一種人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明為一種人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途。由包含離體的人干細(xì)胞和生理鹽水組成的所述干細(xì)胞組合物配置成的體積為10～80ml的干細(xì)胞懸液，每份所述干細(xì)胞懸液中含有的人干細(xì)胞的數(shù)量為1～8×108個(gè)。本發(fā)明可通過靜脈注射進(jìn)行艾滋病的治療。靜脈輸入安全可靠，操作性強(qiáng)，副作用小，干細(xì)胞可以通過血液循環(huán)到達(dá)細(xì)胞受損部位。
【專利說明】一種人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人干細(xì)胞組合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途，進(jìn)一步地說，是涉及制備用于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物中的用途，特別是涉及人干細(xì)胞組合物在制備用于艾滋病藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥。是人類因?yàn)楦腥救祟惷庖呷毕莶《?HIV)后導(dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一系列機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合征。
[0003]據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告:2010年全世界存活HIV (人類免疫缺陷病毒)攜帶者及艾滋病患者共3400萬，新感染270萬，全年死亡180萬人。每天有超過7000人新發(fā)感染，全世界各地區(qū)均有流行，但97%以上在中、低收入國家，尤以非洲為重。中國疾病預(yù)防控制中心估計(jì)，截止至2011年底，中國存活HIV攜帶者及艾滋病患者約78萬人，全年新發(fā)感染者4.8 萬人，死亡2.8萬人。疫情已覆蓋全國所有省、自治區(qū)、直轄市，目前我國面臨艾滋病發(fā)病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人群開始向一般人群擴(kuò)散。
[0004]艾滋病的傳染源:HIV感染者和艾滋病病人是本病的唯一傳染源。
[0005]艾滋病的傳播途徑:HIV主要存在于感染者和病人的血液、精液、陰道分泌物、乳汁中。①性行為:與已感染的伴侶發(fā)生無保護(hù)的性行為，包括同性、異性和雙性性接觸。②靜脈注射吸毒:與他人共用被感染者使用過的、未經(jīng)消毒的注射工具，是一種非常重要的HIV 傳播途徑。③母嬰傳播:在懷孕、生產(chǎn)和母乳喂養(yǎng)過程中，感染HIV的母親可能會(huì)傳播給胎兒及嬰兒。④血液及血制品(包括人工受精、皮膚移植和器官移植)也是傳播途徑之一。
[0006]易感人群:人群普遍易感。高危人群包括:男性同性戀者、靜脈吸毒者、與HIV攜帶者經(jīng)常有性接觸者、經(jīng)常輸血及血制品者和HIV感染母親所生嬰兒。
[0007]HIV感染分為急性·期、無癥狀期和艾滋病期。
[0008](一)急性期:通常發(fā)生在初次感染HIV后2-4周左右。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咽痛、盜汗、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、關(guān)節(jié)痛、淋巴結(jié)腫大及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。多數(shù)患者臨床癥狀輕微，持續(xù)1-3周后緩解。
[0009]此期在血液中可檢出HIV-RNA (艾滋病病毒核酸)和P24抗原，而HIV抗體則在感染后數(shù)周才出現(xiàn)。⑶4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)一過性減少，⑶4/⑶8比例可倒置。
[0010](二)無癥狀期
[0011]可從急性期進(jìn)入此期，或無明顯的急性期癥狀而直接進(jìn)入此期。
[0012]此期持續(xù)時(shí)間一般為6-8年。但也有快速進(jìn)展和長期不進(jìn)展者。此期的長短與感染病毒的數(shù)量、型別，感染途徑，機(jī)體免疫狀況等多種因素有關(guān)。
