專利名稱：用于診斷非小細(xì)胞肺癌的血清標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)特別是基因診斷領(lǐng)域，尤其是DKK-1蛋白在診斷癌癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是國際上癌癥死亡的主要原因[l]。目前我們主要是根據(jù)臨床病理特征對(duì)肺癌進(jìn)行分期[2]，但有時(shí)候這些臨床信息對(duì)預(yù)測(cè)病人的預(yù)后是不完全正確的或誤導(dǎo)的[3，4]。利用分子診斷方法可能提供更為準(zhǔn)確、客觀和系統(tǒng)的癌癥分期，然而，對(duì)于能夠預(yù)測(cè)大部分實(shí)體瘤的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)志物還未發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種潛在的具有預(yù)后意義的生物的和分子的參數(shù)，包括K-ras突變體、c-erbB過表達(dá)和p53突變體。 1998年，Glinka A等在《Nature》雜志上發(fā)表研究文章(Nature, 1998 ;391(6665):357-362)宣布他們?cè)诜侵拮?Xenopus laevis)胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的分泌性蛋白，命名為dickkopf-l (dkk-l)。他們的研究工作證實(shí)dkk-l是Wnt信號(hào)通路的抑制因子，是非洲爪蟾胚胎發(fā)育過程"頭部(head induction)"形成的"引發(fā)者(inducer)"。稍后，1999年Fedi P等(J Biol Chem， 1999 ;274(27) :19465-72)采用條件色譜分離方法和PCR方法，從人平滑肌肉瘤細(xì)胞SK-LMS-1及相應(yīng)cDNA文庫中，分離獲得了 dkk-1的人的同源基因，其mRNA轉(zhuǎn)錄本約為2kb，編碼266個(gè)氨基酸。從此，科學(xué)家通過近5年的研究，初步揭示了 DKK-1作為Wnt信號(hào)通路抑制因子的分子機(jī)制。 在研究DKK-1的功能和作用機(jī)制的過程中，科學(xué)家亦注意到DKK-1與某些人類疾病有關(guān)。如骨質(zhì)疏松癥(Biochem Biophys Res Commun， 2004 ;318 (1) :259-264.N Engl J Med， 2002 ;346(20) :1513-1521)、多發(fā)性骨髓瘤引發(fā)的骨損害(N Engl JMed，
2003 ;349(26) :2483-2494)以及某些人類惡性腫瘤，如Mikheev AM等(Carcinogenesis,
2004 ;25(1) :47-59)利用人子宮頸癌Hela細(xì)胞系建立了兩株非致瘤性的回復(fù)突變型(non-t咖origenic revertant)細(xì)胞系，并利用cDNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)DKK-1在上述兩株非致瘤性的回復(fù)突變型Hela細(xì)胞系中高表達(dá)，其研究發(fā)現(xiàn)DKK-1表達(dá)的缺失是Hela致瘤性所必需的，因此認(rèn)為DKK-1是一個(gè)候選腫瘤抑制基因;另外，Wirths O等(Lab Invest, 2003 ;83(3) :429-434)利用"抑制差減雜交技術(shù)(su卯ression subtractive hybridization即proach)"發(fā)現(xiàn)DKK-1在兒童肝母細(xì)胞瘤(h印atoblastoma)和Wilms'腫瘤中高表達(dá)，其結(jié)果表明32例兒童肝母細(xì)胞瘤中26例DKK-1高表達(dá)(26/32,81% ) 、6例Wilms'腫瘤中5例DKK-1高表達(dá)(5/6,83% )，而在20例肝癌病人中僅2例DKK-1高表達(dá)(2/20， 10% )、5株成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(medulloblastoma)細(xì)胞系中僅1例DKK-1高表達(dá)(1/5,20% )，在惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌中未檢測(cè)到DKK-1表達(dá)。 然而，現(xiàn)今對(duì)于DKK-1在各腫瘤中的表達(dá)機(jī)制并不完全清楚，需要更靈敏和更可靠的手段來對(duì)癌癥進(jìn)行檢測(cè)。盡管現(xiàn)代外科技術(shù)和輔助化放療水平已有很大提高，但肺癌仍然是所有惡性腫瘤中預(yù)后最差的一種癌癥。因此，現(xiàn)在急需發(fā)現(xiàn)一種新的、具有診斷意義
