一種三聚氰胺的磁珠分離化學發(fā)光免疫檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測分析技術領域，涉及到食品安全相關的免疫分析檢測技術， 提供了一種三聚氰胺的磁珠分離化學發(fā)光免疫檢測方法，適用于牛奶、奶粉及飼料等樣本 中三聚氰胺的定量檢測。
【背景技術】
[0002] 三聚氰胺（Melamine，MEL)俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合 物，被用作化工原料，可用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料的生產(chǎn)。它是白色單斜晶體， 幾乎無味，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸、甘油等，對身體有害，不可用于食品加工或食品添 加物。對在食品中人為添加三聚氰胺的，依法追究法律責任。
[0003] 食品工業(yè)中常常需要檢查蛋白質含量，業(yè)界常使用一種叫做"凱氏定氮法 (Kjeldahl method) "的方法，通過食品中氮原子的含量來間接推算蛋白質的含量。也就是 說，食品中氮原子含量越高，這蛋白質含量就越高。三聚氰胺的最大的特點是含氮量很高 (66% )，所以常被不法商人添加到食品和飼料中以虛假提高蛋白質的含量，對人類及動物 健康造成了嚴重危害，三聚氰胺在生物體內無代謝轉化，急性毒性很低，但長期食用會形成 泌尿結石，造成腎結石、腎損傷、腎功能衰竭，甚至膀胱癌。近年來，三聚氰胺污染食品導致 中毒事件時有發(fā)生。2008年的"問題奶粉"事件造成上萬嬰兒腎損傷甚至死亡，為確保人體 健康，確保乳與乳制品質量安全，衛(wèi)生部發(fā)布25號公告制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨 時管理限量值，隨后國務院發(fā)布施行《乳品質量安全監(jiān)督管理條例》，加強乳品質量監(jiān)管。
[0004] 目前市場上常用檢測三聚氰胺試劑主要是采用膠體金免疫層析技術、酶聯(lián)免疫技 術等分析方法，而實驗室及檢驗中心多采用高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、氣相 色譜-質譜聯(lián)用法檢測樣本中三聚氰胺含量。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種三聚氰胺定量檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的試劑盒，
[0007] 為 1)或 2):
[0008] 1)包括異硫氰酸熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體溶液、堿性磷酸酶標記的三聚 氰胺抗原溶液和磁分離試劑；
[0009] 所述異硫氰酸熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體溶液和所述堿性磷酸酶標記三 聚氰胺抗原溶液的溶劑均為抗試劑緩沖液；
[0010] 所述抗試劑緩沖液按照如下方法制備：將溶液A、動物血清和防腐劑混勻得到抗 試劑緩沖液；
[0011] 所述溶液A由Na+、Mg 2+、Zn2+、Trizma base、動物血清白蛋白和水組成；
[0012] 2)包括所述異硫氰酸熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體、所述堿性磷酸酶標記三 聚氰胺抗原和所述抗試劑緩沖液。
[0013] 上述試劑盒中，所述抗試劑緩沖液中，所述動物血清為牛血清，所述防腐劑為 ProcLin-300 ；
[0014] 所述溶液A、所述牛血清和所述ProcLin-300的配比為1000 g : 2. 0~1 OmT,:0. 2-1. OmT,；
[0015] 所述溶液A中，所述Na+的濃度為0· 1-0. 5mol/L，所述Mg 2+的濃度為lmmol/L，所 述Zn2+的濃度為0. lmmol/L,所述牛血清白蛋白的質量百分含量為0. 2-1. 0%;所述Trizma base 濃度為 20-100mmol/L。
[0016] 上述試劑盒中，所述抗試劑緩沖液中，所述溶液A、所述牛血清和所述 ProcLin-300 的配比為 1000 g :5mL:0. 5mL ;
[0017] 所述溶液A中，所述Na+源于NaCl，所述NaCl濃度為0· lmol/L ;
[0018] 所述牛血清白蛋白的質量百分含量為0. 5% ;
[0019] 所述 Trizma base 的濃度為 50mmol/L〇
[0020] 上述試劑盒中，所述異硫氰酸熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體溶液由異硫氰酸 熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體和所述抗試劑緩沖液組成，所述異硫氰酸熒光素標記的 三聚氰胺單克隆抗體的濃度為〇. 1-0. 5 μ g/mL ;
[0021] 所述堿性磷酸酶標記三聚氰胺抗原溶液由堿性磷酸酶標記三聚氰胺抗原和所述 抗試劑緩沖液組成，所述堿性磷酸酶標記三聚氰胺抗原的濃度為〇. 2-1 μ g/mL。
[0022] 上述試劑盒還包括磁分離試劑；
[0023] 所述磁分離試劑為將抗異硫氰酸熒光素抗體共價連接在磁珠表面，得到磁分離試 劑；
[0024] 所述抗異硫氰酸熒光素抗體為多克隆抗體；
[0025] 所述抗異硫氰酸熒光素抗體和所述磁珠的配比為30 μ g-200 μ g :lmg ;
[0026] 所述磁珠的直徑為0. 5-1. 5 μ m。
[0027] 上述試劑盒還包括校準品；