[0013](三)艾滋病期
[0014]為感染HIV后的最終階段。病人⑶4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降，多<200/mm3，HIV 血漿病毒載量明顯升高。此期主要臨床表現(xiàn)為HIV相關(guān)癥狀、各種機(jī)會(huì)性感染及腫瘤。[0015]HIV相關(guān)癥狀:主要表現(xiàn)為持續(xù)一個(gè)月以上的發(fā)熱、盜汗、腹瀉；體重減輕10%以上。部分病人表現(xiàn)為神經(jīng)精神癥狀，如記憶力減退、精神淡漠、性格改變、頭痛、癲癇及癡呆等。另外還可出現(xiàn)持續(xù)性全身性淋巴結(jié)腫大，其特點(diǎn)為①.除腹股溝以外有兩個(gè)或兩個(gè)以上部位的淋巴結(jié)腫大.淋巴結(jié)直徑≥1cm，無壓痛，無粘連；③持續(xù)時(shí)間3個(gè)月以上。
[0016]HIV相關(guān)機(jī)會(huì)性感染及腫瘤的常見癥狀:發(fā)熱、盜汗、淋巴結(jié)腫大、咳嗽咳痰咯血、 呼吸困難、頭痛、嘔吐、腹痛腹瀉、消化道出血、吞咽困難、食欲下降、口腔白斑及潰瘍、各種皮疹、視力下降、失明、癡呆、癲癇、肢體癱瘓、消瘦、貧血、二便失禁、尿儲(chǔ)留、腸梗阻等。
[0017]毫無疑義，艾滋病給患者帶來了極大大的痛苦，現(xiàn)有技術(shù)的治療方法主要包括抗 HIV治療。
[0018]高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療是目前艾滋病的最主要的治療方法。這種治療需要終生服藥。期治療目標(biāo)是最大限度地抑制病毒的復(fù)制，保存和恢復(fù)免疫功能，降低病死率和HIV相關(guān)性疾病的發(fā)病率，提高患者的生活質(zhì)量，減少艾滋病的傳播。
[0019]但是，在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療艾滋病的過程中，存在如下缺陷:
[0020]其一，需要把握好治療的指征和時(shí)機(jī)，且某些特殊人群的抗病毒治療均有其特殊性，應(yīng)具體問題具體分析，不能照搬固有方案； [0021]其二，依從性很也是治療過程的一個(gè)重要因素，在實(shí)施抗病毒治療前，醫(yī)生應(yīng)與患者有充分的交流，讓他們了解治療的必要性、治療后可能出現(xiàn)的不適、依從性的重要性、 服藥后必須進(jìn)行定期的檢測，以及在發(fā)生任何不適時(shí) 應(yīng)及時(shí)與醫(yī)務(wù)人員聯(lián)系。同時(shí)要得到其家屬或朋友的支持，以提高患者的依從性。抗病毒治療過程中，應(yīng)監(jiān)測cd4+t淋巴細(xì)胞、 HIV-RNA及常規(guī)血液檢測，以評價(jià)療效及副作用。
[0022]本世紀(jì)，艾滋病已成為嚴(yán)重威脅世界人民健康的公共衛(wèi)生問題。因此，如何把艾滋病從一種致死性疾病逐漸變?yōu)橐环N可控的疾病，再進(jìn)一步徹底治愈，是一個(gè)亟待解決的世界性難題，也是擺在全世界醫(yī)務(wù)工作者面前的偉大事業(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明的目的，就是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人干細(xì)胞組合物在制備用于艾滋病藥物中的用途，進(jìn)而提供一種通過中西醫(yī)結(jié)合及干細(xì)胞組合物用于治療艾滋病的綜合療法。
[0024]關(guān)于本文中有關(guān)干細(xì)胞的相關(guān)術(shù)語定義如下:
[0025]1.干細(xì)胞組合物:為本 申請人:的專利申請(201210017987.9)中提到的2_4mm厚的油狀干細(xì)胞層(詳見其說明書中干細(xì)胞制備過程);
[0026]2.干細(xì)胞懸液:為該油狀干細(xì)胞層經(jīng)生理鹽水清洗及稀釋后得到的懸液，定容為 10-80ml ；
[0027]3.干細(xì)胞懸液的稀釋液:由于懸液中的干細(xì)胞數(shù)量多，易吸附成團(tuán)，為了防止靜滴時(shí)不能通過濾網(wǎng)，因此靜滴前需再用100ml的生理鹽水進(jìn)一步稀釋，即得到干細(xì)胞懸液的稀釋液，此時(shí)的總?cè)萘繛?10_180ml。
