一種電化學(xué)傳感器、制備方法及其在快速檢測黃曲霉毒素b1中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種電化學(xué)傳感器、制備方法及其在快速檢測黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用，該電化學(xué)傳感器包括三電極體系和檢測池，三電極體系包括工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極，所述工作電極為修飾的金電極；所述檢測池內(nèi)裝有電活性指示劑與緩沖液組成的檢測底液，利用DNA修飾電極對AFB1進(jìn)行電化學(xué)檢測，不需要昂貴的單克隆AFB1抗體，解決了一般色譜法、免疫學(xué)檢測方法操作復(fù)雜、成本昂貴、進(jìn)樣量高、耗時(shí)長等問題，實(shí)現(xiàn)了AFB1的即時(shí)檢測，具有方便快捷、檢測的靈敏度高，檢測限低至10 ng/mL、需要樣品量少、檢測成本極低、干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對AFB1快速、簡便、準(zhǔn)確的定量檢測。
【專利說明】一種電化學(xué)傳感器、制備方法及其在快速檢測黃曲霉毒素BI
中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種電化學(xué)傳感器、制備方法及其在快速檢測黃曲霉毒素BI中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)估計(jì)，每年全世界有25%的糧食作物受到霉菌毒素的污染。聯(lián)合國糧農(nóng)組織估算，全世界每年由此造成的經(jīng)濟(jì)損失有數(shù)千億美元。因而，飼料霉菌毒素感染己成為飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問題。
[0003]飼料在自然條件下污染所產(chǎn)生的毒素有很多種，其中黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是飼料中最具代表性的霉菌毒素，且以黃曲霉毒素Bl(AFBl)的毒性最為厲害。黃曲霉毒素屬劇毒物質(zhì)，由有毒的黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生，所有的家畜和人類對黃曲霉毒素都是敏感的，當(dāng)飼料中黃曲霉毒素含量大于1000 yg/kg時(shí)可導(dǎo)致畜禽死亡。此外，黃曲霉毒素及其代謝產(chǎn)物能殘留在動(dòng)物體臟器(肝臟、腎臟)中，并且隨乳汁、蛋排出。由于黃曲霉毒素有耐高溫的特性，常規(guī)烹飪條件下并不能使黃曲霉毒素分解，因此食用黃曲霉毒素污染的禽類產(chǎn)品(肝臟、蛋制品)會(huì)對人體造成危害。
[0004]電化學(xué)傳感器通過與被測物質(zhì)發(fā)生作用并產(chǎn)生與物質(zhì)濃度成一定比例的電信號來工作的。目前用于檢測AFB的電化學(xué)傳感器多電化學(xué)免疫傳感器，如Rameil S.，Schubert P., Grundmann P., et al.Use of 3-(4-hydroxyphenyl)prop1nic acid aselectron donating compound in a potent1metric aflatoxin M1-1mmunosensor.Anal.Chim.Acta, 2010，661: 122-127，采用蘇木精和槲皮素修飾的鉛筆芯電極在AFBl的檢測中取得了良好的效果。但是這些基于免疫學(xué)的方法都需要對電極進(jìn)行長時(shí)間的預(yù)處理，利用抗原-抗體免疫親和的方法，抗體的制備成本高，對環(huán)境要求較為嚴(yán)苛，不利于長時(shí)間保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種電化學(xué)傳感器、制備方法及其在快速檢測黃曲霉毒素BI中的應(yīng)用。通過對DNA修飾電極與樣品底液中的黃曲霉毒素BI (AFBI)之間反應(yīng)后導(dǎo)致DNA損傷，電流信號降低與AFBl濃度成比例關(guān)系，進(jìn)一步得到樣品中AFBl的含量，提供一種靈敏度高、特異性好、操作方法簡便的檢測方法。
[0006]本發(fā)明公開了一種電化學(xué)傳感器，包括三電極體系和檢測池，所述三電極體系包括工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極，所述工作電極為修飾的金電極;所述檢測池內(nèi)裝有電活性指示劑與緩沖液組成的檢測底液。