3的生物標(biāo)志物來對(duì)癌癥進(jìn)行早期診斷及為個(gè)體患者提供更好的輔助治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種診斷肺癌的有效方法。 在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了 DKK-1蛋白在制備肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌的診斷試劑或試劑盒中的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，DKK-1蛋白與標(biāo)記融合。優(yōu)選標(biāo)記選自生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。優(yōu)選標(biāo)記還選自可用于分離純化蛋白質(zhì)的標(biāo)記，例如各種能夠與層析柱結(jié)合的配體，從而能夠使得分離純化DKK-1的過程更加方便。優(yōu)選試劑或試劑盒還含有抗-DKK-1特異性抗體。 在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌的診斷試劑盒，該試劑盒含有容器，容器中含有DKK-1蛋白；以及標(biāo)簽，所述標(biāo)簽說明所述試劑盒用于診斷肺癌。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，DKK-1蛋白與標(biāo)記融合。優(yōu)選標(biāo)記選自生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。優(yōu)選標(biāo)記還選自可用于分離純化蛋白質(zhì)的標(biāo)記，例如各種能夠與層析柱結(jié)合的配體，從而能夠使得分離純化DKK-1的過程更加方便。優(yōu)選試劑或試劑盒還含有抗-DKK-1特異性抗體。 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了抗DKK-1自身抗體的抗體在制備肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌的診斷試劑或試劑盒中的用途。該抗體針對(duì)肺癌病人產(chǎn)生的自身抗體。


圖1顯示了蛋白表達(dá)與純化。A. DKK1-MBP融合蛋白.M :蛋白分子量標(biāo)志物；泳道l-5分別是，未加IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白，總細(xì)胞蛋白，IPTG誘導(dǎo)后的蛋白，誘導(dǎo)后細(xì)胞蛋白的上清，誘導(dǎo)后的包涵體蛋白，純化的蛋白。B. ECPKA蛋白.泳道1 :純化的ECPKA蛋白；M :蛋白分子量標(biāo)志物. 圖2.顯示了 DKK1-MBP融合蛋白免疫后所獲得的小鼠多克隆抗體的特異性。同一肺癌組織用不同抗體進(jìn)行western blot檢測(cè).泳道1_2分別是小鼠多克隆抗體和商品化的兔多克隆抗體。 圖3顯示了癌癥患者和正常對(duì)照血清中DKK1自身抗體ELISA值的滴度和ROC曲線。A:血清中DKK1自身抗體的滴度。通過ELISA方法檢測(cè)抗DKK1 IgG自身抗體，抗體滴度與正常對(duì)照血清的吸光度值相比，其值> 1. 38，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非小細(xì)胞肺癌組和對(duì)照組的DKK1自身抗體滴度值之間的差異據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05) 。 B :DKK1自身抗體ELISA值的ROC曲線。ROC曲線代表了DKK1自身抗體ELISA值的敏感度和特異性之間的相關(guān)性。DKK1自身抗體ELISA值的敏感度和特異性分別為62%和84% (AUC，O. 80)。
圖4顯示了肺癌病人和正常對(duì)照血清中抗DKK1自身抗體的Westernblotting。l，抗DKKl多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA) ， 2-5 :正常對(duì)照血清
(i : ioo稀釋)；6-9 :肺癌患者血清(i : ioo稀釋)。 圖5顯示了肺癌細(xì)胞株和肺癌組織中DKK1的表達(dá)。A :western blotting檢測(cè)5株肺癌細(xì)胞株中DKK1的表達(dá)，l，SPC-Al ;2，NCI-H446 ;3，A549 ;4，NCI_H460 ;5， NCI_H1299。B :非小細(xì)胞肺癌組織樣本中DKK1蛋白的表達(dá)。 圖6顯示了癌癥患者和正常對(duì)照血清中DKK1 ELISA值的滴度和R0C曲線。A :DKKl的血清滴度。DKK1滴度值與正常對(duì)照血清的平均吸光度值相比，其值〉1.55，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B:DKK1 ELISA值的ROC曲線。