[0028]注:自始至終，干細(xì)胞的數(shù)量并未發(fā)生變化，即溶質(zhì)為定量，只是增加了生理鹽水的量，即溶劑為變量，因此溶液的量也隨之變化，即有了三種不同的稱呼。若不同，也只是溶液的密度不同，由于起效成分為干細(xì)胞，因此生理鹽水的多少并不會(huì)影響治療的效果。[0029] 本發(fā)明的人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途，是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0030]所述的人干細(xì)胞選自人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞；
[0031]所述的干細(xì)胞組合物為按照本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9、名稱為“一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液及干細(xì)胞分離方法”中的干細(xì)胞分離方法步驟(3)得到的“存在于整個(gè)離心管中間位置的約(2-4) _厚的油狀干細(xì)胞層”；
[0032]每份所述干細(xì)胞組合物經(jīng)(10-80) ml生理鹽水清洗及定容后，得到含有的人干細(xì)胞的數(shù)量為(I~8) X IO8個(gè)的干細(xì)胞懸液；
[0033]每份所述的干細(xì)胞懸液在使用前再用100ml的生理鹽水進(jìn)一步稀釋，得到干細(xì)胞懸液中的個(gè)數(shù)密度為(0.125~8) X IO7個(gè)/ml、總?cè)萘繛?10_180ml的干細(xì)胞懸液的稀釋液。
[0034]在具體實(shí)施中，所述的用途采用以下方法實(shí)現(xiàn):
[0035]所述的干細(xì)胞懸液的稀釋液通過體表淺靜脈進(jìn)行靜脈點(diǎn)滴法注射到人體。
[0036]所述的靜脈點(diǎn)滴法的步驟為:
[0037](I)先用0.9%的氯化鈉溶液20_30ml沖管；
[0038](2)接著開始靜脈點(diǎn)滴注射輸入干細(xì)胞懸液的稀釋液，保持20-30滴/分鐘，半小時(shí)后無不良反應(yīng)可增加到30-50滴/分鐘，細(xì)胞輸入過程中每15分鐘輕輕晃動(dòng)裝有所述干細(xì)胞懸液的稀釋液的細(xì)胞保存袋一次；
[0039](3)細(xì)胞輸入完畢后用0.9%的氯化鈉溶液20ml沖入細(xì)胞保存袋中輕輕晃動(dòng)，再用 0.9%的氯化鈉溶液20-30ml沖凈即可將輸液器中細(xì)胞沖凈，得到的沖洗液也同樣注入患者體內(nèi)，以保證細(xì)胞輸入的數(shù)量；
[0040]靜滴時(shí)將細(xì)胞液搖勻，避免細(xì)胞貼壁。
[0041]所述的人干細(xì)胞優(yōu)選為人類臍帶血干細(xì)胞。
[0042]另外本發(fā)明所述的用途還可以結(jié)合包括以下兩種藥物的配合實(shí)現(xiàn):
[0043]1、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療
[0044]所述的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括以下藥物的至少一種:核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑、融合酶抑制劑及CCR5抑制劑、立妥威DDI，拉米夫定3TC，齊多夫定AZT，賽瑞特D4T，替諾福韋酯TDF，維樂命NVP，依非韋倫 EFV,克立芝，達(dá)魯那韋，拉替拉偉；
[0045]2、中醫(yī)中藥治療
[0046]所述的中藥基礎(chǔ)組方如下:
[0047]黃芪10-15克黨參6-15克白術(shù)6-12克茯苓6_18克
[0048]甘草6-10克黃連3-6克紫花地丁 10-15克蒲公英10_15克
[0049]銀花15-20克板藍(lán)根20克白花蛇舌草20_25克虎杖9_15克
[0050]七葉一枝花10-15克淫羊藿20-25克。
[0051]本發(fā)明的干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途具體實(shí)施過程進(jìn)一步詳述如下:
[0052]1、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療
[0053]高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HighlyActive Antiretroviral Therapy, HAART)是艾滋病的最根本的治療方法。而且需要終生服藥。治療目標(biāo):最大限度地抑制病毒的復(fù)制，保存和恢復(fù)免疫功能，降低病死率和HIV相關(guān)性疾病的發(fā)病率，提高患者的生活質(zhì)量，減少艾滋病的傳播。
