一種測定細胞dna損傷標志物*h2ax含量的酶聯(lián)免疫測定方法
【專利摘要】一種測定細胞DNA損傷標志物?H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于：是采用一種特異性H2AX抗體及酶標二抗對目標蛋白H2AX特異性夾心識別，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛袩晒猱a(chǎn)物，可根據(jù)底物的熒光值實現(xiàn)對H2AX定量測定的方法。并利用該方法定量檢測出由于卷煙煙氣暴露而導(dǎo)致的細胞中H2AX的含量變化，從而達到評價卷煙煙氣基因毒性的目的。與傳統(tǒng)有機染料相比，酶標抗體具有以下優(yōu)勢：酶的催化頻率高,能放大反應(yīng)效果，提高檢測靈敏度；酶在室溫下性質(zhì)穩(wěn)定且價格便宜，適于大量分析。酶聯(lián)免疫分析方法具有快速、準確、高通量、高靈敏等優(yōu)點。
【專利說明】—種測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞DNA損傷標志物磷酸化組蛋白(H2AX)的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，并將其用于卷煙煙氣的基因毒性評估，具體是一種測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA損傷有許多不同的形式，其中DNA雙鏈斷裂被認為是DNA最嚴重的損傷。當細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂后，組蛋白H2AX的絲氨酸殘基可以被毛細血管共濟失調(diào)突變基因(ATM)和DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)等磷酸化，形成 H2AX。 H2AX的形成與雙鏈斷裂數(shù)量成正比，從而使 H2AX成為DNA雙鏈斷裂的重要的特異性生物標志物。近年來，有大量文獻開展了卷煙煙氣導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的研究。Albino等使用 H2AX來評價卷煙煙氣對人類A549肺癌細胞和正常的人支氣管上皮細胞基因毒性，發(fā)現(xiàn)呈劑量效應(yīng)關(guān)系，進一步研究表明H2AX與焦油含量正相關(guān)，而與卷煙類型和吸煙行為無關(guān)。Toyooka等研究證實卷煙主流和側(cè)流煙氣暴露于人類A549肺癌細胞，H2AX呈劑量效應(yīng)關(guān)系且與時間正相關(guān)。
[0003]目前H2AX的檢測方法主要有免疫熒光法、流式細胞技術(shù)和高內(nèi)涵細胞成像技術(shù)。這些技術(shù)所需儀器昂貴，都是利用 H2AX的特異性抗體和熒光分子標記的二抗實現(xiàn)對目標物定量測定的，所用的熒光分子均為傳統(tǒng)有機染料。本實驗所采用的二抗為酶標抗體，目前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物(HRP )、堿性磷酸酶(AP )等酶標記的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是基于現(xiàn)有技術(shù)狀況而開發(fā)的細胞中DNA損傷標志物一 H2AX蛋白的酶聯(lián)免疫檢測方法，并利用該方法定量檢測出由于卷煙煙氣暴露而導(dǎo)致的細胞中 H2AX的含量變化，從而達到評價卷煙煙氣基因毒性的目的。該檢測方法具有快速、準確、高通量、高靈敏等特點。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下具體步驟實現(xiàn)的:一種測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，是采用一種特異性 H2AX抗體及酶標二抗對目標蛋白H2AX特異性夾心識別，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛袩晒猱a(chǎn)物，可根據(jù)底物的熒光值實現(xiàn)對H2AX定量測定的方法，具體步驟如下:
1)實驗試劑的配制，包括以下實驗試劑:(I)細胞培養(yǎng)基，(2)4%多聚甲醛溶液，(3)PBS-T緩沖液，(4)細胞膜通透液，(5)封閉劑，(6)混合一抗溶液，(7)混合二抗溶液，(8)底物A，(9)底物B ;
