專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種珍珠粉的高效液相指紋圖譜鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種珍珠粉的高效液相指紋圖譜鑒定方法。(二)
背景技術(shù)：
：珍珠粉及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評(píng)價(jià)其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒別信息的檢測(cè)方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測(cè)定等方法都不足以解決這一問(wèn)題，建立珍珠粉指紋圖譜將能較為全面地反映珍珠粉及其制劑中所含化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，如果能進(jìn)一步開(kāi)展譜效學(xué)研究，可使珍珠粉質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來(lái)，有助于闡明珍珠粉作用機(jī)理。總之，研究和建立珍珠粉的指紋圖譜，為珍珠粉的鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描(TLCS)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)等色譜法以及紫外光譜法(UV)、紅外光譜法(IR)、質(zhì)譜法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認(rèn)的三種常規(guī)分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)；中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，且積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，因此本發(fā)明首選高效液相色譜法作為珍珠粉指紋圖譜的分析手段。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種珍珠粉的高效液相指紋圖譜鑒定方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種珍珠粉的高效液相指紋圖譜鑒定方法，所述方法包括(1)珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立①珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱(chēng)取純珍珠粉250750mg，于1020ml耐溫耐壓瓶中，準(zhǔn)確加入6M的鹽酸110ml，加蓋密封，置于80°C120。C下，水解1236小時(shí)；取出，放冷，開(kāi)瓶，將水解液移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)运芙猓迫?0ml量瓶中，定容，搖勻，微孔濾膜精濾，取濾液100ul至2ml小瓶中，依次準(zhǔn)確加入體積濃度14%的三乙胺乙腈溶液、體積濃度1.25%的異硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液10ul，加蓋，混勻，置于28°C±0.5°C下衍生90分鐘，取出，加正己烷400ul，振搖，靜置10min，取下層溶液，即得珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液；②參照物正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取正亮氨酸適量，加0.lmol/L鹽酸溶液使溶解，制成濃度為lmg/ml的內(nèi)標(biāo)液；③色譜條件采用Ve皿sil-AA分析柱(4.6mmX250mm，5iim)，以用醋酸調(diào)節(jié)至pH=6.50的0.1M的醋酸鈉水溶液為流動(dòng)相A(該流動(dòng)相溫度與室溫平衡時(shí)，應(yīng)保持26°C±2°C)，以乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;柱溫45。C;體積流量為lml/min;理論板數(shù)按正亮氨酸峰計(jì)算應(yīng)不得低于1.1X105。測(cè)定精密吸取珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液及正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，制定珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜所述珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有9個(gè)特征峰，各特征峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間、各峰相對(duì)峰面積的均值和區(qū)間如下1#峰0.25，0.29，0.260.32;2#峰:0.28，0.10，0.090.12;3#峰:0.42，0.32，0.280.35;4#峰:0.44，0.99，0.901.1;5#峰0.52，0.13，0.120.14;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.22，0.210.24;8#峰:1.ll，O.14，0.130.15;9#峰:1.21，0.18，0.170.20;相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)的個(gè)峰的出峰保留時(shí)間與內(nèi)標(biāo)物正亮氨酸出峰保留時(shí)間的比值。相對(duì)峰面積標(biāo)的個(gè)峰的面積與Ala丙氨酸(圖示6#峰，相對(duì)保留時(shí)間0.59)峰面積的比值。(2)按照步驟(1)相同方法測(cè)定待測(cè)珍珠粉指紋圖譜；(3)將待測(cè)珍珠粉指紋圖譜與珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，按照下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定①峰貌判定19#特征峰缺失數(shù)量不得多于1個(gè)，且19#特征峰的峰大小關(guān)系應(yīng)符合4#峰或6#峰>1#峰或3#峰>7#峰或9#峰>8#峰或5#峰或2#峰，不滿足上述條件為非珍珠粉；②相對(duì)峰面積指紋特征判定當(dāng)樣品有個(gè)峰的相對(duì)峰面積超出上下限10%為非珍珠粉；③以均值為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，通過(guò)Excel軟件函數(shù)C0RREL計(jì)算樣品組與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的相關(guān)系數(shù)；相關(guān)系數(shù)不小于0.996為珍珠粉，小于0.996為非珍珠粉。