[0054]開始抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的指征和時(shí)機(jī):
[0055]①成人及青少年開始抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的指征和時(shí)機(jī)
[0056]下列情況之一建議治療:艾滋病期患者；急性期；無癥狀期CD4+T淋巴細(xì)胞〈350/ mm3 ;CD4+T淋巴細(xì)胞每年降低大于100/mm3 ；HIV-RNA>105cp/ml ;心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)；合并活動(dòng)性HBV/HCV感染；HIV相關(guān)腎病；妊娠。開始HAART前，如果存在嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染或既往慢性疾病急性發(fā)作，應(yīng)控制病情穩(wěn)定后再治療。
[0057]②嬰幼兒和兒童開始抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的指征和時(shí)機(jī)
[0058]以下情況之一建議治療:小于12個(gè)月的嬰兒；12至35個(gè)月的嬰兒，OT4+T淋巴細(xì)胞比例〈20%，或總數(shù)〈750/mm3 ；36個(gè)月以上的兒童，CD4+T淋巴細(xì)胞比例〈15%，或總數(shù)〈350/ mm3。
[0059]抗反轉(zhuǎn)錄病毒(ARV)藥物:
[0060]①國際現(xiàn)有藥物:六大類30多種。核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)、蛋白酶抑制劑(Pis)、整合酶抑制劑(raltegravir)、融合酶抑制劑 (FIs)及 CCR5 抑制劑(maraviroc)。
[0061]②國內(nèi)ARV藥物:有前4類，12種。
[0062]抗艾滋病病毒藥物有:立妥威DDI，拉米夫定3TC，齊多夫定AZT，賽瑞特D4T，替諾福韋酯TDF，維樂命NVP，依非韋倫EFV，克立芝，達(dá)魯那韋，拉替拉偉。
[0063]推薦 我國成人及青少年的一線抗病毒方案:齊多夫定/替諾福韋+拉米夫定+依非韋倫/奈韋拉平
[0064]某些特殊人群(如兒童、孕婦、合并結(jié)核、肝炎及靜脈吸毒者)的抗病毒治療均有其特殊性，應(yīng)具體問題具體分析，不能照搬以上方案。
[0065]2、中醫(yī)中藥治療
[0066]中醫(yī)中藥治療艾滋病，又如下五個(gè)方面的優(yōu)勢:
[0067](I)中醫(yī)的辨證論治和個(gè)體化治療可應(yīng)付艾滋病復(fù)雜多變的臨床特點(diǎn)，緩解和減輕癥狀，提聞生存質(zhì)量。
[0068](2)早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。由于西藥抗病毒治療需要等到符合合適的治療條件時(shí)才能使用，因此，中醫(yī)藥對于無癥狀期HIV感染者的治療具有一定的潛力和優(yōu)勢。
[0069](3)能階段性的穩(wěn)定或改善患者的免疫功能，延緩發(fā)病，使患者帶毒生存。
[0070](4)中藥可以減輕抗病毒藥物的某些毒副作用，增加患者的依從性。
[0071](5)中醫(yī)藥資源豐富，歷史悠久，能夠被廣大患者接受，有較好的藥物可及性和覆蓋面；此外，在辨證準(zhǔn)確的前提下，毒副作用相對較少。
[0072]相關(guān)研究表明，中藥對改善艾滋病的癥狀體征療效確切；可以明顯改善患者的生存質(zhì)量，對HAART (雞尾酒療法)引起的部分不良反應(yīng)具有較好的治療作用，對提高和穩(wěn)定患者的免疫功能具有一定的作用，有些中藥與HAART合用可以提高抗病毒藥的療效。中藥治療雖然起效慢，但作用持久，且不易產(chǎn)生耐藥性，在臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0073]中醫(yī)治以扶正祛邪，清熱解毒。在具體實(shí)施中，其基礎(chǔ)組方如下:[0074]黃芪10-15克黨參6-15克白術(shù)6-12克茯苓6-18克
[0075]甘草6-10克黃連3-6克紫花地丁 10-15克蒲公英10_15克
[0076]銀花15-20克板藍(lán)根20克白花蛇舌草20_25克虎杖9_15克