[0007]優(yōu)選的是，所述電活性指示劑與緩沖液的體積比為1:9。
[0008]上述任一方案優(yōu)選的是，所述電活性指示劑為亞甲基藍(lán)溶液，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液。
[0009]上述任一方案優(yōu)選的是，所述電活性指示劑為60μΜ的亞甲基藍(lán)溶液，所述的緩沖液為0.2 Μ、ρΗ 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。
[0010]本發(fā)明還公開了一種上述電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)用0.2M PB將HS-ssDNA配制成濃度為100 μΜ的HS-ssDNA溶液，用0.2 M PB緩沖溶液將HS-ssDNA的互補(bǔ)序列配制成4 μΜ的目標(biāo)DNA溶液;HS-ssDNA序列為AGT TGC AGG GATAGG CAG GTG GCT AGA GAG，可由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
(2)修飾金電極的制備:
將修飾過的金電極浸入50 yL步驟(I)配制的100 μΜ的HS-ssDNA溶液中，在4 °C自組裝過夜，用二次水充分淋洗，即得到ssDNA修飾的金電極ssDNA/GE;
再將ssDNA-Au電極浸入50 yL步驟(I)配制的4 μΜ目標(biāo)DNA溶液，37 °(:溫育，用0.2 M的PB緩沖溶液充分淋洗，得到雜交后的dsDNA修飾的金電極dsDNA/GE;
(3)檢測底液的制備:分別取4.5mL的0.2 M I3B緩沖溶液和0.5 mL 60 μΜ的亞甲基藍(lán)溶液加入到檢測池中，混合均勻即得到檢測底液；
(4)將步驟(2)得到的dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成三電極體系插入步驟(3)制備的檢測底液中，即為電化學(xué)傳感器。
[0011 ] 優(yōu)選的是，在步驟2之前還包括電極預(yù)處理，即分別用1.0，0.3和0.05 _的Al2O3粉末拋光打磨電極至鏡面，再用無水乙醇和雙蒸水超聲清洗后他吹干備用。
[0012]上述任一方案優(yōu)選的是，步驟I)中0.2 M PB采用0.2 M的K2HPO4溶液和0.2 M的KH2PO4溶液混合后調(diào)節(jié)pH至7.0得到。
[0013]上述任一方案優(yōu)選的是，步驟3)中0.5 mL的亞甲基藍(lán)溶液的配制方法為稱取0.0224 g MB固體樣品，用5 mM的PB溶液溶解，定容至100 1^，即得0.6 mM的亞甲基藍(lán)溶液。
[0014]上述任一方案優(yōu)選的是，所述5 mM I3B為5 mM的K2HPO4溶液和5 mM的KH2PO4溶液混合后調(diào)節(jié)pH至7.0獲得。
[0015]本發(fā)明還公布了一種上述的電化學(xué)傳感器或采用上述制備方法制備得到的電化學(xué)傳感器在檢測黃曲霉毒素BI中的應(yīng)用，包括以下步驟:
(1)AFBl溶液的制備:取Img AFBl固體，溶于I mL甲醇水混合溶液中，振蕩、混勻，得濃度為I mg mL—1的AFBl母液，使用0.2 M PB緩沖溶液按比例稀釋為不同濃度的AFBl標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(2)不同濃度AFBl對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):將dsDNA/GE浸入50yL的不同濃度的AFBl標(biāo)準(zhǔn)溶液中，溫育后，用0.2 M的I3B緩沖溶液充分淋洗，得到不同濃度AFBI損傷后的dsDNA/GE備用；
(3)AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:
將dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入檢測底液中，檢測得到未經(jīng)損傷的電流信號I;
再將經(jīng)步驟(2 )得到的由不同濃度AFBl損傷后的dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入檢測底液中，檢測得到損傷后的電流信號2;