所述步驟(1)第③步中梯度洗脫步驟各時(shí)間段流動(dòng)相A和流動(dòng)相B體積含量變化如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在采用本發(fā)明方法對(duì)珍珠粉進(jìn)行分析鑒定，速度快、靈敏度高，為珍珠粉的鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。(四)圖1為珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立(1)珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱(chēng)取純珍珠粉500mg，于15ml耐溫耐壓瓶中，準(zhǔn)確加入6M的鹽酸5ml，加蓋密封，置于ll(TC下，水解24小時(shí)；取出，放冷，開(kāi)瓶，將水解液移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)运芙猓迫?0ml量瓶中，定容，搖勻，用孔徑為0.45微米的微孔濾膜精濾，取濾液100ul至2ml小瓶中，依次準(zhǔn)確加入體積濃度14%的三乙胺乙腈溶液(乙腈為溶劑)、體積濃度1.25%的異硫氰酸苯酯乙腈溶液(乙腈為溶劑)各50ul，再加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液10ul，加蓋，混勻，置于28°C±0.5t:下衍生90分鐘，取出，加正己烷400ul，振搖，靜置10min，取下層溶液，即得珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(2)參照物正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取正亮氨酸適量，加0.lmol/L鹽酸溶液使溶解，制成濃度為lmg/ml的內(nèi)標(biāo)液；(3)色譜條件采用Ve皿sil-AA分析柱(4.6mmX250mm，5ym)，以用醋酸調(diào)節(jié)至pH=6.50的0.1M的醋酸鈉水溶液為流動(dòng)相A(該流動(dòng)相溫度與室溫平衡時(shí)，應(yīng)保持26°C±2°C)，以乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;柱溫45。C;體積流量為lml/min;理論板數(shù)按正亮氨酸峰計(jì)算應(yīng)不得低于1.1X105:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(4)測(cè)定精密吸取珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液及正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液2L，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，制定珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜所述珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(見(jiàn)圖1)中，共有9個(gè)特征峰，各特征峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間、各峰相對(duì)峰面積的均值和區(qū)間如下1#峰0.25，0.29，0.260.32;2#峰0.28，0.10，0.090.12;3#峰0.42，0.32，0.280.35;4#峰0.44，0.99，0.901.1;5#峰:0.52，0.13，0.120.14;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.22，0.210.24;8#峰1.11，0.14，0.130.15;9#峰:1.21，0.18，0.170.20。實(shí)施例2:參照實(shí)施例1方法，精密稱(chēng)取浙江山下湖珍珠集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的千足牌珍珠粉500mg，于15ml耐溫耐壓瓶中，準(zhǔn)確加入6M的鹽酸5ml，加蓋密封，置于ll(TC下，水解24小時(shí)；取出，放冷，開(kāi)瓶，將水解液移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)运芙?，移?0ml量瓶中，定容，搖勻，微孔濾膜精濾，取濾液lOOul至2ml小瓶中，依次準(zhǔn)確加入體積濃度14%的三乙胺乙腈溶液、體積濃度1.25%的異硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液10ul，加蓋，混勻，置于28°C±0.5t:下衍生90分鐘，取出，加正己烷400ul，振搖，靜置10min，取下層溶液，即得千足牌珍珠粉試品溶液。精密吸取試品溶液2ul，注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析。各峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的均值如下1#峰0.25，0.2954;2#峰0.28，0.1060;3#峰0.42，0.3357;4#峰0.44，0.9898;5#峰0.52，0.1316;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.2269;8#峰1.ll，O.1440;9#峰1.21，0.1894。通過(guò)與珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，千足牌珍珠粉19#特征峰無(wú)缺失，且19#特征峰的峰大小關(guān)系符合4#峰或6#峰>1#峰或3#峰>7#峰或9#峰>8#峰或5#峰或2#峰，無(wú)個(gè)峰的相對(duì)峰面積超出其上下限10%，另外通過(guò)Excel軟件函數(shù)CORREL計(jì)算樣品組與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的相關(guān)系數(shù)為0.9999，綜上證明千足牌珍珠粉為純珍珠粉。實(shí)施例3:參照實(shí)施例1方法，精密稱(chēng)取市售蚌殼粉500mg，于15ml耐溫耐壓瓶中，準(zhǔn)確加入6M的鹽酸5ml，加蓋密封，置于11(TC下，水解24小時(shí)；取出，放冷，開(kāi)瓶，將水解液移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)运芙?