專利名稱：：促黃體生成激素的磁微粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于免疫分析醫(yī)學領域，具體地涉及一種促黃體生成激素的磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明試劑盒結合免疫磁微粒分離技術和化學發(fā)光免疫分析技術。
背景技術：
：促黃體生成激素(luteinizinghormone,LH)是垂體分泌的一種生殖激素，它是在下丘腦產(chǎn)生促性腺釋放激素(Gn-RH)的條件下，刺激垂體分泌的一種有兩條多肽鏈通過非共價鍵結合的糖蛋白激素。其分子量約為30kDa。LH的產(chǎn)生受下丘腦促性腺釋放激素的控制，同時又受性腺的正、負反饋調控。在女性，LH促進卵泡發(fā)育與成熟、誘發(fā)排卵、促進黃體生成、并合成與分泌孕酮，刺激卵泡的顆粒細胞產(chǎn)生并釋放雌激素。在男性，LH主要刺^C睪丸間質細胞分泌睪酮。LH檢測的臨床意義，在女性，月經(jīng)周期LH的釋放高峰與卵巢排卵有著密切關系，因此可以在月經(jīng)周期中監(jiān)測血清LH峰值，以確定最佳受孕時間。同時還可以鑒別原發(fā)性(卵巢性)或繼發(fā)性(垂體性)閉經(jīng)；在男性主要用于鑒別原發(fā)性或繼發(fā)性睪丸功能低下；另外，可鑒別青春期前兒童真性或假性早熟。如果血清促黃體生成激素檢測異常，如LH水平的增高可見于原發(fā)性性腺功能減退癥，卵巢功能衰竭所致閉經(jīng)，多囊卵巢綜合征等。LH的降低可見于垂體一下丘腦病變，閉經(jīng)一乳溢綜合征，Kallman綜合征，精神性厭食，垂體單純LH缺乏，青春期延期等。因此，血清LH含量測定對于預測排卵，診斷不孕癥，研究和判斷下丘腦-垂體-性腺軸功能及有關內分泌疾病的治療監(jiān)測等方面有重要意義。目前用于檢測LH的免疫分析方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等。根據(jù)大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，優(yōu)先順序依次為化學發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放6射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技術因其使用放射性元素作為標記物，^"環(huán)境有放射性污染，并存在靈敏度不高，操作復雜，試劑保存時間短以及檢測成本高等缺點；酶免疫分析法存在靈敏度低，信噪比不高，線性范圍窄等方法學制約因素；時間分辨熒光免疫分析對檢測環(huán)境的要求較高，易受空氣塵埃的干擾；化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLEIA)是一種綜合了化學發(fā)光的高靈敏性和免疫反應的高特異性的檢測技術，可使檢測靈敏度達到10—18摩爾水平，而且檢測范圍可達6個數(shù)量級。它是在放射免疫分析和酶免疫分析基礎之上發(fā)展起來的一種高靈敏度，高特異性，檢測線性范圍寬，標記物穩(wěn)定，儀器結構簡單，操作簡便，自動化程度高，應用廣泛，安全無放射性污染的免疫分析技術。目前化學發(fā)光免疫分析技術因其具有上述諸多優(yōu)點得到了廣泛的應用。在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復雜的樣品基質中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(抗原或抗體)，使其為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重復性好，操作簡單，不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。免疫磁微粒技術與化學發(fā)光免疫分析技術結合檢測待測物，可大大提高檢測的靈敏度和準確性，它以微米級磁微粒為載體，利用表面有機物提供的羧基活性基團與蛋白質氨基共價結合，采用抗體進行"搭橋"成免疫磁微粒，可進行抗原、抗體反應。該技術的新穎之處有(l)采用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面積，從而增加了抗體的有效包被量，不僅節(jié)省了抗體，而且有助于建立寬范圍的免疫檢測方法，尤其適合于高濃度臨床樣本的測定，避免彎鉤效應的發(fā)生；(2)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發(fā)光面積，提高反應的靈敏度，并采用旋轉磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結合抗原-抗體與游離抗體的作用；。)在液相反應中，使用發(fā)光增強劑，將水分子從發(fā)光底物的發(fā)光位點排開，同時還可縮短發(fā)光的達峰時間；(4)使用單克隆抗體，提高了反應的特異性。本發(fā)明的試劑盒利用化學發(fā)光免疫分析結合免疫磁微粒固相分離技術檢測LH，有助于促進化學發(fā)光免疫分析技術在臨床檢驗中的應用與發(fā)展。