R0C曲線代表了 DKK1 ELISA值的敏感度和特異性之間的相關(guān)性。 圖7顯示了 在肺癌患者和正常對(duì)照血清中ECPKA自身抗體的滴度，通過ELISA方法檢測(cè)抗DKK1 IgG自身抗體?？贵w滴度值用它們各自的原始值與正常對(duì)照的原始平均值的比值表示?？贵w滴度與正常對(duì)照的吸光度值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人采用ELISA技術(shù)，通過比較肺癌患者和非肺癌患者的抗DKK-1自身抗體的血清水平，確定了抗DKK-1自身抗體能夠作為一種特異性非小細(xì)胞肺癌的診斷工具，并且為癌癥患者能針對(duì)其實(shí)體瘤中的抗原產(chǎn)生自身抗體又增加了一個(gè)理論依據(jù)。DKK-1過表達(dá)誘導(dǎo)了血清中產(chǎn)生大量的DKK-自身抗體，這些自身抗體的存在可以作為癌癥診斷的一個(gè)指標(biāo)。 因此，發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種試劑盒，利用DKK-1蛋白和標(biāo)記蛋白的融合產(chǎn)物來檢測(cè)血清中的抗-DKK-l自身抗體的存在。 如本文所用，術(shù)語"DKK-1"指非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的分泌性蛋白，命名為dickkopf-l (dkk-l)。該蛋白的序列可通過NCBI以登錄號(hào)NP571078找到。本發(fā)明所指的DKK-1蛋白包括其完整的氨基酸序列，其分泌蛋白，其突變體，以及其功能上活性的片段。需理解的是，當(dāng)編碼相同的氨基酸時(shí)，密碼子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產(chǎn)生的保守的氨基酸取代時(shí)，核苷酸的變換也是可被接受的。 在得到了 DKK-1的氨基酸片段的情況下，可根據(jù)其構(gòu)建出編碼它的核酸序列，并且根據(jù)核苷酸序列來設(shè)計(jì)特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。 —旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。 目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的DKK-1多肽。 一般來說有以下步驟 (1).用本發(fā)明的編碼人DKK-1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。 本發(fā)明中，DKK-1多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中?？傊?，只要能在宿主體 內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、 啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含DKK-1編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/ 翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù) 等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載 體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞等。 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)) 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。 在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié) 合。 本發(fā)明的抗-DKK-l自身抗體指的是病人對(duì)于過表達(dá)的DKK-1產(chǎn)生的自身抗體。這 種抗體是多克隆的。它可以與DKK-1蛋白反應(yīng)并結(jié)合，從而通過與DKK-1蛋白融合的標(biāo)記 被檢測(cè)。 本發(fā)明還包括對(duì)DKK-1DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單 克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于DKK-1基因產(chǎn)物或片段。 較佳地，指那些能與DKK-1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的 抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。 抗DKK-1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的DKK-1蛋白。