，移?0ml量瓶中，定容，搖勻，用孔徑為0.45微米的微孔濾膜精濾，取濾液100ul至2ml小瓶中，依次準(zhǔn)確加入體積濃度14%的三乙胺乙腈溶液、體積濃度1.25%的異硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液10ul，加蓋，混勻，置于28°C±0.5t:下衍生90分鐘，取出，加正己烷400ul，振搖，靜置10min，取下層溶液，即得蚌殼粉試品溶液。精密吸取試品溶液2ul，注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析。各峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的均值如下1#峰0.25，0.2142;2#峰0.28，0.0762;3#峰0.42，0.2152;4#峰0.44，0.8843;5#峰0.52，0.1064;6#峰0.59，1，1;7#峰0.94，0.2019;8#峰1.ll，O.1285;9#峰1.21，0.1306。通過(guò)與珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該蚌殼粉19#特征峰無(wú)缺失，且19#特征峰的峰大小關(guān)系符合4#峰或6#峰>1#峰或3#峰>7#峰或9#峰>8#峰或5#峰或2#峰，但1#、2#、3#、5#、9#的相對(duì)峰面積超出上下限10%，另外通過(guò)Excel軟件函數(shù)CORREL計(jì)算樣品組與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的相關(guān)系數(shù)為0.9949，綜上驗(yàn)證了蚌殼粉非珍珠粉。權(quán)利要求一種珍珠粉的高效液相指紋圖譜鑒定方法，所述方法包括(1)珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立①珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱(chēng)取純珍珠粉250～750mg，于10～20ml耐溫耐壓瓶中，準(zhǔn)確加入6M的鹽酸1～10ml，加蓋密封，置于80℃～120℃下，水解12～36小時(shí)；取出，放冷，開(kāi)瓶，將水解液移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)运芙?，移?0ml量瓶中，定容，搖勻，微孔濾膜精濾，取濾液100ul至2ml小瓶中，依次準(zhǔn)確加入體積濃度14％的三乙胺乙腈溶液、體積濃度1.25％的異硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液10ul，加蓋，混勻，置于28℃±0.5℃下衍生90分鐘，取出，加正己烷400ul，振搖，靜置10min，取下層溶液，即得珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液；②參照物正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取正亮氨酸適量，加0.1mol/L鹽酸溶液使溶解，制成濃度為1mg/ml的內(nèi)標(biāo)液；③色譜條件采用Venusil-AA分析柱，以用醋酸調(diào)節(jié)至pH＝6.50的0.1M的醋酸鈉水溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫45℃；體積流量為1ml/min；④測(cè)定精密吸取珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液及正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，制定珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜所述珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，共有9個(gè)特征峰，各特征峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間、各峰相對(duì)峰面積的均值和區(qū)間如下1#峰0.25，0.29，0.26～0.32；2#峰0.28，0.10，0.09～0.12；3#峰0.42，0.32，0.28～0.35；4#峰0.44，0.99，0.90～1.1；5#峰0.52，0.13，0.12～0.14；6#峰0.59，1，1；7#峰0.94，0.22，0.21～0.24；8#峰1.11，0.14，0.13～0.15；9#峰1.21，0.18，0.17～0.20；(2)按照步驟(1)相同方法測(cè)定待測(cè)珍珠粉指紋圖譜；(3)將待測(cè)珍珠粉指紋圖譜與珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，按照下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定①峰貌判定1～9#特征峰缺失數(shù)量不得多于1個(gè)，且1～9#特征峰的峰大小關(guān)系應(yīng)符合4#峰或6#峰＞1#峰或3#峰＞7#峰或9#峰＞8#峰或5#峰或2#峰，不滿足上述條件為非珍珠粉；②相對(duì)峰面積指紋特征判定當(dāng)樣品有個(gè)峰的相對(duì)峰面積超出上下限10％為非珍珠粉；③以均值為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，通過(guò)Excel軟件函數(shù)CORREL計(jì)算樣品組與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的相關(guān)系數(shù)；相關(guān)系數(shù)不小于0.996為珍珠粉，小于0.996為非珍珠粉。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)第③步中梯度洗脫步驟各時(shí)間段流動(dòng)相A和流動(dòng)相B體積含量變化如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>全文摘要本發(fā)明提供了一種珍珠粉的高效液相指紋圖譜鑒定方法，所述方法包括珍珠粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立、待測(cè)珍珠粉指紋圖譜的測(cè)定和結(jié)果判定等步驟；采用本發(fā)明方法對(duì)珍珠粉進(jìn)行分析鑒定，速度快、靈敏度高，為珍珠粉的鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。文檔編號(hào)G01N30/36GK101696960SQ20091015441公開(kāi)日2010年4月21日申請(qǐng)日期2009年10月23日優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日發(fā)明者馮旭俊,李小龍,謝乾程申請(qǐng)人:浙江英格萊制藥有限公司;