[0077]七葉一枝花10-15克淫羊藿20-25克
[0078]上方為基礎(chǔ)方，按癥狀不同可臨證加減其方藥及劑量。
[0079]3、生物治療
[0080]干細(xì)胞是一類具有自我更新，高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可以通過細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，被醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。
[0081]本發(fā)明就是基于干細(xì)胞具有的細(xì)胞替代作用，將干細(xì)胞植入體內(nèi)后，能自動(dòng)識(shí)別并移行至細(xì)胞損傷部位，然后分裂增殖成新的細(xì)胞，替代受損或病變細(xì)胞行使其功能。
[0082]艾滋病是人類因?yàn)楦腥救祟惷庖呷毕莶《竞髮?dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一系列機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合征。免疫病理主要表現(xiàn)為cd4+t淋巴細(xì)胞數(shù)量減少及功能障礙，異常免疫激活及免疫重建。而干細(xì)胞具有細(xì)胞替代作用，干細(xì)胞植入體內(nèi)后，能自動(dòng)識(shí)別并移行至細(xì)胞損傷部位，然后分裂增殖成新的細(xì)胞，替代壞死的免疫細(xì)胞行使其功能。艾滋病是累及全身多器官系統(tǒng)的疾病，如皮膚粘膜、淋巴結(jié)、眼部、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、 神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等。干細(xì)胞可移行至上述病變部位，定向分化為所需的功能細(xì)胞，繼而替代失去功能的病變細(xì)胞。
[0083]另外，由于干細(xì)胞具有增殖和定向分化的能力，當(dāng)干細(xì)胞被趨化至器官損傷局部后，其中部分細(xì)胞分泌大量小分子物質(zhì)，趨化受體干細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞增殖并定向分化，完成各器官功能的修復(fù)。而且干細(xì)胞能釋放多種生物活性物質(zhì)，如可以釋放膜微粒，趨化并調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞的功能活性，喚醒處于休眠期的組織細(xì)胞，促進(jìn)其發(fā)揮其生物學(xué)特性；另由于其具有的免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)人體的免疫機(jī)能和修復(fù)受損的免疫系統(tǒng)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)， 從而預(yù)防各種免疫因素及感染所致的相關(guān)疾病。
[0084]當(dāng)用所述干細(xì)胞組合物用于治療艾滋病選擇靜脈輸入治療時(shí)，由于干細(xì)胞具有增殖和定向分化的能力，當(dāng)干細(xì)胞被趨化至細(xì)胞損傷局部后，其中部分細(xì)胞分泌大量小分子物質(zhì)，趨化受體干細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞增殖并定向分化，完成內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。而且干細(xì)胞能釋放多種生物活性物質(zhì)，如可以釋放膜微粒，趨化并調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞的功能活性，喚醒處于休眠期的組織細(xì)胞，促進(jìn)其發(fā)揮其生物學(xué)特性；另由于其具有的免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)人體的免疫機(jī)能和修復(fù)受損的免疫系統(tǒng)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防各種免疫因素及感染所致的相關(guān)疾病。同時(shí)靜脈輸入安全可靠，操作性強(qiáng)，副作用小，干細(xì)胞可以通過血液循環(huán)到達(dá)細(xì)胞受損部位。
