專利名稱：一種檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉的免疫傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于致病真菌快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是基于抗原與抗體反應(yīng)，用于檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的曲霉菌的無標記型免疫生物傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是一種劇毒和強致癌物質(zhì)，為迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種，1988年即定為I級致癌物，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。黃曲霉毒素分布范圍很廣，幾乎所有谷物、飼料和各種食品(包括畜產(chǎn)品)都可作為產(chǎn)黃曲霉毒素菌的生長基質(zhì)，嚴重危害人類的健康。而預(yù)防黃曲霉毒素的危害，首要條件是能夠快速準確地檢測出谷物、食品等是否受產(chǎn)黃曲霉毒素曲霉菌的污染。目前，產(chǎn)黃曲霉毒素曲霉菌的檢測方法主要包括傳統(tǒng)鑒別培養(yǎng)基法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、PCR及RT-PCR技術(shù)。鑒別培養(yǎng)基法取材方便，但樣品預(yù)處理復(fù)雜、操作過程比較繁瑣、檢測周期長，敏感度低，費時又費力。ELISA需要特殊的儀器設(shè)備，檢測步驟較為繁瑣、費用高、檢測時間長，且易出現(xiàn)假陽性。多重PCR、實時熒光定量 PCR的分子水平的檢測方法的發(fā)展雖然比傳統(tǒng)方法具有優(yōu)越性，但所需儀器設(shè)備昂貴、檢測過程復(fù)雜、成本較高、對檢測環(huán)境和操作人員專業(yè)技術(shù)要求較高、所使用的試劑對人體和環(huán)境均有較大的危害，且由于產(chǎn)毒基因的復(fù)雜性使此方法特異性欠佳。因此建立一種靈敏、快速、簡便、特異性高且經(jīng)濟的檢測方法是生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)、質(zhì)控人員、進出口檢商、政府管理部門的迫切需要和食品、環(huán)境安全的有力保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供了一種用于檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉的免疫傳感器，是將含巰基的L-半胱氨酸、納米金和寄生曲霉菌多抗依次修飾到金電極上，得到免疫電化學傳感器。優(yōu)選地，所述的L-半胱氨酸用0. 1-0. 3mol/L醋酸鹽緩沖液進行溶解的。優(yōu)選地，所述的納米金為10nm-20nm的納米金顆粒。進一步地，所述的寄生曲霉菌多抗可以購買商品化的產(chǎn)品或自制得到，具體方法見參考文獻(Yong and Cousin，2003. Detection of moulds producing af latoxins in maize and peanuts by an immunoassay. International Journal of Food Microbiology 65 (27))，是利用搖床培養(yǎng)制取寄生曲霉菌絲體蛋白免疫原，免疫健康雄性新西蘭大白兔而制備的多克隆抗體。更進一步地，所述的的金電極是指直徑為2mm且置于Piranha溶液中浸泡IOmin 后，分別用0. 3 μ m、0. 05 μ m的Al2O3拋光粉打磨后，在無水乙醇、超純水中各超聲5min的金電極。本發(fā)明還提供了一種上述免疫電化學傳感器的制備方法，是將金電極浸沒于