現(xiàn)有技術中的化學發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明是結合磁微粒免疫分離技術在酶免疫分析的基礎上應用酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物，因而其靈敏度大大提高，并且操作簡便適用性廣，既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量、快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發(fā)明內容本發(fā)明目的在于提供一種促黃體生成激素的磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。一種促黃體生成激素的磁微粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，所述試劑盒包括1)促黃體生成激素(luteinizinghormone,LH)系列校準品；2)抗異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)異硫氰酸熒光素標記的促黃體生成激素單克隆抗體(簡稱FITC標記物)；4)辣根過氧化物酶(HRP)標記的促黃體生成激素單克隆抗體(簡稱酶標記物)；5)化學發(fā)光底物液；6)濃縮洗滌液；所述試劑盒還包括反應管。所述試劑盒中反應管的材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液為0.05~0.1M、pH值為8.0-10.0的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為3.0~4.0mg/mL的魯米諾和終濃度為0.1-0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是0.050.1MpH值為4.05.0的檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100~200mg/mL的過氧化氫溶液。所述化學發(fā)光底物液優(yōu)選A液為O.IM、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為4.0mg/mL的魯米諾和終濃度為0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是O.IMpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為200mg/mL的過氧化氫溶液。所述濃縮洗滌液為0.01~0.05M、pH值為7.0-7.5的磷酸鹽緩沖液，且該緩沖液中含有體積百分比為0.01-0.05%的吐溫20和終濃度為9~10g/L的氯化鈉。所述濃縮洗滌液優(yōu)選為0.01M、PH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，且該緩沖液中含有體積百分比為0.01°/。的吐溫20和終濃度為9g/L的氯化鈉。上述試劑盒的制備方法，包括以下操作步驟1)促黃體生成激素系列校準品的制備用馬血清將促黃體生成激素純品稀釋成校準品，其校準品濃度范圍為0-200mlU/mL;2)抗異硫氰酸熒光素單克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備將粒徑為23的磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻2小時后，加磁場，靜置2025min，倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗35次，并用該緩沖液進行懸浮,濃度為50~100mg/mL;每亳升懸浮液中加入抗FITC單克隆抗體60~100嗎，在4'C下攪拌過夜后，加磁場，靜置10-15min，倒出上清，用封閉緩沖液于室溫封閉3~4小時；最后用pH值為7.4、含體積百分比為0.1~0.3%的吐溫-20和質量百分比為0.05-0.1%的疊氮化鈉防腐劑的0.01~0.05M磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該緩沖液將包被抗體的磁微粒制成5~10mg/mL的工作液；3)異硫氰酸熒光素標記的促黃體生成激素單克隆抗體制備將抗促黃體生成激素單克隆抗體置于透析袋，在pH9.0-9.5、50mmol/LNaHCO3緩沖液中過夜透析后，置入溶有0.01~0.03mg/mL的異硫氰酸熒光素的pH9.09.5、50mmol/L碳酸鹽緩沖液中，其中，抗促黃體生成激素單克隆抗體與異硫氰酸熒光素的摩爾用量比為1:71:12，在4'C下攪拌反應16~20小時后，將緩沖液更換為pH7.0-7.5、0.01mol/LPBS液，然后每隔4~6小時更換pH7.0~7.5、0.01mol/LPBS液一次，共更換45次，將反應液置于離心管中，3000rpm離心30min,棄去沉淀。