以電流信號I與電流信號2的差值作為縱坐標(biāo)，AFBl濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制得到AFBI的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4)樣品的處理:取飼料樣品5g，加入100 mL甲醇水溶液中，攪拌后超聲萃取，快速抽濾、搖勻，濃縮至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后離心，取上清液，用0.2 M pH 7.0的PB緩沖溶液稀釋，即得到待測AFBl溶液；
(5)待測樣品中AFBl對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):取50yL由步驟(4)得到的待測AFBl溶液，將dsDNA/GE浸入該溶液中，方法同步驟(2)，得到待測樣品中AFBI損傷后的dsDNA/GE;
(6)樣品檢測:將由步驟(5)得到待測樣品中AFBl損傷后的dsDNA/GE按照步驟(3)的方法操作，得到電流ig號2。
[0016]本發(fā)明公開了一種電化學(xué)傳感器，包括三電極體系和檢測池，三電極體系包括工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極，所述工作電極為修飾的金電極;所述檢測池內(nèi)裝有電活性指示劑與緩沖液組成的檢測底液，利用DNA修飾電極對AFBl進(jìn)行電化學(xué)檢測，不需要昂貴的單克隆AFBl抗體，解決了一般色譜法、免疫學(xué)檢測方法操作復(fù)雜、成本昂貴、進(jìn)樣量高、耗時(shí)長等問題，實(shí)現(xiàn)了 AFBl的即時(shí)檢測，具有方便快捷、檢測的靈敏度高，檢測限低至10 ng/mL、需要樣品量少、檢測成本極低、干擾小等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明中的電化學(xué)傳感器的組裝及對AFBl的檢測示意圖；
圖2為采用本發(fā)明電化學(xué)傳感器檢測AFBl時(shí)其DPV響應(yīng)電流差值與濃度的對數(shù)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖中a為dsDNA-Au電極的掃描信號曲線，b、c分別為經(jīng)300 ng mL-lAFBI溶液損傷時(shí)、經(jīng)700 ng mL-lAFBl溶液損傷時(shí)的掃描信號曲線；
圖3為不同濃度的AFBl溶液損傷前后的DPV電流值差值的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下述實(shí)施例是對于本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說明以作為對本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容的闡釋，但本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容并不僅限于下述實(shí)施例所述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以且應(yīng)當(dāng)知曉任何基于本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神的簡單變化或替換均應(yīng)屬于本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍。
[0019]本發(fā)明提供一種快速、簡便、價(jià)廉的檢測黃曲霉毒素BI(AFBI)的新型電化學(xué)DNA生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對AFBl的快速檢測。DNA在裸金電極上自組裝得到DNA-Au電極，以60 μΜ亞甲基藍(lán)為電化學(xué)活性指示劑，pH 7.0,0.2 M磷酸鹽緩沖溶液配制的鐵氰化鉀溶液為緩沖底液，37 °C下含有AFBl樣品溶液對電極的損傷時(shí)間為22 min。該方法對AFBI的線性檢測范圍為10?500 ng/mL，加標(biāo)回收率在95.99 %?104.57 %?？梢詫?shí)現(xiàn)對AFBl快速、簡便、準(zhǔn)確的定量檢測。
[0020]實(shí)施例1
本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的組裝及對AFBl的檢測流程示意圖，如圖1所示;詳細(xì)實(shí)施方式如下:
(I)電極預(yù)處理:分別用1.0，0.3和0.05 pm的Al2O3粉末將金電極拋光打磨至鏡面，再用無水乙醇和雙蒸水超聲清洗后N2吹干備用。
[0021](2)緩沖液的制備:分別配制0.2 M和5 mM的K2HPO4溶液和0.2 M和5 mM的KH2PO4溶液，混合相同濃度的兩種溶液并調(diào)節(jié)pH至7.0，制備0.2 M的PB和5 mM的PB儲(chǔ)藏備用。