3L-半胱氨酸溶液中，保溫浸泡。然后，沉積納米金，2-6°C靜置過夜，取出后，用超純水洗滌、 吹干。電極表面涂滴寄生曲霉菌多抗并孵育。最后滴加脫脂乳-PBS溶液，作為遮蔽試劑進行封閉，用超純水洗滌干凈。 所述L-半胱氨酸溶液濃度為0. 3 % -0. 7 % (m/v)，優(yōu)選濃度為0. 5 % (m/v)。所述保溫浸泡的溫度為35_40°C，浸泡3H所述靜置過夜溫度優(yōu)選4°C。所述在電極表面涂滴寄生曲霉菌多抗優(yōu)選為3-15 μ L0所述遮蔽試劑封閉過程優(yōu)選滴加5%脫脂乳-PBS溶液10 μ L，于37°C反應(yīng)后用超純水洗滌干凈。本發(fā)明所述寄生曲霉菌優(yōu)選分泌黃曲霉毒素的寄生曲霉GIM3. 395(廣東微生物菌種保藏中心 http //www. gimcc. net/)。本發(fā)明還提供了一種上述免疫傳感器檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉的方法，包括以下步驟1)待測樣本滴加于免疫傳感器的工作電極表面，37°C下孵育30min ；2)免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測底液為含0. lmol/LKCl的2. 5mmol的鐵氰化鉀緩沖液；3)設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，進行循環(huán)伏安(CV)以及交流阻抗(EIS)測定。實驗結(jié)果顯示隨著寄生曲霉菌濃度地增加，其阻抗值增加。定義在封閉之后的免疫工作電極的阻抗值為Rtl,抗原抗體反應(yīng)后的電極阻抗值為Rx，并計算ARrt = Rx-R0,以 ARet對GIM3. 395的稀釋度作圖可得到線性曲線。寄生曲霉菌濃度在75-1500cfu/mL范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 99114。最低檢測限可達到18cfu/mL。本發(fā)明有如下的有益效果由于納米金顆粒有很好地促進生物電活性分子的電子傳遞，并易于固定生物分子并能保持其活性，并且由于L-半胱氨酸的作用，抗體有效地固定在修飾金電極表面，并保持了較高的活性。本發(fā)明的免疫傳感器操作簡便、價格低廉、特異性強、靈敏度高、響應(yīng)時間短，可實現(xiàn)對產(chǎn)毒曲霉菌寄生曲霉GIM3. 395的直接檢測，適合基層或現(xiàn)場檢測。本發(fā)明適用于食品工業(yè)、飼料行業(yè)和環(huán)境保護等領(lǐng)域快速檢測出早期產(chǎn)黃曲霉素曲霉菌，以有效地預(yù)防黃曲霉毒素的產(chǎn)生。


圖1是免疫傳感器工作原理示意圖；圖中(a)自組裝L-半胱氨酸單分子層(b)納米金顆粒吸附(C)產(chǎn)黃曲霉毒素曲霉菌抗體的吸附(d)脫脂乳進行位點封閉(e)抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)圖2是修飾電極不同條件下的循環(huán)伏安圖；圖中(a) L-半胱氨酸修飾后金電極(b)納米金L-半胱氨酸修飾后金電極(c)抗體/納米金L-半胱氨酸修飾后金電極(d)脫脂乳封閉后的修飾電極圖3是納米粒子的電子掃描顯微鏡照片(80000倍)。圖4是免疫傳感器對不同濃度的寄生曲霉GIM3. 395的EIS響應(yīng)圖中(a) 75cfu/mL (b) 88cfu/mL (c) 167cfu/mL (d) 300cfu/mL (e) 1500cfu/mL(f) 3000cfu/mL (g) 6000cfu/mL (h) 7500cfu/mL (i)lOOOOcfu/mL (j) 15000cfu/ mL (k)30000cfu/mL
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。實施例1步驟一，免疫傳感器的構(gòu)建將裸金電極打磨、清洗后，先浸沒于0. 3% -0. 7% (m/ ν)的L-半胱氨酸中，35-40°C保溫浸泡3H然后，4°C靜置過夜沉積納米金，取出后，用超純水洗滌、吹干。電極表面涂滴3-15 μ L自制多抗，37°C孵育lh。最后滴加5%脫脂乳-PBS 溶液10 μ L，作為遮蔽試劑對非特異性吸附位點進行封閉，于37°C反應(yīng)后用超純水洗滌干凈。未立即使用的電極需用氮氣吹干后，置于pH為7. 4的PBS于4°C保存待用。步驟二，免疫傳感器對寄生曲霉菌孢子液的檢測寄生曲霉菌于^°C，PDA斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天，用IOmL的含0. 05 %吐溫的霉菌蒸餾水洗脫孢子，制備孢子懸浮液。調(diào)整孢子濃度為1.5X106cfu/mL，后對孢子液進行無菌梯度稀釋。將修飾好的免疫電極浸入不同梯度的稀釋液中，孢子液抗原與電極上的抗體進行37°C下孵育反應(yīng)30min，在 0. lmol/LKCl的2. 5mmol的鐵氰化鉀緩沖液中進行EIS測定。EIS的測試條件初始電位為 0.2￥，振幅0.05￥，頻率范圍為1 IOOkHz，靜置時間為2s，所有測試均在室溫下進行。定義在封閉之后的免疫工作電極的阻抗值為Rtl，抗原抗體反應(yīng)后的電極阻抗值為Rx，并計算 ARrt = Rx-Rtl，以ARrt對標準菌株寄生曲霉的稀釋度作圖可得到線性曲線，實現(xiàn)對產(chǎn)黃曲霉毒素曲霉寄生曲霉菌孢子液的檢測。