上清液為相應標記物，用20%的小牛血清對制備的標記物進行稀釋且工作濃度為0.51.0嗎/mL;4)辣根過氧化物酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體的制備采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記促黃體生成激素,采用方陣法選擇酶標記物的工作濃度，將制備的酶標記物用稀釋液按1:10001:3000比例稀釋成工作濃度；5)化學發(fā)光底物液的配制A液為用0.05~0.1M、pH值為8.0~10.0的Tris-HCl緩沖液配制魯米諾終濃度為3.0~4.0mg/mL、對碘苯酚終濃度為0.1-0.3mg/mL的溶液；B液為用0.05~0.1M、pH值為4.0~5.0的檸檬酸緩沖液配制過氧化氫終濃度為100~200mg/mL的溶液；6)濃縮洗滌液的配制向0.01-0.05MpH值為7.0~7.5的磷酸鹽緩沖液中加入體積百分比為0.01~0.05°/。的吐溫20和終濃度為9~10g/L的氯化鈉；7)分裝上述l)~6)步驟制備的產(chǎn)物和反應管；8)組裝為成品。所述濃縮洗滌液使用時用去離子水稀釋20倍。所述載體磁微粒為23^im粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團的聚合物。所述活性基團為氨基。所述封閉緩沖液為含有質量百分比為0.2~1.0%的牛血清白蛋白和0.51.0%酪蛋白的pH7.2的0.02mol/L的磷酸緩沖液。所述化學發(fā)光底物液優(yōu)選配制A液為用0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液配制魯米諾終濃度為4.0mg/mL、對碘苯酚終濃度為0.3mg/mL的溶液；B液為用0.1M、pH值為4.6的檸檬酸緩沖液配制過氧化氫終濃度為200mg/mL的溶液。所述濃縮洗滌液的優(yōu)選配制為向0.01M、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入體積比為0.01%的吐溫20和終濃度為9g/L的氯化鈉。所述酶標記物稀釋液為含有12.12g/LTris，5g/LBSA，體積百分比為0.1%的Proclin防腐劑的水溶液。所述促黃體生成激素校準品的原料為標準級，純度不低于99%。本發(fā)明試劑盒的檢測原理FITC標記的促黃體生成激素單克隆抗體、酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體和待測樣品中的待測抗原，形成"雙夾心免疫復合物"，之后抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒再與該復合結構結合，形成"磁微粒-FITC抗體-FITC標記的LH抗體-待測抗原-酶標記的LH抗體"復合物，最后與化學發(fā)光底物作用而產(chǎn)生光信號，在管式發(fā)光儀中對LH進行檢測。本發(fā)明采用"雙抗體夾心法"反應模式，有效地利用了化學發(fā)光檢測技術結合磁微粒免疫分離技術原理，定量測定人體血清、血漿樣品中LH含量，確保了檢測的靈敏度，且各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點。對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒結構簡單，使用方便，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，試劑盒成本低，無放射性污染，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測及篩査實驗室。此外，由于本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖(雙對數(shù)標準曲線)。圖2為本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對的相關曲線。具體實施例方式以下實施例中使用的生物試劑的來源馬血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所；LH純品購自美國Fitzerald公司，純度為99.9%;抗FITC單克隆抗體購自美國Fitzerald公司；磁微粒購自意大利Adaltis公司，磁微粒表面包裹帶有氨基活性基團的聚合物；抗LH單克隆抗體來源于美國Fitzerald公司；異硫氰酸熒光素購自美國Sigma公司；小牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；辣根過氧化物酶購自美國Sigma公司。以下實施例中所述FITC標記物為異硫氰酸熒光素標記的促黃體生成激素單克隆抗體；所述酶標記物為辣根過氧化物酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體。以下實施例中涉及的物質的百分比如無特別說明均為質量百分比。1000mL酶標記物(辣根過氧化物酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體)稀釋液的配帝!l:稱取Tris12.12g;BSA5g;量取Proclin防腐劑1mL,用雙蒸水定容至1000mL。實施例1本發(fā)明的LH磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備I1、LH系列校準品的制備用馬血清將LH純品稀釋成校準品，分裝成濃度為0、0.5、2、10、50、100、200mlU/mL共7瓶。