測及預(yù)后評估；同時，由于配伍的抗體對中含有針對降鈣素原特異性肽片段的抗體，可特異性識別降鈣素原，并將其與降鈣素區(qū)分開來，從而實現(xiàn)高靈敏度及高特異性檢測的性能；本發(fā)明的試劑盒在使用時僅用15分鐘即可實現(xiàn)全部檢測過程，效率得到大大提聞;本發(fā)明的試劑盒可用于直接檢測全血，真正實現(xiàn)一步式操作；因此，采用本發(fā)明的PCT檢測試劑，既保證了檢測的簡便、快速，又通過多抗體標記實現(xiàn)了常規(guī)快速檢測試劑難以達到的高靈敏度，對于推進細菌感染的及時準確診斷及抗生素的規(guī)范應(yīng)用，具有重要的社會意義。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的研究，克服了諸多的技術(shù)問題，進而獲得本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的發(fā)明人對于解決針對降鈣素原或其肽進行捕獲抗體與標記抗體的配伍選擇和實現(xiàn)有效的多抗體標記等技術(shù)難題付出了創(chuàng)造性的勞動。本發(fā)明在選擇最佳配伍抗體時，首先進行單個抗體標記，如捕獲抗體為N端區(qū)域單克隆和(或)多克隆抗體，則對降鈣素區(qū)域與C端區(qū)域的抗體單獨標記后，分別與捕獲抗體組合測試，選取靈敏度最高的標記抗體；捕獲抗體為C端區(qū)域單克隆和(或)多克隆抗體，則對降鈣素區(qū)域與N端區(qū)域的抗體單獨標記后，分別與捕獲抗體組合測試，選取靈敏度最高的標記抗體。不同區(qū)域的標記抗體確定后，則通過小樣試驗對多種標記抗體的標記濃度和標記PH值進行確定。首先找出每種標記抗體能穩(wěn)定標記物溶液的最低用量。兩種抗體同時標記時，每種抗體的用量為最低用量80%，而三種或以上抗體同時標記時，則每種抗體的用量為最低用量的40%。確定抗體的標記濃度后,則混合抗體,按照常規(guī)確定標記PH值的方法確定PH值后，之后進行批量標記。本發(fā)明的試劑盒中，被標記的多個抗體需根據(jù)與捕獲抗體配伍的靈敏度進行篩選而不是隨意配伍，備選抗體單個標記后與相應(yīng)的捕獲抗體配伍，同一區(qū)域中檢測靈敏度最高的抗體確定為最終標記抗體；同時，多抗體標記時最佳PH值通過梯度PH值的小樣測試確定，采用525nm波長處光密度值最高組的PH值為最佳標記PH。實施例、以膠體金為標記物的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒步驟一,確定捕獲抗體與標記抗體(I)選擇兩個針對降鈣素原N端區(qū)域的單克隆抗體，或者選取I個單克隆抗體與I個多克隆抗體，將其混合后固定在纖維素膜上作為捕獲抗體，選擇多個針對降鈣素區(qū)域和C端區(qū)域的單克隆或多克隆抗體作為標記抗體；前述涉及的單克隆抗體、多克隆抗體均可以通過公開渠道獲得；(2)分別用膠體金標記針對降鈣素區(qū)域和C端區(qū)域的單克隆或多克隆抗體，并分別以0D25的濃度噴涂到金標墊上，37°C烘干；(3)與捕獲抗體進行組合測試，采用常規(guī)技術(shù)篩選出針對降鈣素區(qū)域和C端區(qū)域 檢測靈敏度最高的單克隆或多克隆抗體，作為最終的標記抗體；步驟二 ,確定最佳標記濃度和pH值( I)確定每個抗體的最小標記量；①根據(jù)待標記抗體的等電點，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管Iml ；②將標記蛋白以標記緩沖液做系列稀釋為5 μ g/ml 40 μ g/ml，分別取Iml，加入上列金膠溶液中，混勻，對照管只加Iml稀釋液；③5min后，在上述各管中加入O. Iml 10%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察；④結(jié)果觀察，對照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變；以穩(wěn)定Iml膠體金溶液紅色不變的最低抗體用量，即為該抗體的最小標記量；經(jīng)實驗降隹丐素區(qū)域的抗體最小標記量為10ug/ml膠體金溶液,C端區(qū)域的抗體最小標記量為12ug/ml膠體金溶液；(2)確定降I丐素區(qū)域的抗體以8ug、C端區(qū)域的抗體以9. 6ug加入Iml膠體金溶液中為最終標記濃度，以此濃度尋找最佳標記PH值；①采用16ug降I丐素區(qū)域的抗體及19. 2ugC端區(qū)域的抗體/ I. 8ml膠體金比例來確定最佳pH值；②設(shè)置pH 梯度pH6. O，6. 5，7. O，7. 5，8. O，8. 5，9. O，9. 5 標記緩沖液；③取8個試管，按照順序，分別加入400ul ddH20, 200ul不同pH值的標記緩沖液，混合的待標抗體，膠體金溶液I. 8ml，混合均勻后靜置5 lOmin，加入10%的NaCl溶液200ul ；④若出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象的首先去除；若目測無法明確的需在525nm處檢測OD值，選擇0D525最高的pH值，結(jié)果證明pH值為7. 5最為合適；步驟三,按照確定的抗體濃度和最佳PH值標記抗體(I)根據(jù)用以標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記抗體的總量；(2)在電磁攪拌下,將抗體溶液加入已調(diào)定pH值為7. 5的膠體金溶液中,加入蛋白質(zhì)時應(yīng)逐滴加入，Img的蛋白質(zhì)大約5min加完；(3)在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%，攪拌15分鐘；(4)將標記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化；步驟四，將標記好的膠體金以0D25的濃度噴涂到玻璃纖維上形成金標墊，37°C烘干;
