一種特異檢測成熟microRNA表達水平的定量檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體設及一種特異檢測成熟microRNA表達水平 的定量檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] microRNAs(microRNA)是一類非編碼、內(nèi)源性的、長度約為20~23個核巧酸的單鏈 小分子RNAemicroRNAs由基因組DNA編碼，在細胞核內(nèi)最初被轉錄為幾百個核巧酸的pri-microRNA，之后被Drosha剪切成長度約70~90堿基的pre-microRNA，并進一步由胞漿的 Dicer加工，最終形成成熟microRNAs。成熟microRNAs對轉錄后水平的基因調(diào)控廣泛存在于 真核生物的發(fā)育和代謝過程，包括胚胎發(fā)育，細胞調(diào)亡、增殖、分化、應激應答，機體代謝，免 疫調(diào)節(jié)和疾病的發(fā)生與發(fā)展等。因此，建立一種快速、特異、靈敏的檢測方法對microRNA的 功能研究和臨床檢測具有重要意義。
[0003] pre-mi croRNA 是成熟 microRNA 的前體。pre-mi croRNA 含有一個莖環(huán)結構（Stem-loop)，經(jīng)過Dicer剪切加工，莖環(huán)結構中的莖與環(huán)分開，其中部分組成莖的兩個RNA單短鏈 即為成熟的microRNA。由一個pre-microRNA得到的兩個成熟microRNA通常分別被命名為 microRNA-5p和microRNA-3p(在舊的命名法中，也被稱為有義鏈和無義鏈）。理論上一對 111；[(31'01?魁-59和111；[(31'01?魁-化來源于同一個pre-microRNA，其數(shù)量應該是相等的。但在實際 研究中發(fā)現(xiàn)，很大一部分microRNA的5p和化數(shù)量差異非常大。原因在于，經(jīng)過Dicer剪切加 工后，得到的兩個成熟microRNA(5p和化），往往只有一條具有基因調(diào)控功能，另一條則迅速 被降解。因此在對mi croRNA的生物功能的研究中，特異的檢測成熟的mi croRNA-Sp或 microRNA-化的在細胞或組織中表達量是非常重要的。
[0004] 目前為止，常用的microRNA檢測方法主要有Ξ大類。其中Nodhern blotting被看 成是檢測單個microRNA的金標準，但是Nodhern blotting方法操作復雜，費時費力，不適 合高通量分析。忍片適合高通量的分析，但特異性和可重復性低。實時定量PCR適合高靈敏 的檢測，方便快捷，可用于mi croRNA批量檢測。但目前通用的Stem-1 OOP PCR方法因為上游 引物序列取自成熟microRNA的DNA序列，而該序列也同時存在于pre-microRNA中，因此 Stem-loop PCR方法無法排除pre-microRNA的非特異擴增。在實際實驗中需要反復調(diào)整反 應條件，W降低對pre-mi croRNA的非特異擴增，結果并不十分理想。一些公司在Stem-loop PCR方法的基礎上引入化qman探針，W期得到較高的擴增特異性，但化qman探針價格昂貴， 而且并不能完全彌補引物不特異而帶來非特異擴增?？傊壳暗姆椒ê茈y做到對成熟 microRNA高特異、高靈敏的便利檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種特異檢測成熟 microRNA表達水平的定量檢測方法及試劑盒，該方法檢測過程簡便，檢測結果靈敏準確。
[0006 ]本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)：
[0007]本發(fā)明公開的一種特異檢測成熟microRNA表達水平的定量檢測方法，包括W下步 驟：
[000引 1)提取樣品中的包含microRNA組分的總RNA或小RNA(small RNA)，在反轉錄酶及 Poly A聚合酶或化ly U聚合酶的作用下，反轉錄獲取cDNA;
[0009] 2)根據(jù)microRNA成熟序列及pre-microRNA序列，設計只針對microRNA成熟序列的 上游引物，然后進行實時定量PCR，特異性檢測成熟microRNA表達水平。
[0010] 步驟1)所述的反轉錄采用一步法進行短時反應。短時反應條件為:37°C，10~15分 鐘;42°C，10~15分鐘;85°C，5分鐘。
[0011] 步驟1)中化ly A聚合酶或化ly U聚合酶的使用，由成熟microRNA序列信息和pre-microRNA序列信息進行選擇。