2、抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液的制備將粒徑為2.8pm的磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻2小時后，加磁場，磁場強度為2000高斯，靜置25min，倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進行懸浮，濃度為100mg/mL;每毫升懸浮液中加入抗FITC單克隆抗體100嗎，在4'C下攪拌過夜后，加磁場，磁場強度為2000高斯，靜置10min，倒出上清，用含有1.0。/。牛血清白蛋白和0.5X酪蛋白的0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉3小時；最后用pH值為7.4、含體積百分比為0.1%的吐溫20和0.05%的疊氮化鈉防腐劑的0.01M磷酸鹽洗滌緩沖液清洗4次，并用該溶液配制成5mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4'C保存，不應凍存，用時輕輕搖勻。3、FITC標記的LH單克隆抗體的制備將2mL、濃度為2mg/mL的抗促黃體生成激素單克隆抗體置于透析袋，在pH9.3、50mmol/LNaHC03緩沖液中過夜透析后，置入10mL溶有0.03mg/mL的異硫氰酸熒光素的pH9.3、50mmol/L碳酸鹽緩沖液中，在4'C下攪拌反應20小時后，將緩沖液更換為pH7.3、0.01mol/LPBS液，然后每隔5小時更換pH7.3、0.01mol/LPBS液一次，共更換5次，將反應液置于離心管中，3000rpm離心30min，棄去沉淀。上清液為相應標記物，標記物可加入等體積甘油，置-2(TC下保存待用。用20%的小牛血清對制備的標記物進行稀釋，工作濃度為0.5ng/mL。4、辣根過氧化物酶標記LH單克隆抗體的制備采用過碘酸鈉法進行標記。即利用過碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，再經(jīng)過醛基與抗體的伯氨基反應形成Schiff堿。后者經(jīng)NaBH4還原-NK:-鍵成為穩(wěn)定的結合物。具體操作步驟如下(1)稱取HRP5.0mg，加雙蒸水250pL溶解；稱取NaI045.0mg，加雙蒸水250|iL溶解；向HRP溶液中逐滴加入Nal04溶液，邊加邊攪拌；將混合好的溶液置于4。C，靜置30min;取5mL乙二醇溶于25雙蒸水中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；室溫靜置30min，將HRP氧化；(2)調整LH單克隆抗體濃度到約5.0mg/mL，用0.05mol/L碳酸緩沖液透析去除甘油等雜質，4°C過夜透析，期間換透析液3次；將抗體與HRP按體積1:5混合，于0.05mol/L碳酸緩沖液中透析6小時，依次換透析液；加入新配制的NaBH4溶液終止反應，搖勻，4°C靜置2小時，每30min搖一次；用0.02mo1/LPBS緩沖液過夜磁力攪拌透析，期間換一次透析液；(3)完成標記的抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌30min;4°C靜置1小吋，8000rpm離心10min，將上清液移至新管，沉淀用等體積PBS重新懸浮；重復上述操作3次，收集分離的各個組分，提純的HRP-抗體結合物用PBS過夜透析；可向得到的酶標記物中加入等體積甘油，-20°C保存?zhèn)溆?。用酶標記物稀釋液進行稀釋，稀釋比例為1:2000。5、化學發(fā)光底物液的配制A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入終濃度為4.0mg/mL的魯米諾和終濃度為0.3mg/mL的對碘苯酚等發(fā)光增強劑。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入終濃度為200mg/mL的過氧化氫溶液。在使用前根據(jù)使用量將A液和B液等體積混合。6、濃縮洗滌液的配制濃縮洗滌液是向O.OlMpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入體積比為0.01%的Tween20和終濃度為9g/L的NaCl。7、將用上述方法制備的各組分，組裝成試劑盒，以檢測50個樣品的試劑盒為例，包括1)LH系列校準品共7瓶，3mL/瓶；2)抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液1瓶，共6mL;3)FITC標記的LH單克隆抗體1瓶，3mL;4)辣根過氧化物酶標記LH單克隆抗體1瓶，3mL;5)化學發(fā)光底物A液1瓶，12mL、B液1瓶，12mL;在使用前根據(jù)使用量將A液和B液等體積混合；6)濃縮洗滌液1瓶，6mL，使用時用去離子水稀釋20倍；7)聚苯乙烯材料的反應管1袋，50個，每管10mm直徑X50mm長度。實施例2本發(fā)明的LH磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備II1、LH系列校準品的制備，同實施例l;2、抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液的制備將粒徑為2.0pm的磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻2小時后，加磁場，磁場強度為2000高斯，靜置25min，倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗4次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50mg/mL;每毫升懸浮液中加入抗FITC單克隆抗體80嗎，在4。