[0085]綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0086]1.臨床使用安全，內(nèi)毒素< 1EU,符合國家藥典規(guī)定的注射用標(biāo)準(zhǔn)。
[0087]2.獲取的細(xì)胞懸液體積小，可按醫(yī)生的需求配成臨床治療所需劑量。
[0088]3.靜脈輸入安全可靠，操作性強(qiáng)，治療損傷小，副作用小，干細(xì)胞可以通過血液循環(huán)到達(dá)細(xì)胞受損部位。
[0089]4.另外使用本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9、名稱為“一種人類骨髓、臍帶
血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液及干細(xì)胞分離方法”的方法制得的人造血干細(xì)胞，還具備以下優(yōu)勢
[0090](I)含有多種細(xì)胞因子，能夠使干細(xì)胞快速準(zhǔn)確的到達(dá)受損部位，并輔助其發(fā)揮生物學(xué)活性；
[0091](2)細(xì)胞數(shù)量大，特別是由人臍帶血分離提取的純化干細(xì)胞，每份臍帶血(80ml左右)分離出的干細(xì)胞數(shù)量皆可達(dá)到IO8以上；
[0092](3)細(xì)胞種類全，分離全部的紅細(xì)胞，血小板，血漿物質(zhì)，去除部分成熟白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，純化有核細(xì)胞，保留所有干細(xì)胞；
[0093](4)細(xì)胞活性強(qiáng)，采自人體新鮮活細(xì)胞，經(jīng)分離純化后獲取干細(xì)胞。細(xì)胞活性達(dá)96% 以上。
【具體實(shí)施方式】
[0094]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0095]實(shí)施例1
[0096]用于治療艾滋病的干細(xì)胞懸液的制備。
[0097]無菌紗布蘸75%的酒精，擦拭所有操作過程中所需物品及操作臺(tái)。(本操作中所涉及消毒步驟皆用75%酒精的無菌紗布擦拭，以下簡稱消毒)
[0098]1，將50mL含有枸櫞酸鈉的臍帶血血袋消毒，導(dǎo)入50mLl號(hào)液瓶中。將50mL2號(hào)液全部倒入I號(hào)液瓶中，蓋緊瓶蓋，充分搖勻。將I號(hào)液瓶置于超凈臺(tái)，松動(dòng)瓶蓋后靜置 20-30min，待分層。12支離心管拆封，備用。
[0099]2，取3號(hào)液，消毒外壁，開蓋，用新移液管取25mL3號(hào)液置于50mL新離心管中，一共移取3次，得到3支有試劑3號(hào)液的離心管，備用。
·[0100]3,取步驟I靜置20_30min后的試劑I號(hào)液瓶中的上層液,用移液管移取分別置于離心管中每只45mL,蓋緊蓋置于離心機(jī)中設(shè)置速度為2500轉(zhuǎn)時(shí)間為5分鐘溫度為5°C。從離心機(jī)中取出離心管，消毒，開蓋，棄上清液。
[0101]4，取新移液管，移取0.9%NaCl分別加入到離心管中至IOmL處，搖勻，得細(xì)胞混合液備用。取步驟2下裝有3號(hào)液的離心管，緩慢加入剛剛制備的細(xì)胞混合液，保持細(xì)胞混合液懸浮于3號(hào)液表面，加至45ml，輕放至試管架，即得到3支具有分層液的離心管，置于離心機(jī)中，設(shè)置速度為1800轉(zhuǎn)，時(shí)間為30分鐘，溫度為5°C。
[0102]5，從離心機(jī)中輕取出離心管，保持液面平穩(wěn)，消毒，開蓋，用一次性膠頭滴管吸取離心管中間的絮狀液體，收集置三支新離心管中，用移液管加入0.9%NaCl至45ml處，搖勻， 配平，離心，設(shè)置速度為2000轉(zhuǎn)時(shí)間為5分鐘溫度為5°C (注:第一次清洗)。
[0103]6，取出具有細(xì)胞液的離心管，消毒，開蓋，棄上清液后，用注射器先加入少量 0.9%NaCl，搖勻后吸取至一支試管內(nèi)，加入0.9%NaCl至45ml處，再搖勻，配平，離心，速度為 1800轉(zhuǎn)，時(shí)間為5分鐘溫度為5°C (注:第二次清洗)。
[0104]7，取出具有細(xì)胞液的離心管，消毒，開蓋，棄上清液，用注射器先加入少量 0.9%NaCl，搖勻后加入0.9%NaCl至45ml處，再搖勻，配平，離心，設(shè)置速度為1600轉(zhuǎn)時(shí)間為 5分鐘溫度為5°C (第三次清洗)。