[0028] 所述校準品由η個不同濃度的校準品溶液組成，所述校準品溶液由三聚氰胺抗原 和校準品緩沖液組成，且所述三聚氰胺抗原在所述校準品中為不同濃度；η小于等于6 ;
[0029] 所述校準品緩沖液按照如下方法制備：將溶液B和防腐劑混勻得到；
[0030] 所述溶液B由二水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、NaCl和水組成，
[0031] 所述溶液B和所述防腐劑的配比為1000 g :0. 2-1. OmL ;
[0032] 所述溶液B中，所述二水磷酸二氫鈉的濃度為2mmol/L，所述磷酸氫二鈉濃度為 8mmol/L，所述NaCl質量百分含量為0. 2% -1. 0%。
[0033] 上述試劑盒中，所述防腐劑為ProcLin-300 ;
[0034] 所述溶液 B 和 ProcLin-300 的配比為 1000 g :0· 5ml ;
[0035] 所述溶液B中，所述NaCl的質量百分含量為0· 9 %。
[0036] 上述試劑盒還包括質控品、樣本稀釋液、清洗液和底物溶液；
[0037] 所述質控品為2個不同濃度的校準品；
[0038] 所述清洗液由吐溫-20、氯化鈉和濃度為0. 15M、pH為8. 0±0. 05的Tris-HCl緩沖 液組成，其中，所述吐溫-20的體積百分含量為0. 04%，所述氯化鈉的濃度為0. 25mol/L ;
[0039] 所述底物溶液由二氫吖啶和濃度為0· 25mol/LpH為8· 0±0· 05的Tris-HCl緩沖 液組成，其中，所述二氫吖啶的濃度為0. 25g/mL ;
[0040] 所述樣本稀釋液為校準品緩沖液。
[0041] 上述抗試劑緩沖液的pH值為7. 0 ±0· 05。
[0042] 上述校準品緩沖液的pH值為7. 2 ±0. 05。
[0043] 上述異硫氰酸熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體為用異硫氰酸熒光素標記三聚 氰胺單克隆抗體得到的產(chǎn)物；
[0044] 上述堿性磷酸酶標記三聚氰胺抗原為用堿性磷酸酶標記三聚氰胺抗原得到的產(chǎn) 物。
[0045] 上述校準品為濃度為0、l、3、9、27、100ng/mL三聚氰胺抗原溶液。
[0046] 上述質控品為濃度為3ng/mL和27ng/mL的校準品。
[0047] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述的試劑盒的方法。
[0048] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將上述試劑盒中8種組分均獨立包裝；再整體 包裝為試劑盒。
[0049] 上述的試劑盒在三聚氰胺定量檢測中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0050] 或上述的試劑盒在制備三聚氰胺定量檢測產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明保護的范 圍；
[0051] 或上述的試劑盒中8種組分在制備三聚氰胺定量檢測產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明 保護的范圍；
[0052] 或本發(fā)明還保護一種待測樣本中三聚氰胺定量檢測方法，包括如下步驟：
[0053] 1)上述的試劑盒中樣本稀釋液稀釋待測樣本，得到稀釋待測樣本；
[0054] 2)將上述的試劑盒中的校準品、質控品和所述稀釋待測樣本分別與上述的試劑盒 中的異硫氰酸熒光素標記的三聚氰胺單克隆抗體溶液和堿性磷酸酶標記三聚氰胺抗原溶 液混勻，反應，得到免疫反應產(chǎn)物；
[0055] 3)將所述免疫反應產(chǎn)物與上述的試劑盒中的磁分離試劑混勻，反應，得到反應產(chǎn) 物，將所述反應產(chǎn)物中的沉淀與磁珠清洗液混懸，收集沉淀，即為磁分離產(chǎn)物；
[0056] 4)將所述磁分離產(chǎn)物和上述的試劑盒中的底物溶液混勻，得到混合產(chǎn)物，用化學 發(fā)光儀檢測所述混合產(chǎn)物的發(fā)光強度，通過發(fā)光強度計算待測樣本中全量程三聚氰胺定 量；
[0057] 所述磁珠清洗液為將上述的試劑盒中清洗液與水按1:7混勻，得到溶液；
[0058] 或上述的試劑盒中磁分離試劑在三聚氰胺定量檢測中的應用也是本發(fā)明保護的 范圍。
[0059] 將如下8種組分獨立包裝后再整體包裝為試劑盒，即為三聚氰胺定量檢測試劑 盒：1、校準品（含一系列濃度的MEL，用于建立標準曲線）；2、質控品（含一定濃度的MEL); 3、試劑A(含一定濃度的異硫氰酸熒光素標記的MEL抗體溶液）；4、試劑B(含一定濃度的 堿性磷酸酶標記的MEL抗原溶液）5、樣本稀釋液（lOmmol/L磷酸鹽（PBS)緩沖液，配方同 校準品緩沖液）；6、磁分離試劑（結合有抗異硫氰酸熒光素抗體的磁珠混懸液）；7、清洗液 (用于配制磁珠清洗液）；8、底物溶液。試劑盒中1、2、3、4、5、6、8為必備試劑。
[0060] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0061] 1、本發(fā)明中樣本處理方法簡單。樣本稀釋、提取等簡單處理后即可用于檢測，不需 過夜處理、過純化柱、吹干等復雜的過程；
[0062] 2、本發(fā)明利用磁珠子與化學發(fā)光技術相結合，提供了一種檢測范圍寬、靈敏度高、 精密度好、測值穩(wěn)定的定量檢測方法，操作簡單，檢測快速，可滿足快速、大量檢測樣本的需 求。
[0063] 本發(fā)明所采用的檢測方法是磁珠分離化學發(fā)光免疫檢測法，是酶標記技術，磁分 離技術和化學發(fā)光技術相結合，其操作方便、簡單，反應條件溫和，發(fā)光值穩(wěn)定且受外界條 件影響較小。相