C下攪拌過夜后，加磁場，磁場強度為2000高斯，靜置15min，倒出上清，用含有0.5%牛血清白蛋白、1.0%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉4小時；最后用pH值為7.4、含0.3%Tween20和0.1%疊氮化鈉防腐劑的0.05M磷酸鹽洗滌緩沖液清洗4次，并用該溶液配制成7.5mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4'C保存，不應凍存，用時輕輕搖勻。3、FITC標記的LH單克隆抗體的制備將lmL、濃度為1mg/mL的抗促黃體生成激素單克隆抗體置于透析袋在pH9.0、50mmol/LNaHC03緩沖液中過夜透析后，置入10mL溶有0.01mg/mL的異硫氰酸熒光素的pH9.0、50mmol/L碳酸鹽緩沖液中，在4'C下攪拌反應18小時后，將緩沖液更換為pH7.0、0.01mol/LPBS液，然后每隔5小時更換pH7.0、'0.01mol/LPBS液一次，共更換5次，將反應液置于離心管中，3000rpm離心30min，棄去沉淀。上清液為相應標記物，標記物中加入等體積甘油后，置-2(TC下保存待用。用20%的小牛血清對制備的標記物進行稀釋，工作濃度為0.5嗎/mL。4、辣根過氧化物酶標記LH單克隆抗體的制備，同實施例l，用酶標記物稀釋液進^1稀釋，稀釋比例為1:1000。5、化學發(fā)光底物液的配制A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.05MpH值為8.0的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入終濃度為3.0mg/mL的魯米諾和終濃度為0.1mg/mL的對碘苯酚等發(fā)光增強劑。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.05MpH值為4.0的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入終濃度為100mg/mL的過氧化氫溶液。在使用前根據(jù)使用量將A液和B液等體積混合。6、濃縮洗滌液的配制濃縮洗滌液是向0.05MpH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中加入體積比為0.05%的Tween20和終濃度為10g/L的NaCl。7、將用上述方法制備的各組分，組裝成試劑盒，以檢測50個樣品的試劑盒為例，包括1)LH系列校準品共7瓶，3mL/瓶；2)抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液1瓶，共4mL;3)FITC標記的LH單克隆抗體1瓶，3mL;4)辣根過氧化物酶標記LH單克隆抗體1瓶，3mL;5)化學發(fā)光底物A液1瓶，12mL、B液1瓶，12mL;在使用前根據(jù)使用量將A液和B液等體積混合；6)濃縮洗滌液l瓶，6mL，使用時用新鮮制備的去離子水稀釋20倍；7)聚苯乙烯材料的反應管1袋，50個，每管10mm直徑X50mm長度。實施例3本發(fā)明的LH磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備III1、LH系列校準品的制備，同實施例l;2、抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液的制備將粒徑為3.0Mm的磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻2小時后，加磁場，磁場強度為2000高斯，靜置20min，倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為75mg/mL;每毫升懸浮液中加入抗FITC單克隆抗體60嗎，在4'C下攪拌過夜后，加磁場，磁場強度為2000高斯，靜置10min，倒出上清，用含有0.5%牛血清白蛋白、0.5%%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉3小時；最后用pH值為7.4、含0.2%Tween20和0.1%疊氮化鈉防腐劑的0.05M磷酸鹽洗滌緩沖液清洗4次，并用該溶液配制成10mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4"C保存，不應凍存，用時輕輕搖勻。3、FITC標記的LH單克隆抗體的制備將lmL、濃度為2mg/mL的抗促黃體生成激素單克隆抗體置于透析袋在pH9.5、50mmol/LNaHC03緩沖液中過夜透析后，置入10mL溶有0.02mg/mL的異硫氰酸熒光素的pH9.5、50mmol/L碳酸鹽緩沖液中，在4'C下攪拌反應16小時后，將緩沖液更換為pH7.5、0.01mol/LPBS液，然后每隔5小時更換pH7.5、0.01mol/LPBS液一次，共更換4次，將反應液置于離心管中，3000rpm離心30min，棄去沉淀。上清液為相應標記物，標記物中加入等體積甘油后，置-20'C下保存待用。用20%的小牛血清對制備的標記物進行稀釋，工作濃度為1嗎/mL。