[0022](3)亞甲基藍(lán)(MB)溶液的制備:稱取0.0224 g MB固體樣品，用步驟(2)所配制的5mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的MB儲(chǔ)備溶液。
[0023](4)880嫩溶液的制備:肥-880嫩用步驟(2)所配制的0.2 M I3B配制成濃度為100 μ1的把-%0嫩溶液;其互補(bǔ)序列用步驟(2)所配制的0.2 M I3B緩沖溶液配制成濃度為4 μΜ的目標(biāo)DNA溶液。
[0024](5)修飾金電極的制備:將步驟(I)處理的金電極浸入50 yL步驟(4)配制的100 μΜ的HS-ssDNA溶液中，在4 °C自組裝過夜，接著用雙蒸水充分淋洗，除去電極表面多余的未組裝的ssDNA，即得到ssDNA修飾的金電極(ssDNA-Au)。再將ssDNA-Au電極浸入50 yL步驟(4)配制的4 μΜ目標(biāo)DNA溶液，37 °C溫育I h，隨后用0.2 M的I3B緩沖溶液充分淋洗以除去表面未雜交的目標(biāo)DNA，得到雜交后的dsDNA修飾的金電極(dsDNA/GE)。
[0025](6)樣品的處理:取豬飼料樣品5g (舒克貝塔牌清潔級豬料，購買于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)；加入100 mL甲醇水溶液(體積比1:1)，攪拌后超聲萃取10min，快速抽濾、搖勾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL，再用甲醇水溶液(體積比1:1)定容至10mL，最后經(jīng)10000 r min"1,4 °C離心15 min，取其上清液，置于4 °(:保存?zhèn)溆?。用步驟(2)配制的0.2 M pH 7.0的PB緩沖溶液稀釋，即可得到待測AFBl溶液。
[0026](7)檢測底液的制備:分別取4.5 mL的步驟(2)所得的0.2 M I3B緩沖液和0.5mL的步驟(3)所得電活性指示劑加入到檢測池中，混合均勻；
(8)未經(jīng)損傷的dsDNA/GE上電流信號I的測定:將得到的dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入步驟(7)所得的檢測底液中，采用示差脈沖伏安法進(jìn)行檢測，得到未經(jīng)損傷的電流信號I為7 μΑ。掃描的初始電位為O V，終止電位為-0.3 V，出峰位置為-0.17 V0
[0027](9)不同濃度AFBI對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):37 °C條件下，將由步驟(5)得到的dsDNA/GE浸入50 yL的由步驟(6)配制的待測樣品AFBl溶液中，溫育22 min后，取出用0.2 M的PB緩沖溶液充分淋洗，得到由待測樣品中AFBl損傷后的dsDNA/GE備用。
[0028](10)樣品檢測:將由步驟(9)得到的修飾電極按照步驟(8)操作，掃描的初始電位為O V，終止電位為-0.3 V，出峰位置為-0.17 V，得到電流信號2為16.8 μΑ。通過電流信號I和電流信號2的差值以及已經(jīng)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFBl含量為19.2 ng mL—1。
[0029]在MB溶液中考察組裝完成的dsDNA-Au電極未經(jīng)AFBl溶液損傷時(shí)、經(jīng)300 ng mL一1AFBl溶液損傷時(shí)、經(jīng)700 ng mL—1 AFBl溶液損傷時(shí)的示差脈沖伏安響應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。圖中a為dsDNA-Au電極的掃描信號曲線，b、c分別為經(jīng)300 ng mL—1 AFBl溶液損傷時(shí)、經(jīng)700 ngmL—1 AFBl溶液損傷時(shí)的掃描信號曲線。從圖2可以得出經(jīng)300 ng mL—1 AFBl溶液損傷后的DPV圖峰電流值明顯要比未經(jīng)損傷的峰電流值要小，經(jīng)700 ng mL—1 AFBl溶液損傷后的DPV圖峰電流值明顯要比經(jīng)300 ng mL—1 AFBl溶液損傷后的DPV圖峰電流值小。
[0030]圖3為不同濃度的AFBl溶液損傷前后的DPV電流值差值的線性關(guān)系圖，由圖3可見，在10?500 ng mL—1之間時(shí)，Δ iP值隨AFBl濃度的增大而增大，且Δ iP值與Ig(CAFBi)之間的關(guān)系滿足線性關(guān)系方程:Δ iP = (-0.11982 土 0.01476) + (0.24917 土 0.00693) Ig(Cafbi)，線性相關(guān)系數(shù)7? = 0.9970。線性檢測范圍為10?500 ng mL—1，最低檢測限為10ng mL—1O
