專利名稱：定量檢測肌氨酸含量的方法及反應(yīng)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測肌氨酸含量的方法及反應(yīng)試劑盒，尤其涉及一種 酶催化熒光法定量檢測肌氨酸含量的方法，以及用于該肌氨酸含量檢測方法的 反應(yīng)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前，測定肌氨酸的含量一般采用液-氣色譜并聯(lián)用質(zhì)譜來進行測定，這種 方法使用的儀器昂貴，且操作復(fù)雜，不便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。另外， 一種臨床 實驗室酶法測定血和尿中肌肝的分光光度法，是利用肌酐在肌酐氨基水解酶、 肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶等酶和水、氧及顯色劑的共同作 用下生成色原物質(zhì)，在特定波長下測定色原物質(zhì)的吸光度，其吸光度值的大小 和樣品中肌酐的含量成正比的原理而設(shè)計的，該方法經(jīng)重新組合后也可以用于 測定肌氨酸含量。但是分光光度法的檢測限比較高，不適用于進行較低濃度肌 氨酸含量的測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例的目的在于提供一種定量檢測肌氨酸含量的方法，旨在解決 現(xiàn)有檢測方法不適用于進行較低濃度肌氨酸含量測定的問題。
本發(fā)明實施例的另 一 目的在于提供一種用于上述^r測肌氨酸含量方法的反
應(yīng)試劑盒。
本發(fā)明實施例的定量檢測肌氨酸含量的方法，包括如下步驟 Sl配制不同濃度的肌氨酸溶液，向溶液中加入名威性緩沖液、肌氨酸氧化酶 催化劑，對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸，以及過氧化物酶催化劑，所述堿性緩沖液將溶液的pH值控制為8 11，所發(fā)生的如下化學(xué)反應(yīng)(1)和(2)中肌氨酸、 過氧化氫反應(yīng)完全
(1)肌氨酸+氧+水肌氨酸氣化酶過氣化氫+曱醛+甘氨酸: (2 )過氧化氫+對曱基酚過氧化物酶熒光二聚體;或 過氣化氫+對羥基苯乙酸過氣化物酶熒光二聚體； S2分別測定Sl中反應(yīng)產(chǎn)物熒光二聚體在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光發(fā)射 譜，用熒光發(fā)射峰強度數(shù)值與肌氨酸的濃度繪制肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲 線；
S3采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸樣品發(fā)生如Sl中所述的反應(yīng)， 測量反應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射譜得到熒光強度數(shù)據(jù)，對比肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系 曲線得出未知肌氨酸樣品含量。
本發(fā)明實施例的用于上述定量檢測肌氨酸含量方法的反應(yīng)試劑盒包含濃度 如下的各組分
對甲基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 1 x 10—7 1 x io-3 mol/L
肌氨酸氧化酶 10~20000units/L
過氧化物酶 20-60000 units/L
石咸性緩沖液 0.05-0.5 mol/L。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案由于采用熒光分析法進行定量檢測肌氨酸 含量， 一般而言，熒光分析法靈敏度可超過分光光度法二至三個數(shù)量級，采用 本發(fā)明方法，不僅靈敏度高、檢測限低、重復(fù)性好，而且方法快速、簡便，干 擾少，非常適合于復(fù)雜樣品(如尿樣或血樣)中微量肌氨酸的大批量分析檢測。 本發(fā)明能檢測極低濃度的肌氨酸含量，例如濃度為0,1 x l(T9 1 x 10_4 mol/L的 肌氨酸溶液，可以方便快速、靈敏、低成本的測定尿樣或血樣中肌氨酸含量。


圖1是本發(fā)明實施例1中熒光二聚體的熒光激發(fā)譜；圖2是本發(fā)明實施例1提供的不同濃度肌氨酸溶液的熒光發(fā)射譜； 圖3是本發(fā)明實施例1提供的熒光峰強度-肌氨酸濃度關(guān)系曲線； 圖4是本發(fā)明實施例1提供的未知肌氨酸樣品的熒光發(fā)射i普。
具體實施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例， 對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以 解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種與現(xiàn)有檢測方法相比，能檢測濃度為0.1 x io-9 1 x io-4 mol/L (尿樣或血樣中可能存在的肌氨酸含量范圍)這種低濃度的肌氨酸溶液中 肌氨酸含量的定量檢測方法，當(dāng)然，該方法也能用于檢測更高含量的肌氨酸溶 液。