4、辣根過氧化物酶標記LH單克隆抗體的制備，同實施例1，用酶標記物稀釋液進行稀釋，稀釋比例為1:3000;5、化學發(fā)光底物液的配制A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為9.0的Tris-HCI緩沖液。在此緩沖液中加入終濃度為3.5mg/mL的魯米諾和終濃度為0.2mg/mL的對碘苯酚等發(fā)光增強劑。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.lMpH值為5.0的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入終濃度為150mg/mL的過氧化氫溶液。在使用前根據(jù)使用量將A液和B液等體積混合。6、濃縮洗滌液的配制-濃縮洗滌液是向0.01MpH值為7.5的磷酸鹽緩沖液中加入體積比為0.05%的Tween20和終濃度為9.5g/L的NaCl。7、將用上述方法制備的各組分，組裝成試劑盒，以檢測50個樣品的試劑盒為例，包括1)LH系列校準品共7瓶，3mL/瓶；2)抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液1瓶，共3mL;3)FITC標記的LH單克隆抗體1瓶，1.5mL;4)辣根過氧化物酶標記LH單克隆抗體1瓶，3mL;5)化學發(fā)光底物A液1瓶，12mL、B液1瓶，12mL;在使用前根據(jù)使用量將A液和B液等體積混合；6)濃縮洗滌液l瓶，6mL,使用時用去離子水稀釋20倍；7)聚苯乙烯材料的反應管1袋，50個，每管1Omm直徑X50mm長度。實施例4以實施例1制備的本發(fā)明試劑盒檢測血清中LH的濃度的方法1、樣品前處理取人的空腹晨血清樣品，3000rpm離心5min，取上層血清進行分析。2、檢測方法使用本試劑盒進行實驗前，需先取出磁微粒溶液、FITC標記物、酶標記物、校隹品/待測樣品、在室溫放置1530分鐘，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調至37°C;準備好合適的微量加樣器及對應吸頭并且檢查化學發(fā)光儀是否正常工作。具體操作步驟將圓底聚苯乙烯試管編號后，依次向試管中加入50血清樣品和LH系列校準品溶液，再加入FITC標記物與酶標記物各50nL，37'C振蕩反應30min后，加入100抗FITC抗體包被的磁微粒溶液，室溫孵育10min，之后每管加入稀釋20倍后的洗滌液500pL，充分混勻，置于磁分離器上分離2min，倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復4次。各管加入混合后的化學發(fā)光底物A和B液200^00|iL，充分混勻，置于磁分離器內，待磁微粒富集于底部后，暗處放置5min，而后在管式化學發(fā)光測量儀上依序測量各管的發(fā)光強度(RLU)。以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪出標準曲線(雙對數(shù)曲線)，以待測血清RLU值在標準曲線上査出該血清LH的濃度，見附圖1，其中，標準曲線方程為Log(Y)=0.7241Log(X)+3.5018，相關系數(shù)r=0.9992。實施例5本發(fā)明的試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對通過實施例l中制備成的試劑盒進行方法學檢定，本發(fā)明對試劑盒的精密度、準確度、靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性等都進行了具體的實驗操作，結果如下1、試劑盒精密度測定將實施例1中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，分別測定低、中、高三種不同濃度的血清，IO孔平行測定，得出每次分析的批內和多次分析的批間變異(表l)。其批內和批間變異系數(shù)均小于9%。表1方法精密度考察樣品測定次數(shù)LH濃度(mlU/mL)CV。/。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>33018.418.302、試劑盒準確度測定準確性是指測量值接近真值的程度，通常用回收率表示。取兩個LH臨床定值血清，濃度分別為9.47mlU/mL和20.5mlU/mL，分別向其中加入終濃度為7.5、45和75mlU/mL的LH標準品，按照實施例1的方法對每個濃度做3個平行，計算回收率。結果如表2所示，LH的加標回收率在97.5%~104.1%之間。表2方法準確度測定樣品值(mlU/mL)加入值(mlU/mL)測定平均值(mlU/mL)回收率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>20.54566.50102.27597.5102.73、試劑盒靈敏度實驗靈敏度是在一給定的顯著性水平上可與零劑量相區(qū)別的劑量，是指分析方法的最小檢出量(記為零標準點的平均值+2SD)。平均測定10個So標準點，計算其發(fā)光強度的平均值和標準偏差，帶入線性方程，計算出對應的濃度值，并重復該操作5次，得到該方法的最低檢出限為0.2mlU/mL。并與其它方法比對，見表3。