[0031]實(shí)施例2
(I)電極預(yù)處理:分別用1.0，0.3和0.05 pm的Al2O3粉末拋光打磨至鏡面，再用無水乙醇和雙蒸水超聲清洗后他吹干備用。
[0032](2)緩沖液的制備:分別配制0.2 M和5 mM的K2HPO4溶液和0.2 M和5 mM的KH2PO4溶液，混合相同濃度的兩種溶液并調(diào)節(jié)pH至7.0，制備0.2 M的PB和5 mM的PB儲(chǔ)藏備用。
[0033](3)亞甲基藍(lán)(MB)溶液的制備:稱取0.0224 g MB固體樣品，用步驟(2)所配制的5mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的MB儲(chǔ)備溶液。
[0034](4)ssDNA溶液的制備:HS-ssDNA用步驟(2)所配制的0.2 M I3B配制成濃度為100 μM的HS-ssDNA溶液;其互補(bǔ)序列用步驟(2)所配制的0.2 M PB緩沖溶液配制成濃度分別為4μΜ的目標(biāo)DNA溶液。
[0035](5)修飾金電極的制備:將用步驟(I)處理的金電極浸入50 yL步驟(4)配制的100μΜ的HS-ssDNA溶液中，在4 °C自組裝過夜，接著用二次水淋洗充分淋洗，除去電極表面多余的未組裝的ssDNA，即得到ssDNA修飾的金電極(ssDNA/GE)。再將ssDNA-Au電極浸入50 yL步驟(4)配制的4 μΜ目標(biāo)DNA溶液，37 °C溫育I h，隨后用0.2 M的I3B緩沖溶液充分淋洗以除去表面未雜交的目標(biāo)DNA，得到雜交后的dsDNA修飾的金電極(dsDNA/GE)。
[0036](6)樣品的處理:取小鼠飼料樣品5 g (舒克貝塔牌SPF級大小鼠糧，購買于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)；加入100 mL甲醇水溶液(體積比1:1)，攪拌后超聲萃取10 min，快速抽濾、搖勾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后經(jīng)10000 r min"1,4 °C離心15 min，取其上清液，置于4 °(:保存?zhèn)溆谩Ｓ貌襟E(2)配制的0.2M pH 7.0的PB緩沖溶液稀釋，即可得到待測AFBl溶液。
[0037](7)檢測底液的制備:分別取4.5 mL的步驟(2)所得的0.2 M I3B緩沖液和0.5 mL的步驟(3)所得電活性指示劑加入到檢測池中，混合均勻；
(8)未經(jīng)損傷的dsDNA/GE上電流信號I的測定:將得到的dsDNA/GE將作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入步驟(7)所得的檢測底液中，采用示差脈沖伏安法進(jìn)行檢測，得到未經(jīng)損傷的電流信號I為7.2 μΑ。掃描的初始電位為OV，終止電位為-0.3 V，出峰位置為-0.17 V0
[0038](9)不同濃度AFBI對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):37 °C條件下，將由步驟(5)得到的dsDNA/GE浸入50 yL的由步驟(6)配制的待測樣品AFBl溶液中，溫育22 min后，取出用0.2 M的PB緩沖溶液充分淋洗，得到由待測樣品中AFBl損傷后的dsDNA/GE備用。
[0039](10)樣品檢測:將由步驟(9)得到的修飾電極按照步驟(8)操作，掃描的初始電位為O V，終止電位為-0.3 V，出峰位置為-0.17 V，得到電流信號2為6.85 μΑ。通過電流信號I和電流信號2的差值以及已經(jīng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFBl含量為76.8 ng mL—1。
[0040]實(shí)施例3
(I)電極預(yù)處理:分別用1.0，0.3和0.05 pm的Al2O3粉末拋光打磨至鏡面，再用無水乙醇和雙蒸水超聲清洗后他吹干備用。
[0041 ] (2)緩沖液的制備:分別配制0.2 M和5 mM的K2HPO4溶液和0.2 M和5 mM的KH2PO4溶液，混合相同濃度的兩種溶液并調(diào)節(jié)pH至7.0，制備0.2 M的PB和5 mM的PB儲(chǔ)藏備用。
[0042](3)亞甲基藍(lán)(MB)溶液的制備:稱取0.0224 g MB固體樣品，用步驟(2)所配制的5mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的MB儲(chǔ)備溶液。