[0105]8,取出具有細(xì)胞液的離心管，消毒，開蓋,棄上清液后加入0.9%NaCl至所需要稀釋刻度處搖勻，用微量定量移液器取IOul用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余細(xì)胞液密封，置于冰桶內(nèi)待用。
[0106]實(shí)施例2
[0107]藥理實(shí)驗(yàn)，臍帶血干細(xì)胞懸液的一般藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0108]I 材料
[0109]1.1動(dòng)物:KM小鼠體質(zhì)量18~22g，雌雄各半。健康雜種家犬，體重12~18kg，雌雄皆用。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室條件下，室內(nèi)溫度19~22°C，相對濕度40%~ 50%，給予全價(jià)顆粒飼料，自由攝食、飲水。
[0110]1.2藥物:人類臍帶血干細(xì)胞懸液，其中干細(xì)胞含量為8X IO7個(gè)/ml。
[0111]1.3上海欣曼公司SYS-G型小鼠自主活動(dòng)測頻儀，美國BIOPAC公司RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀。
[0112]2試驗(yàn)方法
[0113]2.1對精神神經(jīng)系統(tǒng)的影響
[0114]2.1.1對小鼠一般外觀行為的影響:取小鼠80只，隨機(jī)分為四組，每組20只，雌雄各半，給藥組分設(shè)0.5、1.0,2.0ul/kg三個(gè)劑量組，對照組給予5%葡萄糖注射液，均按
0.lml/10g體重尾靜脈注射給藥，給藥后lOmin，觀察小鼠的一般行為表現(xiàn)，步態(tài)、姿勢、肌肉緊張度、瞳孔變化、流涎、二便、皮毛等，同對照組比較，了解受試藥對動(dòng)物的影響。
[0115]2.1.2對小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響:分組及給藥同前，采用傾斜板法，于給藥前及給藥后10min、30min及60min各進(jìn)行一次測定，計(jì)算各組小鼠從木板上跌落的百分率，按簡化直接法統(tǒng)計(jì)。
[0116]2.1.3對小鼠自主活動(dòng)的影響:小鼠80只，分組及給藥同前，于尾靜脈注射給藥后 IOmin,置小鼠于自發(fā)活動(dòng)測定儀中，穩(wěn)定5min后,測定IOmin 內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù),用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
[0117]2.2對呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的影響
[0118]家犬6只，雌雄各半，用戊巴比妥鈉30mg/kg，靜脈注射麻醉后，背位固定，分離右頸總動(dòng)脈，插管連接TP —101型壓力轉(zhuǎn)換能以多導(dǎo)生理記錄儀記錄收縮壓，舒張壓及平均動(dòng)脈壓；以針形電極刺入四肢皮下記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，以立位轉(zhuǎn)換能器連接胸骨記錄呼吸頻率及幅度。實(shí)驗(yàn)設(shè)0.5、1.0、2.0ul/kg三個(gè)劑量組，對照組用5%葡萄糖注射液，給藥容積為lml/kg，由股靜脈插管給藥，注射速度為30s，分別在靜脈注射給藥后1、2、5、10、15、20及 30min時(shí)記錄上述各項(xiàng)指標(biāo),觀察臍帶血干細(xì)胞懸液對呼吸,心電及血壓的作用，用t檢驗(yàn)法進(jìn)行用藥前后顯著性檢驗(yàn)分析。
[0119]3 結(jié)論
[0120]3.1對小鼠一般行為表現(xiàn)的影響:實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物在用藥后60min內(nèi)的一般行為，步態(tài)、肌緊張度、活動(dòng)、飲食、皮毛及二便，均無顯著變化，未見有瞳孔大小改變，豎毛、倦伏、流涎等異常癥狀，同對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0121]3.2對協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響:各組動(dòng)物于給藥前及給藥后各觀測點(diǎn)的跌落率均為0，表明在實(shí)驗(yàn)所用0.5,1.0,2.0ul/kg劑量下對小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)無明顯影響。