表3方法靈敏度實驗方法靈敏度(mlU/mL)放射免疫方法0.3板式化學發(fā)光方法0.8本發(fā)明方法0.24、試劑盒特異性實驗對實施例1的試劑盒特異性檢驗是選取與LH具有相近結構的HCG、TSH和FSH，配制成濃度遠大于生理濃度的臨床樣本，以本法進行測定，并按照以下公式計算抗體的交叉反應率(crossreactivity,CR):CR=100xClh/Ccross-reactant其中Cm指測得的LH濃度，Ccr。^eaetant指交叉反應物的實際濃度。結果見表4，本法與HCG、TSH和FSH的交叉反應率均小于0.5。/。，具有良好的特異性，完全符合臨床檢測的要求。表4方法特異性實驗交叉反應物實驗濃度LH測定濃度(mlU/mL)交叉反應率(％)HCG500mIU/mL2.3750.48150mIU/mL0.3750.2550mIU/mLND*024<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>5、試劑盒穩(wěn)定性實驗對實施例1的試劑盒分別進行4"C、37'C的3天和7天穩(wěn)定性實驗，結果表明試劑盒標準品發(fā)光強度的變化、待測物的加標回收率、批內批間變異系數(shù)等指標均在正常范圍之內。考慮到試劑盒冷凍情況的發(fā)生，將實施例1的試劑盒放入-2(TC冷凍7天，測定結果也表明試劑盒的各項指標完全正常。，經(jīng)過大量的實驗證明，本發(fā)明的試劑盒方法學指標如下檢測范圍0-200mlU/mL;靈敏度最小檢出限為0.2mlU/mL;精密度小于9%;準確性平均回收率在97.5%~104.1%之間；特異性與HCG、TSH、FSH的交叉反應率小于0.5%;穩(wěn)定性各試劑組分置4'C和37'C，考察3d、7d后，各組分仍穩(wěn)定，測定結果符合上述要求。實施例6本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對用實施例1制得的試劑盒(使用方法見實施例4)和購自美國Monobind公司的微孔板化學發(fā)光試劑盒(使用方法見說明書)對60份人血清樣品同時進行檢測。其檢測結果見附圖2，以本發(fā)明方法測定的血樣LH結果為橫坐標，以Monobind試劑盒測定的結果為縱坐標作回歸分析,相關灘為M纖x+,0，相關系數(shù)產(chǎn),45。經(jīng)統(tǒng)計學處理結棘明，本發(fā)明方法同國外試劑盒臨床血樣測值相關性良好。權利要求1、一種促黃體生成激素的磁微粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)促黃體生成激素系列校準品；2)抗異硫氰酸熒光素單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)異硫氰酸熒光素標記的促黃體生成激素單克隆抗體；4)辣根過氧化物酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體；5)化學發(fā)光底物液；6)濃縮洗滌液。2、根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應管。3、根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中反應管的材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。4、根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液為0.050.1M、pH值為8.010.0的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為3.04.0mg/mL的魯米諾和終濃度為0.1-0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是0.05~0.1MpH值為4.0~5.0的檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100~200mg/mL的過氧化氫溶液。5、根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液A液為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為4.0mg/mL的魯米諾和終濃度為0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是0.1M、pH值為4.6的檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為200mg/mL的過氧化氫溶液。6、根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為0.01~0.05M、pH值為7.0~7.5的磷酸鹽緩沖液，且該緩沖液中含有體積百分比為0.01-0.05%的吐溫20和終濃度為9~10g/L的氯化鈉。7、根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為0.01M、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，且該緩沖液中含有體積百分比為0.0P/。的吐溫20和終濃度為9g/L的氯化鈉。