高靈敏度lspr生化感測套組及其應用方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Lsra生化感測套組及其應用方法。更特別地，本發(fā)明涉及一種利 用于進行LSPR分析時將裸金粒子修飾于待測物上，W增強LSPR訊號的方法。
【背景技術】
[0002] 局域表面等離子體共振（Xocalizedsurfaceplasmonresonance,LSPR)的原理 在于，當納米金屬粒子制作于透明基板上時，受到入射光的激發(fā)，將使得納米金屬粒子表面 產(chǎn)生表面等離子體共振，由于此共振的頻率與強度容易受到周遭環(huán)境的影響，而產(chǎn)生波長 的位移或者訊號強度的改變等，故可利用局部介電常數(shù)的變化來進行分析物的偵測。因此 只要有分析物鍵結(jié)在粒子附近，我們便可W通過光學儀器量到光學變化?？蒞想象，納米 粒子表面就像是微小型的探測器，在納米尺度的范圍之內(nèi)都可W量測到很高的光學變化訊 號。
[0003] 先前的研究已發(fā)現(xiàn)，當成對的納米粒子間距小于約2. 5粒子半徑時，會發(fā)生等離 子體偶合作用（plasmoniccoupling)而產(chǎn)生明顯的光譜位移（spectralshifts),請參見 Anker，J.N.等人，化UireMaterials7:442,2008。本身具有明確偶合特質(zhì)的Au-LSPR晶 片，已被應用于LSPR生化感測方法，其訊號產(chǎn)生基于吸光值與等離子體條帶波長的結(jié)合。 先前使用金納米結(jié)構的LSPR技術，在進行感測時光譜位移量僅有3nmW下，W致在提升偵 測靈敏度方面無法有效突破。先前雖曾有提出一種化ticalEnhancementSystem(0E巧， 在先前的量測抗原步驟，額外再進行抗原-抗體（此抗體表面有進行標定）的動作，通過標 定物與金納米結(jié)構進行較巨大的等離子體偶合效應，而使得位移量大大提升化等 人，Sensors9:2334, 2009)。然而，0ES技術本身必須利用到加上標定的次級抗體，所W已經(jīng) 失去原先LSPR所具有的不須標定（labe：L-化ee)的優(yōu)勢。
[0004] 本發(fā)明為解決上述LSPR生化感測方法的限制問題，于是提出一種在偵測方法進 行時通過添加裸金粒子，將其修飾于待測物上，W增強LSPR訊號的方法。本發(fā)明所研發(fā)的 方法能W低成本、短時間的分析過程及簡易制備的方式，來偵測低濃度的待測物，例如W偵 測帕金森氏癥的標記物抗-α-突觸核蛋白抗體（anti-a-synucleinantibody)為例，其 靈敏度可達到3. 8ng/mU且整體偵測過程僅需耗時約3小時。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 于是，本發(fā)明的一方面基于W上的目的，提供一種用于偵測低濃度待測物的高靈 敏度局域表面等離子體共振化SPR)生化感測套組，其包含一等離子體金屬納米結(jié)構基板， 包含一基材、包埋于該基材上的單層納米金屬粒子，及一修飾于該基材表面或該納米金屬 粒子上的接收器（rec巧tor);及一裸金粒子懸浮溶液，包含懸浮于一緩沖液中的裸金粒 子，其中該裸金粒子的粒徑介于5~lOOnm。
[000引在本發(fā)明的一些具體實施例，所述的緩沖液可包括PBS緩沖液或MES緩沖液等。在 本發(fā)明的一具體實施例，所述的緩沖液為0.ImMPBS緩沖液。
[0007] 在本發(fā)明的一些具體實施例，所述的基材為一光學玻璃（opticalglass)或高光 穿透性塑膠（hi曲transparen巧plastic)。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實施例，所述的納米金屬粒子選自金、銀、銅、笛及其合金納 米粒子。在本發(fā)明的一具體實施態(tài)，所述的納米金屬粒子為金納米粒子。
[0009] 在本發(fā)明的具體實施例，所述的裸金粒子指其表面上未經(jīng)任何化學分子修飾或官 能化的金粒子。所述的裸金粒子粒徑較佳為5~50nm，且最佳為lOnm。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實施例，所述的接收器（receptor)為一與該待測物相對應 的抗體或抗原。在本發(fā)明的一項具體實施例，所述的待測物為帕金森氏癥的生物標記物， 可為α-突觸核蛋白（a-synuclein)或抗-α-突觸核蛋白抗體（anti-a-synuclein antibody)。