該定量檢測肌氨酸含量的方法，包括如下步驟
Sl配制不同濃度的肌氨酸溶液，向溶液中加入堿性緩沖液、肌氨酸氧化酶 催化劑，對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸，以及過氧化物酶催化劑，所述堿性緩沖液 將溶液的pH值控制為8 11,所發(fā)生的如下化學(xué)反應(yīng)(1)和(2)中肌氨酸、 過氧化氬反應(yīng)完全
(1) 肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+曱醛+甘氨酸;
(2) 過氣化氫+對曱基酚過氧化物酶熒光二聚體;或 過氯化氫+對羥基苯乙酸過氣化物酶熒光二聚體；
S2分別測定Sl中反應(yīng)產(chǎn)物熒光二聚體在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光發(fā)射 譜，用熒光發(fā)射峰強度數(shù)值與肌氨酸的濃度繪制肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲 線；
S3釆用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸樣品發(fā)生如S1中所述的反應(yīng)， 測量反應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射譜得到熒光強度數(shù)據(jù)，對比肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系 曲線得出未知肌氨酸樣品含量。更具體的，其中，Sl和S3中下列反應(yīng)試劑濃度分別為
對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 1 x i(T7~l x 10-3 mol/L
月幾氨酸氧4匕酶 10 20000units/L
過氧化物酶 20 60000 units/L
堿性緩沖液 0.05-0.5 mol/L。 其中，SI和S3中下列反應(yīng)試劑濃度優(yōu)選為
對曱基酚或?qū)谆揭宜崛芤?5 x 1 (T6~2x 1 (T4mol/L
肌氨酸氧化酶 3000~15000 units/L 過氧化物酶 堿性緩沖液 更優(yōu)選為
對甲基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 氨酸氧化酶 過氧化物酶 堿性緩沖液
10000 50000units/L。 0.1-0.25 mol/L
5xlO-5 lxlO-4 mol/L 5000 10000 units/L 20000 30000 units/L ( 0.15-0.2 mol/L
更具體的，本實施例的^:測方法中，S2中激發(fā)光波長為300~360 nm。優(yōu) 選激發(fā)光波長為320 nm (其激發(fā)光光譜參見圖1中曲線)。
更具體的，本實施例的斥企測方法中，緩沖溶液的pH值范圍為8~11，緩沖 液可以是麗3- NH4Cl緩沖溶液、Tris緩沖溶液、硼酸緩沖溶液或磷酸鹽緩沖 溶液等，但不僅限于這些緩沖液。
本發(fā)明實施例還提供一種用于上述反應(yīng)檢測方法的反應(yīng)試劑盒，包含濃度 如下的各組分
對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液
肌氨酸氧化酶
過氧化物酶
堿性緩沖液
1 x io-7 l x lo-3 mol/L 10~20000 units/L 20~60000 units/L 0.05-0.5 mol/L。上述各組分濃度優(yōu)選為:
對甲基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 肌氨酸氧化酶
3000—15000 units/L
5x 10—b~2x 1(Tmol/L
過氧化物酶
10000~50000units/L
堿性緩沖液
0.1-0.25 mol/L
更優(yōu)選為:
對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液
x 10-) 1 x 1(Tmol/L
氨酸氧化酶
5000 圃00 units/L
過氧化物酶
20000~30000 units/L
i成性緩沖液
0.15-0.2 mol/L
其中，緩沖液可以是麗3- NH4C1緩沖溶液、Tris緩沖溶液、硼酸緩沖溶 液或磷酸鹽緩沖溶液等，但不僅限于這些緩沖液。
1、 a.配制0.5 ml濃度為1.0xl0《mol/L的肌氨酸溶液，溫度控制為30 °C, 加入用pH = 10.4的NH3- NH4C1緩沖溶液(0.2 mol/L )配制的4.49 ml 3.0xl0-5 mol/L對甲基酚溶液，0.005 ml肌氨酸氧化酶溶液(10000 units/L )和0.005 ml過 氧化物酶溶液(20000 units/L )，混合均勻(最終反應(yīng)混合液中肌氨酸實際濃度為 O.lxlO-6 mol/L),反應(yīng)20分鐘后，用熒光分光光度計測量體系的熒光發(fā)射譜 (最佳激發(fā)波長Xex320nm,發(fā)射譜掃描范圍350-550 nm)。其熒光發(fā)射譜參 見圖2中Cl。