[0122]3.3對小鼠自主活動(dòng)的影響:臍帶血干細(xì)胞懸液各劑量組對小鼠自主活動(dòng)的影響見表1。
[0123]表1對小鼠自主活動(dòng)的影響[0124]
【權(quán)利要求】
1.一種人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途，其特征在于:所述的人干細(xì)胞選自人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞；所述的干細(xì)胞組合物為按照本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9、名稱為“一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液及干細(xì)胞分離方法”中的干細(xì)胞分離方法步驟(3)得到的“存在于整個(gè)離心管中間位置的約(2-4) mm厚的油狀干細(xì)胞層”；每份干細(xì)胞組合物經(jīng)(10-80) ml生理鹽水清洗及定容后，得到含有的人干細(xì)胞的數(shù)量為(I~8) X IO8個(gè)的干細(xì)胞懸液； 每份所述的干細(xì)胞懸液在使用前再用100ml的生理鹽水進(jìn)一步稀釋，得到干細(xì)胞懸液中的個(gè)數(shù)密度為(0.125~8) X IO7個(gè)/ml、總?cè)萘繛?10_180ml的干細(xì)胞懸液的稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途，其特征在于，所述的用途采用以下方法實(shí)現(xiàn):所述的干細(xì)胞懸液的稀釋液通過體表淺靜脈進(jìn)行靜脈點(diǎn)滴法注射到人體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途，其特征在于，所述的靜脈輸入法的步驟為:(1)先用0.9%的氯化鈉溶液20-30ml沖管；(2)接著開始靜脈點(diǎn)滴注射輸入干細(xì)胞懸液的稀釋液，保持20-30滴/分鐘，半小時(shí)后無不良反應(yīng)可增加到30-50滴/分鐘，細(xì)胞輸入過程中每15分鐘輕輕晃動(dòng)裝有所述干細(xì)胞懸液的稀釋液的細(xì)胞保存袋一次；(3)細(xì)胞輸入完畢后用0.9%的氯化鈉溶液20ml沖入細(xì)胞保存袋中輕輕晃動(dòng)，輸入完畢后再用0.9%的氯化鈉溶液將輸液器中細(xì)胞沖凈，得到的沖洗液也同樣注入患者體內(nèi)，以保證細(xì)胞輸入數(shù)量；靜滴時(shí)將細(xì)胞液搖勻，避免細(xì)胞貼壁。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途，其特征在于:所述的人干細(xì)胞為臍帶血干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人干細(xì)胞組合物在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途，其特征在于，所述的用途結(jié)合包括以下兩種藥物的配合實(shí)現(xiàn):1)、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療所述的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括以下藥物的至少一種:核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑、融合酶抑制劑及CCR5抑制劑、立妥威 DDI，拉米夫定3TC，齊多夫定AZT，賽瑞特D4T，替諾福韋酯TDF，維樂命NVP，依非韋倫EFV， 克立芝，達(dá)魯那韋，拉替拉偉；2)、中醫(yī)中藥治療所述的中藥基礎(chǔ)組方如下:黃芪10-15克黨參6-15克白術(shù)6-12克茯苓6-18克甘草6-10克黃連3-6克紫花地丁 10-15克蒲公英10-15克銀花15-20克板藍(lán)根20克白花蛇舌草20-25克虎杖9_15克七葉一枝花10-15克淫羊藿20-25克。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103585178SQ201310549262
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】唐明淇, 劉春彥 申請人:唐明淇