一種甲狀腺球蛋白的磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及到食品安全相關(guān)的免疫分析檢測(cè)技術(shù)， 尤其設(shè)及一種甲狀腺球蛋白的磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，適用于人血清和血漿中 的甲狀腺球蛋白的定量檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]甲狀腺球蛋白燈hyroglobulin，Tg)，是甲狀腺濾泡上皮分泌的660ku糖蛋白，每 個(gè)Tg約有2個(gè)甲狀腺素?zé)?)和0.5個(gè)Ξ艦甲腺原氨酸燈3)分子，儲(chǔ)存在濾泡腔中。溶酶 體水解Tg表面T4、T3并使之釋放入血，同時(shí)少量的Tg也釋放入血，部分Tg經(jīng)甲狀腺淋己 管分泌入血。血循環(huán)中的Tg被肝臟的巨隧細(xì)胞清除。刺激Tg的分泌因素包括促甲狀腺素 (TSH)和膜島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l);抑制因子是丫-干擾素、α-腫瘤壞死因子和維甲 酸。
[0003] 甲狀腺球蛋白（TG)是分化型甲狀腺癌值TC)的標(biāo)志物。定期隨訪血清TG有助于 對(duì)DTC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的診斷、評(píng)價(jià)，W及監(jiān)測(cè)病人預(yù)后的治療效果。其它的良性甲狀腺病，如 甲亢、甲狀腺囊腫、橋本氏病等由于甲狀腺濾泡的破壞，致使其中膠質(zhì)內(nèi)的TG亦進(jìn)入到血 循環(huán)中，使血清TG水平增高。在先天性甲狀腺功能低下患者中，檢測(cè)甲狀腺球蛋白可鑒別 甲狀腺完全缺失、甲狀腺發(fā)育不全或其他病理狀況。另一方面，甲狀腺濾泡壁的損傷可導(dǎo)致 大量的甲狀腺球蛋白進(jìn)入血液，因此，甲狀腺球蛋白也被認(rèn)為是甲狀腺體形態(tài)完整性的特 殊標(biāo)志物。甲狀腺球蛋白測(cè)定也可用于鑒別亞急性甲狀腺炎和假的甲狀腺毒癥。
[0004] 目前測(cè)量TG的方法主要有放射免疫分析法巧ΙΑ)和免疫量度分析法（ΙΜΑ)兩大 類。ΙΜΑ包括免疫放射量度分析法（IRMA)、巧光免疫分析法（FIA)、發(fā)光免疫分析法（CLIA)、 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法巧化IA)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種甲狀腺球蛋白定量檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的試劑盒，為1)或2):
[0007] 1)包括異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液和堿性憐酸酶標(biāo)記 的甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液；
[0008] 所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液和所述堿性憐酸酶標(biāo) 記甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液的溶劑均為抗試劑緩沖液；
[0009] 所述抗試劑緩沖液按照如下方法制備：將溶液A、牛血清、馬血清、羊血清、防腐劑 混勻得到抗試劑緩沖液；
[0010] 所述溶液A由化\Mg2\Zn2\Trizmabase、動(dòng)物血清白蛋白和水組成；
[0011]2)包括所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體、所述堿性憐酸酶標(biāo) 記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體和所述抗試劑緩沖液。
[001引上述試劑盒中，
[0013] 所述動(dòng)物血清白蛋白為牛血清白蛋白，所述防腐劑為ProcLin-300 ;
[0014] 所述溶液A、所述牛血清、所述馬血清、所述羊血清、所述ProcLin-300的配比為 lOOOg：23-28ml：1. 5-2. 5ml：4. 〇-5. 0ml：0. 5-2. 0ml；
[001引所述溶液A中，所述化+濃度為0. 1-lmol/L，所述Mg2+的濃度為Immol/L，所述化2+ 的濃度為O.lmmol/L所述牛血清白蛋白的質(zhì)量百分含量為0.2-1. 0%，所述化izmabase 濃度為 0.01-0. 5mol/L。
[0016] 上述試劑盒中，
[0017] 所述抗試劑緩沖液中，所述溶液A、牛血清、馬血清、羊血清、ProcLin-300和水的 配比為lOOOg:25ml:2ml:4. 5ml:1. 0ml;
[0018]所述溶液A中，所述化+源于化Cl，所述化Cl濃度為0.Imol/L;
[001引 所述1邑2+源于MgCl2,所述MgClz濃度為1.Ommol/L;
[0020] 所述化2+源于化化2,所述化化2濃度為0.Immol/L;
[0021] 所述牛血清白蛋白的質(zhì)量百分含量為0.5% ;
[0022] 所述Trizmabase的濃度為 0.Imol/L。
[0023] 上述試劑盒中，
[0024] 所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液由異硫氯酸巧光素標(biāo) 記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體和所述抗試劑緩沖液組成，所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀 腺球蛋白單克隆抗體的濃度為0. 1-0. 5μg/mL;
[00巧]所述堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液由堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球 蛋白單克隆抗體和所述抗試劑緩沖液組成，所述堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球蛋白單克隆抗體 的濃度為0. 5-1μg/mL;
[0026] 所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體中的甲狀腺球蛋白單克隆 抗體和所述堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球蛋白單克隆抗體中甲狀腺球蛋白單克隆抗體不同。
[0027] 上述試劑盒還包括磁分離試劑；
[0028] 所述磁分離試劑為將抗異硫氯酸巧光素抗體共價(jià)連接在磁珠表面，得到磁分離試 劑；
[0029] 所述抗異硫氯酸巧光素抗體為多克隆抗體；
[0030] 所述抗異硫氯酸巧光素抗體和所述磁微粒的配比為30μg-200μg:lmg;
[0031] 所述磁微粒的直徑為0. 5-1. 5μm。
[0032] 上述試劑盒還包括校準(zhǔn)品；