b. 配制0.5ml濃度為l.Oxl(T5mol/L的肌氨酸溶液，其余條件同a。最終反 應(yīng)混合液中肌氨酸實際濃度為l.OxlO-6mol/L,其熒光發(fā)射譜參見圖2中C2。
c. 配制0.5 ml濃度為3.0xl(T5mol/L的肌氨酸溶液，其余條件同a。最終反 應(yīng)混合液中肌氨酸實際濃度為3.0xl(T6 mol/L,其熒光發(fā)射譜參見圖2中C3。
d. 配制0.5ml濃度為5.0xl(T5mol/L的肌氨酸溶液，其余條件同a。最終反
實施例1應(yīng)混合液中肌氨酸實際濃度為5.0xl0-6mol/L，其焚光發(fā)射譜參見圖2中C4。
e. 配制0.5 ml濃度為7.0xl(T5mol/L的肌氨酸溶液，其余條件同a。最終反 應(yīng)混合液中肌氨酸實際濃度為7.0xlO-6mol/L,其熒光發(fā)射譜參見圖2中C5。
f. 配制0.5ml濃度為10.0xlO-Smol/L的肌氨酸溶液，其余條件同a。最終 反應(yīng)混合液中肌氨酸實際濃度為10.0xl(T6mol/L,其熒光發(fā)射講見圖2中C6。
2、 繪制該反應(yīng)條件下的熒光峰強度-肌氨酸濃度關(guān)系曲線，參見圖3。
3、 取0.5ml待測肌氨酸樣品溶液(取自尿樣)，溫度控制為30。C，加入 用pH = 10.4的NH3- NH4C1纟爰沖溶液(0,2 mol/L )配制的4.49 ml 3.0xl0-5 mol/L 對甲基酚溶液，0.005 ml月幾氨酸氧化酶溶液(10000 units/L )和0.005 ml過氧化物 酶溶液(20000 units/L )，混合反應(yīng)20分鐘后，用熒光分光光度計測量體系的熒 光發(fā)射譜(最佳激發(fā)波長Xex 320 nm，發(fā)射譜掃描范圍350-550 nm),得到該 未知樣品的焚光發(fā)射譜，參見圖4。取其熒光峰強度值并與圖3對照，可知該 樣品中肌氨酸含量為4.01xl(^mol/L。由于本測試方法對原始溶液稀釋了 IO倍， 故待測肌氨酸樣品原始濃度為所測得濃度的IO倍，即4.01xlO—5mol/L。
實施例2
所用溶液pH值為9，把工作試劑按下列濃度要求混合(對曱基酚，lxlO-7 mol/L;肌氨酸氧化酶，10 units/L;過氧化物酶，20 units/L;取自尿樣的肌氨 酸，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光譜儀測定其熒光 激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃度為 0.1xlO—9mol/L。
實施例3
所用溶液pH值為10.4,把工作試劑按下列濃度要求混合(對曱基酚，lxlO-5 mol/L;肌氨酸氧化酶，10 units/L;過氧化物酶，20 units/L;取自尿樣的肌氨 酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光譜儀測定其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃度為
5.43xlO'7mol/L。 實施例4
所用溶液pH值為10.8，把工作試劑按下列濃度要求混合(對曱基酚，5xl(T5 mol/L;肌氨酸氧化酶，10 units/L;過氧化物酶，20 units/L;取自血樣的肌氨 酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光語儀測定其熒光 激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃度為 4.04x10-6mol/L。
實施例5
所用溶液pH值為9，把工作試劑按下列濃度要求混合(對曱基酚，lxl(T3 mol/L;肌氨酸氧化酶，20000 units/L;過氧化物酶，60000 units/L;取自血樣 的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光譜儀測定 其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃 度為7.14xlO—5mol/L。
實施例6
所用溶液pH值為10.4，把工作試劑按下列濃度要求混合(對曱基酚，lxlO-3 mol/L;肌氨酸氧化酶，20000 units/L;過氧化物酶，60000 units/L;取自血樣 的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光譜儀測定 其焚光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃 度為3.05xlO-6mol/L。
實施例7
所用溶液pH值為11,把工作試劑按下列濃度要求混合(對甲基酚，lxl(T3 mol/L;肌氨酸氧化酶，20000 units/L;過氧化物酶，60000 units/L;取自血樣的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光語儀測定 其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃 度為2.06x10-8mol/L。