血樣或尿液中的DKK-1的直接測(cè)定可以作為腫瘤的輔助診斷和愈后的觀察指標(biāo)， 也可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)。 抗體可以通過ELISA、 Western印跡分析，或者與檢測(cè)基團(tuán)偶聯(lián)，通過化學(xué)發(fā)光、同 位素示蹤等方法來檢測(cè)。這些方法都是常規(guī)的免疫檢測(cè)方法。ELISA—般都先使用一抗或 其結(jié)合配體包被酶標(biāo)板，然后添加樣品，孵育適當(dāng)時(shí)間令其充分反應(yīng)，清洗去未結(jié)合的抗體 或其結(jié)合配體，然后添加合適的二抗。二抗可以是與標(biāo)記結(jié)合，一般常用的是辣根過氧化物 酶標(biāo)記。使用物種特異性的二抗能夠提高靈敏度，排除干擾。 本發(fā)明也包括試劑盒，以進(jìn)行這里描述的任何方法。在一個(gè)非限制的實(shí)例中，所述 試劑盒將以適當(dāng)?shù)娜萜餍问桨@些試劑中的一種或多種。所述試劑盒也可包含用于RNA 分離、擴(kuò)增細(xì)胞中RNA的純化的試劑、標(biāo)記等。 試劑盒的組分可以以水介質(zhì)的形式或以凍干的形式來包裝。試劑盒中適當(dāng)?shù)娜萜?br> 通常至少包括一種小瓶、試管、長頸瓶、寶特瓶、針筒或其它容器，其中可放置一種組分，并
且優(yōu)選地，可進(jìn)行適當(dāng)?shù)氐确?。在試劑盒中存在多于一種的組分時(shí)，試劑盒中通常也將包含
第二、第三或其它附加的容器，其中分離地放置附加的組分。然而，不同組合的組分可被包
含在一個(gè)小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常也將包括一種用于容納反應(yīng)物的容器，密封以用于
商業(yè)銷售。這種容器可包括注?；虼的５乃芰先萜?，其中可保留所需的小瓶。 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)
明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)
條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York :ColdSpring Harbor Laboratory
Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例1 1.材料和方法 1. 1細(xì)胞株和組織樣本 在本實(shí)施例中，采用人肺癌細(xì)胞株SPC-A1，NCI-H446，A549，NCI-H460(來自ATCC) 和NCI-H1299 (購自上海市胸科醫(yī)院)，所有細(xì)胞均呈單層生長，在最適培養(yǎng)基中加入10 % 胎牛血清(Hyclone公司)，培養(yǎng)條件5X C02，37。C。肺癌腫瘤和癌旁正常組織用來做 Western blot，這些標(biāo)本來自于上海交通大學(xué)附屬上海胸科醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的病人。肺癌 腫瘤樣本在采集前均獲得了患者的知情同意。本研究中所采用的臨床材料均獲得了公共機(jī) 構(gòu)道德委員會(huì)的許可。臨床分期是根據(jù)國際抗癌委員會(huì)TNM分期進(jìn)行的。
1. 2血清樣本 87例(57例女性、30例男性，年齡段為30-81，其平均年齡是62. 5)正常對(duì)照患者 和93例(61例男性，32例女性，年齡段為33-79，其平均年齡是60. 3)肺癌病人的血清樣本 在采集前均獲得了患者的知情同意，這些肺癌血清樣本來自于上海交通大學(xué)附屬上海胸科 醫(yī)院。這些肺癌患者血清包括53例腺癌，23例鱗狀細(xì)胞癌(SCCs)，5例腺鱗癌，8例支氣管 癌和4例大細(xì)胞癌。本研究中所采用的這些癌癥患者的血清樣本符合以下標(biāo)準(zhǔn)(a)均為 新診斷的肺癌患者且以前未經(jīng)過治療，(b)這些腫瘤的病理診斷均為肺癌I-IV期。血清樣本在診斷時(shí)采集，分裝(10ul/管)保存于-7(TC。這些血清樣本在使用時(shí)解凍且稀釋的血