[0033] 所述校準(zhǔn)品由η個(gè)不同濃度的校準(zhǔn)品溶液組成，所述校準(zhǔn)品溶液由甲狀腺球蛋白 抗原和校準(zhǔn)品緩沖液組成，且所述甲狀腺球蛋白抗原在所述校準(zhǔn)品中為不同濃度；
[0034] 所述校準(zhǔn)品緩沖液由化\蛋白類保護(hù)劑、防腐劑、Trizmabase、動(dòng)物血清和水組 成，所述化+濃度為0.l-lmol/l，所述蛋白類保護(hù)劑的質(zhì)量百分含量為0. 2-1. 0%，所述防 腐劑體積百分含量為0. 05-0. 2%，所述Trizmabase濃度為0. 01-0. 5mol/L所述動(dòng)物血清 的體積百分含量為0. 05-1. 0%。
[0035] 上述試劑盒中，
[0036] 所述化+源于化C1，所述化C1濃度為0.lOmol/L;
[0037] 所述蛋白類保護(hù)劑為牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白質(zhì)量百分含量為0. 5 % ;
[0038] 所述防腐劑為P;roclin-300,所述P;roclin-300體積百分含量為0. 1 % ;
[0039] 所述Trizmabase的濃度為 0.Imol/L;
[0040] 所述動(dòng)物血清為羊血清，所述羊血清體積百分含量為0. 2%。
[0041] 上述試劑盒中，
[0042] 所述校準(zhǔn)品由η個(gè)不同濃度的校準(zhǔn)品溶液組成，η小于等于6 ;所述校準(zhǔn)品為濃度 為0、10ng/mL50ng/mL150ng/血、300ng/mL750ng/血甲狀腺球蛋白抗原溶液。
[0043] 所述試劑盒還包括質(zhì)控品、樣本稀釋液、清洗液和底物溶液；
[0044] 所述質(zhì)控品為2個(gè)不同濃度的校準(zhǔn)品；所述質(zhì)控品為濃度為lOng/mL和30化g/mL 的校準(zhǔn)品。
[0045] 所述清洗液由吐溫-20、氯化鋼和濃度為0. 15M、抑為8. 0 + 0. 05的Tris-HCl緩沖 液組成，其中，所述吐溫-20的體積百分含量為0. 04%，所述氯化鋼的濃度為0. 25mol/L;
[0046] 所述底物溶液由二氨日丫晚和濃度為0. 25M、抑為8. 0 + 0. 05的Tris-HCl緩沖液組 成，其中，所述二氨日丫晚終濃度為0. 25mg/mL;
[0047] 所述樣本稀釋液由牛血清白蛋白、trizmabase和水組成，其中，所述牛血清白蛋 白的質(zhì)量百分含量為0. 2% -5%，所述trizmabase的濃度為0.Imol/L。
[004引本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述的試劑盒的方法。
[0049] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將上述試劑盒中8種組分均獨(dú)立包裝；再整體 包裝為試劑盒。
[0050] 上述的試劑盒在甲狀腺球蛋白定量檢測(cè)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0051] 或上述的試劑盒在制備甲狀腺球蛋白定量檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍；
[0052] 或上述的試劑盒中8種組分在制備甲狀腺球蛋白定量檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本 發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0053] 或一種待測(cè)樣本中甲狀腺球蛋白定量檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0054] 1)將上述的試劑盒中的校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣本分別與上述的試劑盒中的異硫 氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體溶液和堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球蛋白單克隆 抗體溶液混勻，反應(yīng)，得到免疫反應(yīng)產(chǎn)物；
[0055] 2)將所述免疫反應(yīng)產(chǎn)物與上述的試劑盒中的磁分離試劑混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn) 物，將所述反應(yīng)產(chǎn)物中的沉淀與磁珠清洗液混懸，收集沉淀，即為磁分離產(chǎn)物；
[0056] 3)將所述磁分離產(chǎn)物和上述的試劑盒中的底物溶液混勻，得到混合產(chǎn)物，用化學(xué) 發(fā)光儀檢測(cè)所述混合產(chǎn)物的發(fā)光強(qiáng)度，通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算待測(cè)樣本中全量程甲狀腺球蛋白 定量；
[0057] 所述磁珠清洗液為將上述的試劑盒中清洗液與水按1:7混勻，得到溶液；
[005引或上述的試劑盒中磁分離試劑在甲狀腺球蛋白定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0059] 所述抗試劑緩沖液的抑值為8. 0 ±0. 05。
[0060] 所述校準(zhǔn)品緩沖液的抑值為8. 0 + 0. 05。
[0061] 所述異硫氯酸巧光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體為用異硫氯酸巧光素標(biāo)記 甲狀腺球蛋白單克隆抗體A得到的產(chǎn)物；
[0062] 所述堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球蛋白單克隆抗體為用堿性憐酸酶標(biāo)記甲狀腺球蛋 白的單克隆抗體B得到的產(chǎn)物。
[0063] 本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法是磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)，酶標(biāo)記技術(shù)，磁分離 技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，其操作方便、簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，發(fā)光值穩(wěn)定且受外界條件 影響較小。相比于現(xiàn)有檢測(cè)方法，本發(fā)明具有樣本處理過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，檢測(cè)快速，測(cè) 試結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0064] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0065]1、使用磁微粒子為固相，使免疫