2)細胞培養(yǎng):人肺癌細胞A549細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至匯合率為70%-80%時，用0.25%胰蛋白酶消化法進行細胞接種，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細胞懸液，最終細胞接種密度為5000個/孔，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ；
3)卷煙煙氣粒相物萃取液及氣相物吸收液的制備:卷煙樣品于溫度(22±1) °C和相對濕度60%±3%條件下平衡48 h ;然后使用轉(zhuǎn)盤式吸煙機在ISO抽吸條件下抽吸卷煙，煙氣總粒相物用劍橋濾片收集，根據(jù)煙氣總粒相物質(zhì)量加入相應(yīng)體積的DMSO溶劑，得到最終濃度為10 mg/ml的煙氣粒相物萃取液，使用前在一 70 °C以下儲存；在收集煙氣總粒相物的同時將氣相物通入裝有PBS溶液的吸收瓶中，粒相物收集完畢后，將PBS吸收液定容至與粒相物萃取液中DMSO體積相同，通過0.2 μπι的濾膜除菌后，得到最終濃度與粒相物萃取液相當?shù)臒煔鈿庀辔镂找?，且必須在制備后半小時內(nèi)使用。
[0006]4)卷煙煙氣染毒:使用細胞培養(yǎng)基將煙氣粒相物萃取液或煙氣氣相物吸收液調(diào)整到不同濃度，設(shè)置7個非零濃度，細胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，分別設(shè)置7個不同濃度的煙氣粒相物或煙氣氣相物染毒組和一個空白對照組，每組6個平行樣孔，煙氣粒相物染毒組每孔加入100 μ I不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液，煙氣氣相物染毒組每孔加入100 μ I不同濃度梯度的煙氣氣相物吸收液，空白對照每孔加入100 μ I稀釋培養(yǎng)液，于37°C、5% C02條件下培養(yǎng)24 h ；
5)基于酶聯(lián)免疫方法對細胞中 H2AX定量測定:(I)細胞固定:細胞染毒24 h后，小心移去培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌兩次，每次至少5 min,以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μ I的4%多聚甲醛固定細胞15 min ；⑵固定好的A549細胞用PBS-T洗滌2次，每孔加入100 μ I通透液室溫孵育15 min ； (3) PBS-T洗滌3次，滴加2% BSA封閉液37 °C濕盒中孵育I h ; (4)加入100 μ I含有兔抗總Η2ΑΧ抗體和小鼠抗 Η2ΑΧ抗體，在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中孵育2小時或4 °C過夜；(5) PBS-T洗滌3次，加入HRP標記驢抗鼠和AP標記的羊抗兔混合二抗溶液，在37 °〇恒溫培育I小時；(6) PBS-T洗滌3次，向微孔板中加入75 μ I的辣根酶底物Α，孵育50 min,再加入75 μ I的堿性磷酸酶底物B，孵育30 min后經(jīng)熒光酶標儀(540 nm處激發(fā),在600 nm處檢測和360 nm處激發(fā),在450 nm處檢測)測定突光強度值。
[0007]6)數(shù)據(jù)處理:試驗中設(shè)置空白對照組，即不加入一抗抗體，僅加入酶標記的二抗抗體，所檢測信號即為由非特異性吸附引起的空白信號；本實驗在檢測目標物H2AX的同時，對細胞中總H2AX(不區(qū)分磷酸化標記)也進行了定量測定，根據(jù)目標物 H2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值來確定H2AX的磷酸化程度。
[0008]在本發(fā)明中，步驟I)中各實驗試劑的具體配制方法如下:
(1）細胞培養(yǎng)基:溶劑為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ；
(2)4%多聚甲醛溶液:40 g多聚甲醛、2.965 g磷酸二氫鈉、29 g磷酸二氫鈉和1000ml蒸餾水放入燒杯中，在磁力攪拌器上加熱60 V振蕩24 h ；
(3)PBS-T緩沖液:0.2 g磷酸二氫鉀，2.9 g磷酸氫二鈉，8.0 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，0.5 ml吐溫20，加水至1000 ml ；