8、一種權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟-1)促黃體生成激素系列校準品的制備用馬血清將促黃體生成激素純品稀釋成校準品，其校準品濃度范圍為0~200mlU/mL;2)抗異硫氰酸熒光素單克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備將粒徑為2~3nm的磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻2小時后，加磁場，靜置2025min，倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗35次，并用該緩沖液進行懸浮，濃度為50~100mg/mL;每毫升懸浮液中加入抗FITC單克隆抗體60~100嗎，在4"下攪拌過夜后，加磁場，靜置10-15min，倒出上清，用封閉緩沖液于室溫封閉3~4小時；最后用pH值為7.4、含體積百分比為0.1~0.3%的吐溫-20和質量百分比為0.05~0.1%的疊氮化鈉防腐劑的0.01~0.05M磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該緩沖液將包被抗體的磁微粒制成5~10mg/mL的工作液；3)異硫氰酸熒光素標記的促黃體生成激素單克隆抗體制備將抗促黃體生成激素單克隆抗體置于透析袋，在pH9.09.5、50mmol/L碳酸鹽緩沖液中過夜透析后，置入溶有0.01~0.03mg/mL的異硫氰酸熒光素的pH9.09.5、50mmol/L碳酸鹽緩沖液中，其中，抗促黃體生成激素單克隆抗體與異硫氰酸熒光素的摩爾用量比為1:71:12，在4'C下攪拌反應16~20小時后，將緩沖液更換為pH7.0-7.5、0.01mol/LPBS液，然后每隔4~6小時更換pH7.0~7.5、0.01mol/LPBS液一次，共更換45次，將反應液置于離心管中，3000rpm離心30min，棄去沉淀。上清液為相應標記物，用20%的小牛血清稀釋標記物，工作濃度為0.5-1.0ng/mL;4)辣根過氧化物酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體的制備采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記促黃體生成激素,采用方陣法選擇酶標記物的工作濃度，將制備的酶標記物用稀釋液按1:10001:3000比例稀釋成工作濃度；5)化學發(fā)光底物液的配制-A液為用0.05~0.1M、pH值為8.0~10.0的Tris-HCl緩沖液配制魯米諾終濃度為3.0-4.0mg/mL、對碘苯酚終濃度為0.1-0.3mg/mL的溶液；B液為用0.05~0.1M、pH值為4.0-5.0的檸檬酸緩沖液配制過氧化氫終濃度為100~200mg/mL的溶液；6)濃縮洗滌液的配制向0.01-0.05M、pH值為7.0~7.5的磷酸鹽緩沖液中加入體積百分比為0.01~0.05%的吐溫20和終濃度為9~10g/L的氯化鈉；7)分裝上述l)~6)步驟制備的產(chǎn)物和反應管；8)組裝為成品。9、根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述磁微粒為23pm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團的聚合物。10、根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述封閉緩沖液為含有質量百分比為0.2~1.0%的牛血清白蛋白和0.5~1.0%酪蛋白的pH7.2的0.02mol/L的磷酸緩沖液。11、根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液A液為用0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液配制魯米諾終濃度為4.0mg/mL、對碘苯酚終濃度為0.3mg/mL的溶液；B液為用0.1M、pH值為4.6的檸檬酸緩沖液配制過氧化氫終濃度為200mg/mL的溶液。12、根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述濃縮洗滌液的配制為向0.01M、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入體積百分比為0.01%的吐溫20和終濃度為9g/L的氯化鈉。全文摘要本發(fā)明公開了屬于免疫分析醫(yī)學領域的一種促黃體生成激素(LH)磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒。該試劑盒包括1)促黃體生成激素系列校準品；2)抗異硫氰酸熒光素單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)異硫氰酸熒光素標記的促黃體生成激素單克隆抗體；4)辣根過氧化物酶標記的促黃體生成激素單克隆抗體；5)化學發(fā)光底物液；6)濃縮洗滌液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法，本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號G01N33/577GK101614742SQ20091008958公開日2009年12月30日申請日期2009年7月23日優(yōu)先權日2009年7月23日發(fā)明者林金明,勤肖申請人:清華大學