[0012] 在pre-microRNA序列中，位于待測microRNA的5p或化序列下游的兩個堿基為-NA-時，使用POly U聚合酶;其中，N為A，U，C或G中的一個；
[0013] 在pre-microRNA序列中，位于待測microRNA的5p或化序列下游的兩個堿基為-NU-時，使用P0ly A聚合酶;其中，N為A，U，C或G中的一個；
[0014] 在pre-microRNA序列中，位于待測microRNA的5p或化序列下游的兩個堿基為-NS-時，使用poly A聚合酶或poly U聚合酶中的任意一個，其中，N為A，U，C或G中的一個;S為C或 G中的一個。
[0015] 步驟1)反轉錄過程中所用的引物根據(jù)所選的化ly A聚合酶或化ly U聚合酶而定。 [0016]當使用Poly A聚合酶時，反轉錄引物序列如SEQ.ID.no. 1所示，且在3'端末尾為 VN-;其中，V為A，C或G中的一個;N為A，T，C或G中的一個；
[0017]當使用Poly U聚合酶時，反轉錄引物序列如SEQ.ID.no. 2所示，且在3'端末尾為 BN-;其中，B為T，C或G中的一個;N為A，T，C或G中的一個。
[001引檢測成熟microRNA的上游引物為成熟microRNA的DNA序列加上末尾兩個堿基，該 末尾兩個堿基是根據(jù)反轉錄過程中所選的化ly A聚合酶或化ly U聚合酶而定。
[0019] 當使用Poly A聚合酶時，檢測成熟microRNA的上游引物的末尾添加的兩個堿基 為-AA;
[0020] 當使用Poly U聚合酶時，檢測成熟microRNA的上游引物的末尾添加的兩個堿基 為-TT。
[0021 ]本發(fā)明還公開了實現(xiàn)上述的特異性檢測成熟microRNA表達水平的定量檢測方法 的試劑盒(如100次檢測試劑盒），包括W下兩個部分:a)反轉錄部分，其構成組分有:M-MLV 逆轉錄酶（20,000U)，Poly A聚合酶（20U)，Poly U聚合酶（20U)，一步法反應緩沖液 (200ul)，反轉錄引物如SEQ.ID.no. 1(2.5uM)，反轉錄引物如SEQ.ID.no. 2(2.5uM);b)定量 PCR部分，其構成組分有:PCR酶（250U)，PCR反應緩沖液（1ml)，PCR反應下游通用引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（lOuM)，PCR反應microRNA特異上游引物（lOuM)。
[0022]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下有益的技術效果：
[002引本發(fā)明公開的特異檢測成熟microRNA表達水平的定量檢測方法，首先根據(jù) microRNA的成熟序列及其前體序列，使用多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶)或多 聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly (U)聚合酶)結合反轉錄酶，將microRNA反轉錄為cDNA。然后根 據(jù)microRNA的成熟序列及其前體序列，設計只針對成熟microRNA的上游引物。在實時定量 PCR過程中，該引物只擴增成熟microRNA的cDNA，而不會擴增pre-microRNA的cDNA，從而達 到高特異、高靈敏的檢測成熟microRNA的表達水平的目的。檢測過程簡便，檢測結果靈敏準 確。該方法能夠有效用于成熟microRNA(ma化re microRNA,長度為20-23個堿基）在細胞或 組織內(nèi)表達水平的檢測。根據(jù)PCR反應的特異性主要取決于引物3'端2-3個堿基的正確匹配 的特性，設計合成特異引物，該引物只識別成熟microRNA(長度為20-23個堿基)反轉錄產(chǎn)物 cDNA，在實時定量PCR過程中不會與microRNA前體(pre-microRNA，長度為70-90個堿基）的 反轉錄產(chǎn)物cDNA結合，即不存在針對pre-microRNA的非特異擴增。本發(fā)明檢測成熟 microRNA的特異性高于目前廣泛使用的基于實時定量PCR的其他方法。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明方法的原理圖；
[002引圖2為具體實施例1中，實時定量PCR的擴增曲線；
[0026] 圖3為具體實施例1中，根據(jù)擴增曲線得到的microRNA-124-5p在神經(jīng)元與化la細 胞內(nèi)相對表達水平柱狀圖；
[0027] 圖4為具體實施例1中，microRN