(4)細胞膜通透液:0.5% Triton X-100 的配制:取0.5 ml Triton X-100，加入至99.5ml的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，混合后置37 °C~40 1:水使其充分溶解混勻；
(5)封閉劑:2%牛血清白蛋白(BSA)溶液的配制:取2gBSAffi0.01 mol/1 PBS (pH7.4)溶解，定容至100 ml ； (6)混合一抗溶液:使用前取適量小鼠抗H2AX抗體和兔抗總H2AX抗體混合，用封閉劑稀釋至所需濃度；
(7)混合二抗溶液:使用前取適量HRP標記驢抗鼠和AP標記的羊抗兔混合二抗溶液混合，用封閉劑稀釋至所需濃度；
(8)底物A:取0.1M的Tris-HCl (PH=8.6)的緩沖液10 ml，加入0.0011 g魯米諾，0.0008 g對碘苯酚為溶液Al ;取0.1 M的Tris -HCl (PH=8.6)的緩沖液10 ml，加入2.6ul30%的H2O2,為溶液A2 ;使用前溶液Al和溶液A2各取75 ul混勻使用。所述0.1 M的Tris-HCl (pH=8.6)的緩沖液是通過以下方法制備:先制備0.1 M的三羥甲基甲烷(Tris)溶液，再利用高濃度鹽酸將PH調(diào)節(jié)至8.6。
[0009](9)底物B:用二乙醇胺(DEA)緩沖液配制0.0125 mmol/1的4-甲基傘花基磷酸鈉(4-MUP)溶液。所述二乙醇胺(DEA)緩沖液的制備方法為:二乙醇胺97ml，蒸餾水800ml，混合，用濃HCl調(diào)pH=9.8，加水至IOOOml ;或通過市場購買。
[0010]本發(fā)明中，對特異性抗體使用濃度進行了優(yōu)化:酶聯(lián)免疫法對細胞中H2AX測定的靈敏度取決于特異性識別的一抗與目標物分子的結(jié)合量，其間接影響酶標記的二抗分子對目標分子的特異性識別。為提高檢測靈敏度，分別對實驗中小鼠抗H2AX抗體和HRP酶標記的驢抗鼠抗體進行了優(yōu)化。圖2A所示為使用不同濃度的小鼠抗H2AX抗體和相同濃度的HRP酶標記的驢抗鼠抗體對相同目標物分析時，在熒光酶標儀上測定的熒光強度值。由圖2A可知，當小鼠抗H2AX抗體稀釋濃度為0.6-1.0 μ g/ml時，發(fā)射波長450 nm處測定的突光強度最大。因此本實驗中選擇小鼠抗H2AX抗體的最佳濃度為0.6-1.0 μ g/ml。圖2B所示為使用相同濃度的小鼠抗H2AX抗體和不同濃度的HRP酶標記的驢抗鼠抗體對相同目標物分析時，在熒光酶標儀上測定的熒光強度值。由圖2B可知，當HRP酶標記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為4-6 μ g/ml時，發(fā)射波長450 nm處測定的熒光強度最大。因此本發(fā)明中HRP酶標記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為4-6 μ g/ml ο
[0011]本發(fā)明中，為了消除各檢測孔中由細胞個數(shù)差異引起的信號偏差，使用了 H2AX特異性抗體和能識別總H2AX蛋白的抗體作為識別一抗，然后采用不同激發(fā)波長酶標記的特異性二抗對一抗識別，根據(jù)目標物 H2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值和煙氣染毒濃度繪制效應(yīng)——劑量曲線，從而實現(xiàn)目標物 H2AX的準確定量。圖3A為對卷煙樣品3R4F煙氣冷凝物對細胞染毒12小時后檢測細胞中H2AX得到的熒光信號。由圖3A可知，煙氣冷凝物染毒后細胞中 H2AX對應(yīng)的熒光檢測信號隨著煙氣冷凝物染毒濃度的增加而逐漸增大，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。圖3B為根據(jù)目標物H2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值和煙氣染毒濃度繪制的效應(yīng)——劑量曲線。有圖3B可知，通過測定細胞中總H2AX的熒光信號可消除各檢測孔中由細胞個數(shù)差異引起的信號偏差，減小平行樣本熒光檢測信號的偏差，從而實現(xiàn)目標物 H2AX的準確定量。