[0043](4)ssDNA溶液的制備:HS-ssDNA用步驟(2)所配制的0.2 M I3B配制成濃度為100 μM的HS-ssDNA溶液;其互補(bǔ)序列用步驟(2)所配制的0.2 M PB緩沖溶液配制成濃度分別為4μΜ的目標(biāo)DNA溶液。
[0044](5)修飾金電極的制備:將用步驟(I)處理的金電極浸入50 yL步驟(4)配制的100μΜ的HS-ssDNA溶液中，在4 °C自組裝過夜，接著用雙蒸水充分淋洗，除去電極表面多余的未組裝的ssDNA，即得到ssDNA修飾的金電極(ssDNA/GE)。再將ssDNA-Au電極浸入50 yL步驟
(4)配制的4 μΜ目標(biāo)DNA溶液，37 °C溫育I h，隨后用0.2 M的PB緩沖溶液充分淋洗以除去表面未雜交的目標(biāo)DNA，得到雜交后的dsDNA修飾的金電極(dsDNA/GE)。
[0045](6)樣品的處理:取雞飼料樣品5 g (舒克貝塔牌清潔級雞飼料，購買于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)；加入100 mL甲醇水溶液(體積比1:1)，攪拌后超聲萃取10min，快速抽濾、搖勻，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后經(jīng)10000 r min"1,4 °C離心15 min，取其上清液，置于4 °(:保存?zhèn)溆?。用步驟(2)配制的0.2 MpH 7.0的PB緩沖溶液稀釋，即可得到待測AFBl溶液。
[0046](7)檢測底液的制備:分別取4.5 mL的步驟(2)所得的0.2 M I3B緩沖液和0.5 mL的步驟(3)所得電活性指示劑加入到檢測池中，混合均勻；
(8)未經(jīng)損傷的dsDNA/GE上電流信號I的測定:將得到的dsDNA/GE將作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入步驟(7)所得的檢測底液中，采用示差脈沖伏安法進(jìn)行檢測，得到未經(jīng)損傷的電流信號I為6.9 μΑ。掃描的初始電位為O V，終止電位為-0.3 V，出峰位置為-0.17 V0
[0047](9)不同濃度AFBI對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):37 °C條件下，將由步驟(5)得到的dsDNA/GE浸入50 yL的由步驟(6)配制的待測樣品AFBl溶液中，溫育22 min后，取出用0.2 M的PB緩沖溶液充分淋洗，得到由待測樣品中AFBl損傷后的dsDNA/GE備用。
[0048](10)樣品檢測:將由步驟(9)得到的修飾電極按照步驟(8)操作，掃描的初始電位為0V，終止電位為-0.3 V，出峰位置為-0.17 V，得到電流信號2為6.4 μΑ。通過電流信號I和電流信號2的差值以及已經(jīng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFBl含量為307.25 ng mL—1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種電化學(xué)傳感器，其特征在于，包括三電極體系和檢測池，所述三電極體系包括工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極，所述工作電極為修飾的金電極;所述檢測池內(nèi)裝有電活性指示劑與緩沖液組成的檢測底液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述電活性指示劑與緩沖液的體積比為1:9。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述電活性指示劑為亞甲基藍(lán)溶液，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述電活性指示劑為60μΜ的亞甲基藍(lán)溶液，所述的緩沖液為0.2 Μ、ρΗ 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。5.