清樣本不重復(fù)使用。 1. 3DKK1和ECPKA蛋白的純化 DKK1編碼序列通過RT-PCR獲得。弓|物分別為5'GGAATTCCATATGATGGCTCTGGGCGCAG 3，和5'CGGGATCCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGC3，(模板用的是肺癌組織cDNA)。獲得的DNA 片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel/BamHI雙酶切后插入經(jīng)Ndel/BamHI酶切后的載體pMalC2X(New England Biolabs， Inc. ， Ipswich, MA)，最后得到的質(zhì)粒為pMal-DKKl。 pMal-DKKl編碼 DKK1-MBP(MBP指的是麥芽糖結(jié)合蛋白，它的編碼序列在pMalC2X上)融合蛋白，可通過 BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)。DKKl重組蛋白通過Amylose Resin親和柱子(New England Biolabs， Inc. ， Ipswich, MA)純化，并通過SDS-PAGE檢測(cè)(圖1A)。 ECPKA (細(xì)胞外蛋白激酶A)編碼序列也是通過RT-PCR獲得(肺癌組織cDNA)。弓| 物為5' catatgggcaacgccgccgccgc 3'禾P 5' GGATCCTAAAACTCAGAAAACTCCTTGCCAC3'。獲 得的DNA片段先插入簡單載體pGEM-T(Promega， USA)并用限制性內(nèi)切酶Ndel/BamHI雙酶 切，后將獲得的ECPKA編碼片段插入經(jīng)Ndel/BamHI雙酶切的載體pET_28a(+) (Novagen， Wi scons in ， USA) 。 ECPKA在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。ECPKA蛋白通過Ni-NTA His-Bind resin 柱子(GE Healthcare UK Ltd.)純化禾口 SDS-PAGE(圖IB)檢測(cè)。 從圖1中可見，通過原核表達(dá)，獲得了 DKKl-MBP融合蛋白和ECPKA蛋白，分子量分 別為70KD和41KD(見圖1)。
實(shí)施例2 由于無法獲得商品化的DKK1重組蛋白，我們采用了上述實(shí)施例1中純化表達(dá)的重 組DKK1融合蛋白DKK1-MBP來檢測(cè)血清樣本中的DKK1自身抗體。血清中的抗DKK1 IgG自身 抗體通過ELISA方法檢測(cè)。純化的重組人DKK1融合蛋白DKK1-MBP作為抗原包被96孔板， 100 ill/孑L (lmg/mL，PBS稀釋)，4。C孵育過夜。用洗脫液(0. 01M PBS，0.1% tween-20，PH 7.4)洗去未結(jié)合的抗原，5%脫脂奶粉(光明奶粉有限公司)，100iU/孔，室溫封閉2h。為 除去血清中可能存在的抗麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的抗體，100iU稀釋的血清樣本(1 : 400 稀釋，稀釋液0. OIMPBS， pH 7.4，5% nonfat dry milk，0. 5% Tween 20)預(yù)先加入MBP 室溫孵育30min，然后加入血清樣本，37°C ， lh ;用洗脫液(0. 01M PBS， 0. 1 % tween-20， 7. 4)洗3遍，然后加入100iil/孔(1 : 3000稀釋，稀釋液0. 01M PBS，pH 7. 4，5%脫脂牛 奶，O. 5%Tween 20)抗人IgG-HRP (Proteintech group, inc， USA) 二抗，室溫孵育2h;用洗 脫液洗5遍，然后加入100 ii 1/孔ABTS (2， 2'-吖嗪-二 - (3-乙基苯并噻唑啉磺酸)底物 顯色液(ImM ABTS，29mM無水?dāng)Q檬酸，41mM磷酸二氫鈉，PH 4. 2， 0. 03% H202) ， 37°C ， 15min。 最后在ELISA讀數(shù)儀(微量滴定板讀數(shù)儀基準(zhǔn)；Bio-Rad， ) 410nm波長處讀取吸光度值。
血清DKKl水平也通過ELISA方法檢測(cè)。首先，商品化的特異性針對(duì)人DKK1的兔抗 多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)l : 100稀釋包被96孔板，4°C 孵育過夜。然后洗去未結(jié)合的抗體，封閉液(0.01M PBS，pH 7.4，5%脫脂牛奶，0. 5%TWeen 20) 100iil/孔，37。C，lh ;倒掉封閉液，血清樣本以1 : 50稀釋，100iil/孔，37。C，lh ;洗去 未結(jié)合的物質(zhì)，加入鼠多克隆抗體(1 : 50稀釋)，該抗體特異性針對(duì)重組DKK1融合蛋白 (圖2驗(yàn)證了該特異性的抗體)，100 1/孔，37°C ， lh ;洗去未結(jié)合的抗體_酶復(fù)合物，加入 羊抗鼠IgG-HRP第二抗體(1 : 1000稀釋)，100iil/孔，37t:，lh ;洗脫液洗5遍后，加入ABTS底物顯色液，37°C ， 15min，后用ELISA讀數(shù)儀在410nm波長處讀取吸光度值。
通過Western Blot分析，我們發(fā)現(xiàn)鼠多抗和商品化的兔抗DKK1多抗一樣，都能用 來Western Blot檢測(cè)DKK1-MBP融合蛋白。