實施例2自然發(fā)酵豆醬實際樣品中加標寄生曲霉菌的測定步驟一，自然發(fā)酵豆醬樣品的處理豆醬樣品磨細后滅菌，在無菌操作下取2g豆醬，用1 1000的滅菌超純水進行稀釋，并加入寄生曲霉菌孢子標準品，使其最終濃度為 150-1500cfu/mL。并配置一個不含寄生曲霉菌孢子的豆醬的空白對照。步驟二，免疫傳感器的構(gòu)建將裸金電極打磨、清洗后，先浸沒于0.5% (m/v)的 L-半胱氨酸中，37°C保溫浸泡證。然后，4°C靜置過夜沉積納米金，取出后，用超純水洗滌、 吹干。電極表面涂滴1(^1^自制多抗，371孵育111。最后滴加5%脫脂乳-PBS溶液10 μ L， 作為遮蔽試劑對非特異性吸附位點進行封閉，于37°C反應(yīng)后用超純水洗滌干凈。未立即使用的電極需用氮氣吹干后，置于pH為7. 4的PBS于4°C保存待用。步驟三，自然發(fā)酵豆醬實際樣品中加標寄生曲霉菌GIM3. 395的測定將修飾好的免疫電極浸入不同加標豆醬樣品液中，加標抗原與電極上的抗體進行37°C下孵育反應(yīng) 30min，在0. lmol/L KCl的2. 5mmol的鐵氰化鉀緩沖液中進行EIS測定。查工作曲線得到曲霉菌濃度，計算回收率，回收率結(jié)果如表1。表1為免疫傳感器自然發(fā)酵豆醬實際樣品中寄生曲霉菌加標回收率及誤差結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉菌的免疫生物傳感器，其特征在于，是將含巰基的L-半胱氨酸、納米金、寄生曲霉菌多抗依次修飾到金電極上得到的生物傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述傳感器，其特征在于，所述的L-半胱氨酸用0.1-0.3mol/L醋酸鹽緩沖液進行溶解，L-半胱氨酸溶液濃度為0. 3%-0. 7%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述傳感器，其特征在于，所述的納米金為10nm-20 nm的納米金顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述傳感器，其特征在于，所述的的金電極是指直徑為2mm且置于 Piranha溶液中浸泡10 min后，分別用0. 3 μ m、0 . 05 μ m的Al2O3拋光粉打磨后，在無水乙醇、超純水中各超聲5min的金電極。
5.一種檢測寄生曲霉菌免疫生物傳感器的制備方法，其特征在于，將金電極浸沒于 L-半胱氨酸溶液中，保溫浸泡；沉積納米金，2-6°C靜置過夜，取出后，用超純水洗滌、吹干； 電極表面涂滴寄生曲霉菌多抗并孵育；滴加脫脂乳-PBS溶液，作為遮蔽試劑進行封閉，用超純水洗滌干凈。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，具體方法如下將金電極浸沒于0.5%的 L-半胱氨酸溶液中，37°C保溫浸泡5 h;然后，沉積納米金，4°C靜置過夜，取出后，用超純水洗滌、吹干；電極表面涂滴IOyL自制多抗，37°C孵育Ih;最后滴加5%脫脂乳-PBS溶液 10 μ L，作為遮蔽試劑進行封閉，于37°C反應(yīng)后用超純水洗滌干凈。
7.—種權(quán)利要求1所述傳感器的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟1)待測樣本滴于如權(quán)利要求1所述免疫傳感器的工作電極表面，37°C下孵育30min；2)免疫傳感器置于電解池中，電解池的測試液為含0.lmol/LKCl的2. 5mmol的鐵氰化鉀緩沖液；3)設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，進行循環(huán)伏安以及交流阻抗測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉菌的免疫生物傳感器及其制備方法，通過將納米金、L-半胱氨酸、寄生曲霉菌多抗自組裝修飾到金電極上得到。它將納米金的化學放大功能與免疫傳感器的特異性相結(jié)合，融合兩者的優(yōu)點，使其同時具備免疫反應(yīng)的特異性和電化學分析的快速性和靈敏性，能準確地進行低含量的產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉菌的檢測。
文檔編號G01N33/569GK102520168SQ20111038172
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者吳龍云, 孫秀蘭, 張銀志, 晏麗, 王淼, 趙建新 申請人:江南大學