實施例8
所用溶液pH值為8，把工作試劑按下列濃度要求混合(對羥基苯乙酸溶液， lxl(T5mol/L;月幾氨酸氧化酶，10units/L;過氧化物酶，20 units/L;取自尿樣的 肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用焚光光譜儀測定其 熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨酸濃度 為4.04x10-6mol/L。
實施例9
所用溶液pH值為10.4，把工作試劑按下列濃度要求混合(對羥基苯乙酸 溶液，lxl(T3mol/L; l幾氨酸氧化酶，10units/L;過氧化物酶，20 units/L;取自 血樣的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光譜儀 測定其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨 酸濃度為1.04xl(T5mol/L。
實施例10
所用溶液pH值為10.8,把工作試劑按下列濃度要求混合(對羥基苯乙酸 溶液，lxl(T4mol/L;肌氨酸氧化酶，10units/L;過氧化物酶，20 units/L;取自 尿樣的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光譜4義 測定其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌氨 酸濃度為8.54xl(T6mol/L。
實施例11
所用溶液pH值為9，把工作試劑按下列濃度要求混合(對羥基苯乙酸溶液，1x10-5 mol/L;肌氨酸氧化酶，20000 units/L;過氧化物酶，60000 units/L;取 自血樣的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用焚光光鐠 儀測定其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出肌 氨酸濃度為9.36xl(T8 mol/L。
實施例12
所用溶液pH值為10.4，把工作試劑按下列濃度要求混合(對羥基苯乙酸 溶液，lxl(T3 mol/L;肌氨酸氧化酶，20000 units/L;過氧化物酶，60000 units/L; 取自血樣的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光 譜儀測定其焚光激發(fā)i普，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出 月幾氨酸濃度為8.09xl(T6 mol/L。
實施例13
所用溶液pH值為10.8,把工作試劑按下列濃度要求混合(對羥基苯乙酸 溶液,lxlCT3 mol/L;肌氨酸氧化酶，20000 units/L;過氧化物酶，60000 units/L; 取自血樣的肌氨酸)，反應(yīng)20分鐘，使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全，用熒光光 譜儀測定其熒光激發(fā)譜，得到熒光強度。由肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線求出 肌氨酸濃度為1 x 10'4mol/L。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā) 明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種定量檢測肌氨酸含量的方法，包括如下步驟S1配制不同濃度的肌氨酸溶液，向溶液中加入堿性緩沖液、肌氨酸氧化酶催化劑，對甲基酚或?qū)αu基苯乙酸，以及過氧化物酶催化劑，所述堿性緩沖液將溶液的pH值控制為8～11，所發(fā)生的如下化學(xué)反應(yīng)(1)和(2)中肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全(1)肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸；(2)過氧化氫+對甲基酚過氧化物酶熒光二聚體；或過氧化氫+對羥基苯乙酸過氧化物酶熒光二聚體；S2分別測定S1中反應(yīng)產(chǎn)物熒光二聚體在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光發(fā)射譜，用熒光發(fā)射峰強度數(shù)值與肌氨酸的濃度繪制肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線；S3采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸樣品發(fā)生如S1中所述的反應(yīng)，測量反應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射譜得到熒光強度數(shù)據(jù)，對比肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線得出未知肌氨酸樣品含量。