步驟五，將捕獲抗體(鼠源性)以合適濃度噴點到硝酸纖維素膜已確定位置上形成檢測線(T線)，將羊抗鼠IgG抗體以合適濃度噴點到硝酸纖維素膜另一確定位置上形成對照線(C線)；步驟六，將金標墊、硝酸纖維素膜、樣品墊、濾血膜及吸水紙按位置拼貼成試劑板，切條裝殼，即形成降鈣素原檢測試劑卡；步驟七，用濃度O. I 200ng/ml的降鈣素原標準品進行測試，放入配套儀器中判讀，其檢測靈敏度可達O. lng/ml，而此前單抗體標記的檢測試劑，最高靈敏度組其靈敏度僅能達到O. 4ng/ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如下事實，標記物選擇彩色磁珠或乳膠顆粒時，本發(fā)明的試劑盒也可以實現(xiàn)同樣的實施效果，實現(xiàn)高靈敏度及高特異性檢測的性能，而此時，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需付出創(chuàng)造性的勞動。綜上所述，本發(fā)明的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，通過標記與包被多抗體對的不同識別區(qū)域及空間配伍，能夠最大限度地捕捉樣本中降鈣素原，提高檢測靈敏度；本發(fā)明的試劑盒將PCT的檢測靈敏度提高至O. lng/ml，能實現(xiàn)O. I 200ng/ml的PCT檢測拓展了 PCT快速檢測試劑在細菌性感染診斷、鑒別診斷及治療中的應(yīng)用價值及范圍，可用于細菌性感染的診斷、鑒別診斷、治療療效監(jiān)測及預(yù)后評估。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含常規(guī)載體以及 (I)固定在所述常規(guī)載體上的對應(yīng)降鈣素原不同區(qū)域的單克隆或多克隆的捕獲抗體； 以及(2)與(I)所述的捕獲抗體配伍的，以合適標記物標記的多個針對降鈣素原相同或不同區(qū)域的單克隆或多克隆抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，其特征是，所述捕獲抗體對應(yīng)降鈣素原不同區(qū)域指的是降鈣素原的N端區(qū)域或C端區(qū)域。
3.如權(quán)利要求I所述的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，其特征是，所述與捕獲抗體配伍的單或多克隆抗體針對的降鈣素原相同或不同區(qū)域指的是降鈣素區(qū)域和C端區(qū)域，或降鈣素區(qū)域和N端區(qū)域。
4.如權(quán)利要求I所述的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，其特征是，所述試劑盒中，每種被標記抗體的用量均小于該抗體單獨標記時且能穩(wěn)定標記物溶液的最低用量，進而保證每種抗體能夠被標記物有效標記。
5.如權(quán)利要求I所述的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，其特征是，所述標記物為膠體金、彩色磁珠或乳膠顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測技術(shù)領(lǐng)域的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，所述試劑盒包含常規(guī)載體以及固定在所述常規(guī)載體上的對應(yīng)降鈣素原不同區(qū)域的單克隆或多克隆的捕獲抗體；以及與所述的捕獲抗體配伍的，以合適標記物標記的多個針對降鈣素原相同或不同區(qū)域的單克隆或多克隆抗體。本發(fā)明的多抗體標記的降鈣素原快速檢測試劑盒，通過標記與包被多抗體對的不同識別區(qū)域及空間配伍，能夠最大限度地捕捉樣本中降鈣素原，提高檢測靈敏度；本發(fā)明的試劑盒將PCT的檢測靈敏度提高至0.1ng/ml，拓展了PCT快速檢測試劑在細菌性感染診斷、鑒別診斷及治療中的應(yīng)用價值及范圍，可用于細菌性感染的診斷、鑒別診斷、治療療效監(jiān)測及預(yù)后評估。
文檔編號G01N33/68GK102928606SQ20121046425
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者陳莉莉, 王穎 申請人:武漢明德生物科技有限責任公司