實(shí)施例3 上述的腫瘤組織和細(xì)胞株用裂解液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0) ， 150mmol/ L NaCl，O. 5% NP40，0.5X脫氧膽酸鈉)和蛋白酶抑制混合劑(Pierce)裂解。裂解產(chǎn)物 的蛋白濃度用BCA檢測(cè)試劑盒(Pierce, USA)檢測(cè)，同時(shí)用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用12% 變性聚丙烯酰胺凝膠(4%的聚丙烯酰胺濃縮膠)，30 g/泳道，電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜 (Bio-Rad)。 5%脫脂奶粉(PBS-Tween 20稀釋)封閉，然后用商品化的兔抗人多克隆抗體 DKKl(hDKKl ;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)4。C孵育過夜。后用HRP-結(jié)合 的二抗室溫孵育lh。 PBST洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce, USA)反應(yīng)。
結(jié)果顯示35-KDa DKK1蛋白在4株細(xì)胞中是過表達(dá)的(圖5A)，但Western blot 分析臨床樣本或癌旁正常組織或兩者時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)DKK1表達(dá)水平在這些組織中有明顯差 別(圖5B)。雖然有研究報(bào)道，DKK1在肺癌、食管癌、腎母細(xì)胞瘤、肝母細(xì)胞瘤、HCC和多發(fā) 性骨髓瘤中均呈高表達(dá)。誘導(dǎo)外源性DKK1的表達(dá)可提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲 活性。但在本研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)肺癌組織中DKK1的表達(dá)高于其癌旁正常組織。本研究 與其它研究結(jié)果的差異可能是由于組織樣本采集位置不同所致。因此，現(xiàn)有技術(shù)中的這種 觀點(diǎn)并不是完全可靠的。
實(shí)施例4 用實(shí)施例1制備的純化的重組人DKK1融合蛋白(100ng/泳道)，10% SDS-PAGE，電 泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，膜經(jīng)過封閉、洗脫后各條帶用上述肺癌病人或者正常人血清稀釋 液(l : IOO稀釋)孵育，但在孵育血清樣本前用MBP(稀釋于5X脫脂奶粉(PBST稀釋))， PBST洗3遍，抗人IgG-HRP孵育，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce公司)反應(yīng)。
采用ELISA方法檢測(cè)了 93例肺癌患者和87例正常對(duì)照血清樣本中的抗DKK1自 身抗體水平，如圖3A所示，抗DKK1自身抗體的滴度顯著高于正常對(duì)照的平均水平。93例肺 癌患者血清中抗DKK1自身抗體平均值為1.57±0. 53(F1 SD)。相反，87例正常對(duì)照患者血 清中DKK1平均水平值僅為1士0.42(F1 SD);正常對(duì)照和非小細(xì)胞肺癌患者之間具有顯著 的差異(P < 0. 001 (Mann-Whitney U test)，應(yīng)用ROC曲線(圖3B) 93例肺癌患者和87例 正常對(duì)照的資料(圖3A)，基線的設(shè)置是為了提供最適的DKK1自身抗體診斷準(zhǔn)確性和可能 的比值(最小的假陰性和錯(cuò)誤的假陰性)[62% (57/93)的敏感度和84% (74/87)的特異 性]。 血清中DKK1自身抗體的免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果見圖4。選擇DKK1自身抗體水平較高的 患者血清與純化的DKK1融合蛋白進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)(圖4， 6-9)，正常對(duì)照血清與DKK1蛋 白沒有免疫交叉反應(yīng)(圖2， 2-5)。從圖4我們可以看出條帶(6-9)的分子大小與陽性對(duì)照 大小一致(1)。 本實(shí)驗(yàn)證明患者血清中存在DKK1的自身抗體，而正常人血清中沒有DKK1的自身 抗體。陽性對(duì)照所用的抗體是用兔多克隆抗DKK1抗體(Santa Crutz公司)，作為實(shí)驗(yàn)過程 的陽性對(duì)照。 也檢測(cè)了自身抗體DKK1水平與癌癥分期的關(guān)系，但并未發(fā)現(xiàn)它在NSCLC患者的4個(gè)分期中有明顯的差異。在NSCLC患者中，DKK1自身抗體診斷的敏感性從I到IV期分別 為64.3% (18/28) ，70% (7/10) ，57. 4% (27/47)和62. 5% (5/8)。 上述結(jié)果提示了循環(huán)系統(tǒng)中DKK1自身抗體的檢測(cè)可能作為一種潛在的有價(jià)值的