[0011] 本發(fā)明的另一方面，關于一種用于偵測低濃度待測物的局域表面等離子體共振 化SPR)生化感測方法，包含：提供一納米等離子體晶片，其利用加熱法在基材上包埋單層 納米金屬粒子；在該納米等離子體晶片表面上修飾一接收器（receptor),該接收器為一與 待測物相對應的抗體或抗原；將待測物加入與該接收器進行結(jié)合，并同時滴加裸金粒子，使 裸金粒子修飾于待測物上；在400~800nm波長下偵測該待測物的LSH?訊號消光強度改變 量。
[0012] 在本發(fā)明的一項具體實施例，所述的待測物為帕金森氏癥的生物標記物。在本發(fā) 明的一項具體實施例，所述的待測物為α-突觸核蛋白（a-synuclein)。在本發(fā)明的一項 具體實施例，所述的待測物為抗-α-突觸核蛋白抗體（anti-a-synucleinantibody)。
[0013] 所述納米金屬粒子選自金、銀、銅、笛及其合金納米粒子。
[0014] 所述裸金粒子的粒徑介于5~50nm。
[0015] 所述裸金粒子的粒徑為lOnm。
[0016] 本發(fā)明的有益效果為：所提供的高靈敏度LSPR生化感測套組及其生化感測方法， 不需另外添加標記藥劑或是二次抗體，就能成功偵測低濃度或小分子待測物，可有效降低 高成本的花費；且偵測時間僅需3小時左右，相較于其他偵測方式可大幅地縮短偵測時間。
【附圖說明】
[0017] 圖1為納米金簇在金納米等離子體晶片上形成的示意圖。圖1A中金納米等離子 體晶片上所包埋的固態(tài)金納米粒子（AuN巧直接和待測物相對應的抗原or抗原（A)產(chǎn)生 鍵結(jié)，并于修飾分析物（D)時，同時滴加裸金粒子（Au-NPs)溶液，使其和待測物產(chǎn)生鍵結(jié)； 圖1B中修飾于待測物上的裸金粒子通過聚集作用（aggregation)而在等離子體晶片上形 成納米金簇（gold-nanoparticle-basedclusters),藉W增強LSPR訊號。
[0018] 圖2為顯示W(wǎng)陽-SEM觀察形成在金納米等離子體晶片上的納米金簇（圓圈處） 沈Μ圖。
[001引圖3為偵測1μg/mLIgG抗原的UV-Vis光譜圖。
[0020] 圖4為偵測抗-α-突觸核蛋白抗體的UV-Vis消光光譜圖，顯示使用本發(fā)明的 LSPR生化感測方法偵測不同濃度抗-α-突觸核蛋白抗體（lppm、0.Ippm及0. 0038ppm)的 消光強度改變量。
[0021] 圖5為W本發(fā)明的LSPR生化感測方法偵測PBS緩沖液、人類抗-IgG(lug/ml)及 抗-α-突觸核蛋白抗體（3.8ng/mL)的吸光值強度變化量。誤差值巧rrorbars)表示進 行Η重復實驗產(chǎn)生的標準偏差。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明的其他特色及優(yōu)點將于下列實施例中被進一步舉例與說明，而該實施例僅 作為輔助說明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 納米等離子體晶片基板的制備
[0024] 納米等離子體晶片基板可利用已知的方法制備得，包括（例如）激光、微波、微波 等離子體等加熱法。可用于制備本發(fā)明納米等離子體晶片基板的金屬膜包括金、銀、銅、笛 及其合金等。在本發(fā)明的一實施例，是利用微波等離子體當作加熱源，進行材料表面的處 理，而得到具有特殊金屬納米結(jié)構的等離子體晶片。其原理為金屬膜因受熱形成納米結(jié)構， 且由于受到微波與微波等離子體兩種作用下，使得進一步金屬納米結(jié)構與玻璃基板介面間 產(chǎn)生瞬間的高溫，因此在所制得的金屬納米結(jié)構基板中，形成的金屬納米顆粒的底部包覆 一層玻璃結(jié)構。
[0025] 作為本發(fā)明一具體實例的金納米等離子體晶片基板的制備方法簡述如下。首先， 在玻璃基板上瓣錐一層金薄膜，之后再放入微波等離子體內(nèi)處理，處理時間僅僅只需30 砂，之后便可W在該基板上形成金納米顆粒。本發(fā)明的金納米等離子體晶片基板上所形成 的金納米粒子大小約為9±3nm。
[0026] 在納米等離子體晶片基板表面修飾接收器（receptor)
[0027] 本發(fā)明所述的"接收器"意指與待測物相對應的抗原或抗體。在上述制得的金納 米等離子體晶片基板上，滴加40μL與待測物相對應的抗原或抗體溶液，并于室溫下靜置1 小時后，WIXPBS