—種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用0.2M PB將HS-ssDNA配制成濃度為100 μΜ的HS-ssDNA溶液，用0.2 M PB緩沖溶液將HS-ssDNA的互補(bǔ)序列配制成4 μΜ的目標(biāo)DNA溶液； (2)修飾金電極的制備: 將修飾過的金電極浸入50 yL步驟(I)配制的100 μΜ的HS-ssDNA溶液中，在4 °C自組裝過夜，用二次水充分淋洗，即得到ssDNA修飾的金電極ssDNA/GE; 再將ssDNA-Au電極浸入50 yL步驟(I)配制的4 μΜ目標(biāo)DNA溶液，37 °(:溫育，用0.2 M的PB緩沖溶液充分淋洗，得到雜交后的dsDNA修飾的金電極dsDNA/GE; (3)檢測底液的制備:分別取4.5mL的0.2 M PB緩沖溶液和0.5mL 60 μΜ的亞甲基藍(lán)溶液加入到檢測池中，混合均勻即得到檢測底液； (4)將步驟(2)得到的dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成三電極體系插入步驟(3)制備的檢測底液中，即為電化學(xué)傳感器。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，在步驟2之前還包括電極預(yù)處理，即分別用1.0，0.3和0.05 pm的Al2O3粉末拋光打磨電極至鏡面，再用無水乙醇和雙蒸水超聲清洗后N2吹干備用。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟I)中0.2 MPB采用0.2 M的K2HPO4溶液和0.2 M的KH2PO4溶液混合后調(diào)節(jié)pH至7.0得到。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，步驟3)中0.5mL的亞甲基藍(lán)溶液的配制方法為稱取0.0224 g MB固體樣品，用5 mM的I3B溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的亞甲基藍(lán)溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，所述5mM PB為5 mM的K2HPO4溶液和5 mM的KH2PO4溶液混合后調(diào)節(jié)pH至7.0獲得。10.—種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器或者由權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的電化學(xué)傳感器在快速檢測黃曲霉毒素BI中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: (I )AFBI溶液的制備:取I mg AFBI固體，溶于I mL甲醇水混合溶液中，振蕩、混勻，得濃度為I mg mL—1的AFBl母液，使用0.2 M PB緩沖溶液按比例稀釋為不同濃度的AFBl標(biāo)準(zhǔn)溶液； (2)不同濃度AFBl對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):將dsDNA/GE浸入50 yL的不同濃度的AFBl標(biāo)準(zhǔn)溶液中，溫育后，用0.2 M的I3B緩沖溶液充分淋洗，得到不同濃度AFBI損傷后的dsDNA/GE備用； (3)AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入檢測底液中，檢測得到未經(jīng)損傷的電流信號I; 再將經(jīng)步驟(2 )得到的由不同濃度AFBI損傷后的dsDNA/GE作為工作電極、Ag/AgC I參比電極和鉑絲對電極構(gòu)成的三電極體系插入檢測底液中，檢測得到損傷后的電流信號2; 以電流信號I與電流信號2的差值作為縱坐標(biāo)，AFBl濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制得到AFBI的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)樣品的處理:取飼料樣品5g，加入100 mL甲醇水溶液中，攪拌后超聲萃取，快速抽濾、搖勻，濃縮至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后離心，取上清液，用0.2 M pH 7.0的PB緩沖溶液稀釋，即得到待測AFBl溶液； (5)待測樣品中AFBl對dsDNA的損傷實(shí)驗(yàn):取50yL由步驟(4)得到的待測AFBl溶液，將dsDNA/GE浸入該溶液中，方法同步驟(2)，得到待測樣品中AFBI損傷后的dsDNA/GE; (6)樣品檢測:將由步驟(5)得到待測樣品中AFBl損傷后的dsDNA/GE按照步驟(3)的方法操作，得到電流信號2。
【文檔編號】G01N27/48GK106093173SQ201610425212
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】葉永康, 操小棟, 高嬌娜, 方俊杰, 孫漢臣, 魏兆軍
【申請人】合肥工業(yè)大學(xué)