非侵襲性標(biāo)志物來輔助診斷肺癌。在腫瘤發(fā)生過程中，DKK1蛋白作為一種抗原可以激發(fā)大
量自身抗體的產(chǎn)生，這有利于我們對(duì)正常個(gè)體和肺癌病人進(jìn)行初步篩查。 在早期NSCLC(I期)中有64. 3%的患者其DKK1自身抗體水平的升高提示其可能
對(duì)NSCLC患者的早期診斷是非常重要的。 實(shí)施例5 為驗(yàn)證在血清樣本中DKK1和DKK1自身抗體水平是否有差異，我們采用上述實(shí)施 例3的ELISA方法從48例NSCLC和35例正常對(duì)照血清中檢測(cè)了 DKK1水平。結(jié)果如圖(圖 6A)所示，NSCLC患者的DKK1平均水平高于正常對(duì)照。48例肺癌患者血清中DKK1平均水 平為3. 568±0. 4926 (Fl SD)，相反，35例正常對(duì)照血清中DKK1的平均值僅為1±0. 1016 (Fl SD) 。NSCLC患者和正常對(duì)照血清中的DKK1水平有顯著性的差異(P < 0. 0001，Mann-Whitney U test)。應(yīng)用ROC曲線引出48例癌癥患者和35例正常對(duì)照的資料(圖6B)，基線的設(shè)置是 為了提供合適的診斷DKK1的準(zhǔn)確性和可能的比值(最小的假陰性和錯(cuò)誤的假陰性)[62. % (30/48)的敏感度和82.86% (29/35)的特異性]。 DKK1水平升高的患者中僅有53.3X (16/30)的病人同時(shí)有DKK1自身抗體的升 高。由于DKK1和它的自身抗體在血清中并不一定是同時(shí)升高的，因此，將兩者結(jié)合起來診 斷癌癥患者和正常對(duì)照。結(jié)合DKKl和它的自身抗體后使用同樣的基線時(shí)，檢測(cè)的敏感度可 提高至81. 25% ，而特異度仍保持在82. 86% 。
實(shí)施例6 采用實(shí)施例5相同的方法，使用實(shí)施例1中所述的ECPKA融合蛋白檢測(cè)了 NSCLC患 者中ECPKA自身抗體的水平。結(jié)果如圖7所示。在NSCLC患者血清中ECPKA自身抗體的平 均水平也高于正常對(duì)照的平均水平，但與DKK1自身抗體相比，ECPKA自身抗體在區(qū)別NSCLC 患者和正常對(duì)照時(shí)其敏感度和特異性較低。 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
10
權(quán)利要求
DKK-1蛋白在制備肺癌診斷試劑或試劑盒中的用途。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述DKK-1蛋白與標(biāo)記融合。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述標(biāo)記選自生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光 團(tuán)、同位素或酶。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述試劑或試劑盒還含有抗-DKK-1特異性 抗體。
6. —種肺癌診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有容器，所述容器中含有DKK-1蛋 白；以及標(biāo)簽，所述標(biāo)簽說明所述試劑盒用于診斷肺癌。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌。
8. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述DKK-1蛋白與標(biāo)記融合。
9. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記選自生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒 光團(tuán)、同位素或酶。
10. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有抗-DKK-1特異性抗體。
全文摘要
公開了DKK-1蛋白在制備肺癌診斷試劑或試劑盒中的用途。還公開了一種肺癌診斷試劑盒，含有容器，所述容器中含有DKK-1蛋白；以及標(biāo)簽說明所述試劑盒用于診斷肺癌的標(biāo)簽。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101762708SQ200810207819
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者李宗海, 王華茂, 石必枝, 蔣華, 顧健人 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所