[0012]本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有 H2AX免疫測定方法的不足，采用酶標二抗，提高了檢測靈敏度。細胞接種在96孔板中，煙氣染毒后通過細胞固定和通透可實現(xiàn)細胞樣本的直接、高通量檢測，省去了蛋白質(zhì)提取步驟。通過測定細胞中總H2AX的熒光信號可消除各檢測孔中由細胞個數(shù)差異引起的信號偏差，減小平行樣本熒光檢測信號的偏差，從而實現(xiàn)目標物 H2AX的準確定量。與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下特點和優(yōu)勢:
I)高通量:本發(fā)明方法將常用的96孔微孔板應(yīng)用于細胞DNA損傷標志物 H2AX的測定中，可同時實現(xiàn)96孔中細胞DNA損傷標志物 H2AX的定量測定，具有快速、高通量的優(yōu)勢。
[0013]2)靈敏度高:對相同樣品的測定中，利用酶標記抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機染料標記抗體，由于酶催化頻率高，可放大反應(yīng)效果，提高檢測靈敏度。
[0014]3)定量準確:本方法中，將目標物 H2AX與總H2AX的熒光信號的比值和化合物染毒濃度繪制劑量效應(yīng)曲線。通過測定細胞中總H2AX的熒光信號可消除各檢測孔中由細胞個數(shù)差異引起的信號偏差。更準確的反映出細胞DNA的損傷程度，減小平行樣本熒光檢測信號的偏差，提高方法重現(xiàn)性。
[0015]本發(fā)明所用的酶標抗體與目前所用的傳統(tǒng)有機染料標記的抗體相比，具有以下優(yōu)勢:酶的催化頻率高，能放大反應(yīng)效果，提高檢測靈敏度；酶在室溫下性質(zhì)穩(wěn)定且價格便宜，適于大量分析。酶聯(lián)免疫分析方法具有快速、準確、高通量、高靈敏等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.本發(fā)明實驗方法原理圖。
[0017]圖2.小鼠抗 H2AX抗體、其對應(yīng)的HRP酶標記驢抗鼠抗體使用濃度與熒光強度的關(guān)系坐標曲線圖，其中:(A)使用不同稀釋比的小鼠抗 H2AX抗體所得到的熒光強度；(B)使用不同稀釋比的HRP酶標記驢抗鼠抗體所得到的熒光強度。
[0018]圖3.煙氣粒相物染毒濃度與熒光檢測信號之間的劑量-效應(yīng)曲線圖，其中:(A)煙氣粒相物染毒濃度和目標物H2AX熒光檢測信號繪制的劑量效應(yīng)曲線；(B)煙氣粒相物染毒濃度和目標物 H2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值繪制的劑量效應(yīng)曲線。
[0019]圖4.卷煙樣品A的煙氣氣相物和煙氣粒相物染毒濃度與細胞中H2AX測定的相對熒光強度的劑量效應(yīng)曲線。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明以下結(jié)合實施例做進一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0021]實例1:
為考察卷煙樣品A的煙氣粒相冷凝物與氣相冷凝物對細胞DNA損傷的影響差異，采用轉(zhuǎn)盤式20H型吸煙機(德國，Borgwaldt公司)對20支卷煙樣品進行抽吸，抽吸模式參照ISO的要求。劍橋濾片共捕集到煙氣粒相物178 mg。加入17.8 mL的DMSO溶液，置于振蕩器上萃取30分鐘。將萃取液通過0.22 μ m的濾膜除菌后得到10 mg/mL的煙氣總粒相物萃取液。在收集煙氣總粒相物的同時將氣相物通入裝有PBS溶液的吸收瓶中，收集完畢后，將PBS吸收液定容至與粒相物萃取液中DMSO體積相同，通過0.22 μ m的濾膜除菌后，得到相應(yīng)的煙氣氣相物吸收液。用細胞培養(yǎng)液稀釋煙氣總粒相物萃取液和煙氣氣相物吸收液，分別配不同濃度的染毒溶液對A549細胞進行染毒，染毒濃度均為10、25、50、75、100、150、200μ g/mL。然后用基于酶聯(lián)免疫方法測定細胞中H2AX和總H2AX的含量。試驗中設(shè)置空白對照組，即不加入一抗抗體，僅加入二抗抗體，所檢測信號即為由非特異性吸附引起的空白信號。所有樣品測試孔的檢測信號應(yīng)扣除空白信號。最后，根據(jù)目標物 H2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值和染毒濃度繪制劑量效應(yīng)曲線，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，細胞中H2AX的含量隨著煙氣冷凝物萃取液濃度的升高而增大，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。粒相冷凝物暴露下細胞中 H2AX的含量明顯高于同濃度氣相冷凝物暴露下的細胞，且粒相冷凝物暴露下細胞中H2AX的含量隨萃取液濃度升高的增長趨勢更顯著。因此，煙氣粒相冷凝物對細胞DNA損傷的影響大于氣相冷凝物。