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，Sl和S3中下列反應(yīng)試劑濃度分別為 對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 1 x 10-7~1 x l(r3 mol/L 肌氨酸氧化酶 10 20000units/L過氧化物酶 20~60000 units/L堿性緩沖液 0.05-0.5 mol/L。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，Sl和S3中下列反應(yīng)試劑濃度分別為 對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 5 x 1 (T6~2x 104mol/L 肌氨酸氧化酶 3000 15000 units/L過氧化物酶 10000-50000 units/L堿性緩沖液 0.1~0.25 mol/L。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，Sl和S3中下列反應(yīng)試劑濃度分別為對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液5x10—3~lxl(T4mol/L肌氨酸氧化酶5000~10000units/L過氧化物酶20000-30000 units/L堿性緩沖液0.15-0.2 mol/L。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，S2中激發(fā)光波長為300-360nm。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，S2中激發(fā)光波長為320nrn。
7、 如權(quán)利要求l-6任一項所述的方法，其中，堿性緩沖液為NHr NH4Cl 緩沖溶液、Tris緩沖溶液、硼酸緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液。
8、 一種用于如權(quán)利要求1所述方法的反應(yīng)試劑盒，包含濃度如下的各組分 對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 1 x 10-7~1 x i(T3 mol/L 肌氨酸氧化酶 10 20000units/L過氧化物酶 20-60000 units/L堿性緩沖液 0.05 0.5 mol/L。
9、 如權(quán)利要求8所述的反應(yīng)試劑盒，包含濃度如下的各組分 對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 5 x 1(T6 2 x l(T4mol/L 肌氨酸氧化酶 3000 15000units/L 過氧化物酶 10000~50000 units/L 石威性纟爰沖液 0.1~0.25mol/L。
10、 如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)試劑盒，包含濃度如下的各組分 對曱基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液 5 x 1 (T5 1 x l (T4 mol/L 肌氨酸氧化酶 5000 10000 units/L 過氧化物酶 20000~30000 units/L 堿性緩沖液 0.15-0.2 mol/L。
11、 如權(quán)利要求8 10任一項所述的反應(yīng)試劑盒，其中，石威性緩沖液為NH3-NH4Cl緩沖溶液、Tris緩沖溶液、硼酸緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量檢測肌氨酸含量的方法及反應(yīng)試劑盒，該方法包括步驟S1.配制不同濃度的肌氨酸溶液，向溶液中加入反應(yīng)試劑使肌氨酸、過氧化氫反應(yīng)完全；S2.分別測定S1中反應(yīng)產(chǎn)物熒光二聚體的熒光發(fā)射譜，繪制肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線；S3.采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸樣品發(fā)生如S1中所述的反應(yīng)，測量反應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射譜得到熒光強度數(shù)據(jù)，對比肌氨酸濃度-熒光強度關(guān)系曲線得出未知肌氨酸樣品含量。本發(fā)明反應(yīng)試劑盒組分包括對甲基酚或?qū)αu基苯乙酸溶液，肌氨酸氧化酶，過氧化物酶，以及堿性緩沖液。采用本發(fā)明方法，非常適合于尿樣或血樣中微量肌氨酸的大批量分析檢測。
文檔編號G01N21/64GK101587076SQ20091010790
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者戈早川, 楊海朋 申請人:深圳大學(xué)