【權(quán)利要求】
1.一種測定細胞DNA損傷標志物 H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于:是采用一種特異性 H2AX抗體及酶標二抗對目標蛋白H2AX特異性夾心識別，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)闊晒猱a(chǎn)物，可根據(jù)產(chǎn)物的熒光值實現(xiàn)對H2AX定量測定的方法，具體步驟如下: O實驗試劑的配制，包括以下實驗試劑:(I)細胞培養(yǎng)基，(2) 4%多聚甲醛溶液，(3)PBS-T緩沖液，(4)細胞膜通透液，(5)封閉劑，(6)混合一抗溶液，(7)混合二抗溶液，(8)底物A，(9)底物B ; 2)細胞培養(yǎng):人肺癌細胞A549細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至匯合率為70%-80%時，用0.25%胰蛋白酶消化法進行細胞接種，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細胞懸液，最終細胞接種密度為5000個/孔，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ； 3)卷煙煙氣粒相物萃取液及氣相物吸收液的制備:制備最終濃度為10mg/ml的煙氣粒相物萃取液，和與其濃度相當?shù)臒煔鈿庀辔镂找海? 4)卷煙煙氣染毒:使用細胞培養(yǎng)基將煙氣粒相物萃取液或煙氣氣相物吸收液調(diào)整到不同濃度，設(shè)置7個非零濃度，細胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，分別設(shè)置7個不同濃度的煙氣粒相物或煙氣氣相物染毒組和一個空白對照組，每組6個平行樣孔，煙氣粒相物染毒組每孔加入100 μ I不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液，煙氣氣相物染毒組每孔加入100 μ I不同濃度梯度的煙氣氣相物吸收液，空白對照每孔加入100 μ I稀釋培養(yǎng)液，于37 °C、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h ； 5)基于酶聯(lián)免疫方法對細胞中H2AX定量測定:(I)細胞固定:細胞染毒24 h后，小心移去培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌兩次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μ I的4%多聚甲醛固定細胞15 min ；⑵固定好的A549細胞用PBS-T洗滌2次，每孔加入100 μ I通透液室溫孵育15 min ； (3) PBS-T洗滌3次，滴加2% BSA封閉液37 °C濕盒中孵育I h ; (4)加入100 μ I含有兔抗總Η2ΑΧ抗體和小鼠抗 Η2ΑΧ抗體，在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中孵育2小時或4 °C過夜；(5) PBS-T洗滌3次，加入HRP標記驢抗鼠和AP標記的羊抗兔混合二抗溶液，在37 °〇恒溫培育I小時；(6) PBS-T洗滌3次，向微孔板中加入75 μ I的辣根酶底物Α，孵育50 min,再加入75 μ I的堿性磷酸酶底物B，孵育30 min后經(jīng)熒光酶標儀(540 nm處激發(fā),在600 nm處檢測和360 nm處激發(fā),在450 nm處檢測)測定突光強度值； 6)數(shù)據(jù)處理:試驗中設(shè)置空白對照組，即不加入一抗抗體，僅加入酶標記的二抗抗體，所檢測信號即為由非特異性吸附引起的空白信號；本實驗在檢測目標物H2AX的同時，對細胞中總H2AX (不區(qū)分磷酸化標記)也進行了定量測定，根據(jù)目標物 H2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值來確定H2AX的磷酸化程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于:步驟I)中各實驗試劑的具體配制方法如下: (O細胞培養(yǎng)基:溶劑為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ； (2)4%多聚甲醛溶液:40 g多聚甲醛、2.965 g磷酸二氫鈉、29 g磷酸二氫鈉和1000ml蒸餾水放入燒杯中，在磁力攪拌器上加熱60 °C振蕩24 h ； (3)PBS-T緩沖液:0.2 g磷酸二氫鉀，2.9 g磷酸氫二鈉，8.0 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，.0.5 ml吐溫20，加水至1000 ml ； (4)細胞膜通透液:0.5% Triton X-100 的配制:取0.5 ml Triton X-100，加入至99.5ml的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，混合后置37 °C~40 1:水使其充分溶解混勻； (5)封閉劑:2%牛血清白蛋白(BSA)溶液的配制:取2gBSAffi0.01 mol/1 PBS (pH7.4)溶解，定容至100 ml ； (6)混合一抗溶液:使用前取適量小鼠抗H2AX抗體和兔抗總H2AX抗體混合，用封閉劑稀釋至所需濃度； (7)混合二抗溶液:使用前取適量HRP標記驢抗鼠和AP標記的羊抗兔混合二抗溶液混合，用封閉劑稀釋至所需濃度； (8)底物A:取0.1M的Tris-HCl (PH=8.6)的緩沖液10 ml，加入0.0011 g魯米諾，.0.0008 g對碘苯酚為溶液Al ;取0.1 M的Tris -HCl (PH=8.6)的緩沖液10 ml，加入2.6ul30%的H2O2,為溶液A2 ;使用前溶液Al和溶液A2各取75 ul混勻使用； (9)底物B:用二乙醇胺(DEA)緩沖液配制0.0125 mmol/1的4-甲基傘花基磷酸鈉(4-MUP)溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于:步驟3)中卷煙煙氣粒相物萃取液及氣相物吸收液的制備方法如下: 卷煙樣品于溫度(22±1) °C和相對濕度60%±3%條件下平衡48 h ;然后使用轉(zhuǎn)盤式吸煙機在ISO抽吸條件下抽吸卷煙，煙氣粒相物用劍橋濾片收集，根據(jù)煙氣粒相物質(zhì)量加入相應(yīng)體積的DMSO溶劑，得到最終濃度為10 mg/ml的煙氣粒相物萃取液，使用前在一 70 V以下儲存；在收集煙氣總粒相物的同時將氣相物通入裝有PBS溶液的吸收瓶中，粒相物收集完畢后，將PBS吸收液定容至與粒相物萃取液中DMSO體積相同，通過0.2 μπι的濾膜除菌后，得到最終濃度與粒相物萃取液相當?shù)臒煔鈿庀辔镂找?，且必須在制備后半小時內(nèi)使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定細胞DNA損傷標志物Η2ΑΧ含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于:步驟5)中所述小鼠抗Η2ΑΧ抗體的最佳濃度為0.6-1.0 μ g/ml ；HRP酶標記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為4-6 μ g/ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于:底物A中0.1 M的Tris-HCl(pH=8.6)的緩沖液是通過以下方法制備:先制備0.1 M的三羥甲基甲烷(Tris)溶液，再利用高濃度鹽酸將pH調(diào)節(jié)至8.6。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定細胞DNA損傷標志物H2AX含量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于:底物B中的二乙醇胺(DEA)緩沖液的制備方法為:二乙醇胺97ml，蒸餾水.800ml，混合， 用濃HCl調(diào)pH=9.8，加水至1000ml ;或通過市場購買。
【文檔編號】G01N33/68GK103645327SQ201310684364
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】陳歡, 侯宏衛(wèi), 付立偉, 田永峰, 韓書磊, 劉彤, 吳帥賓, 胡清源, 張小濤, 石龍凱 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心