利用多能干細胞制備神經(jīng)前體細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及利用多能干細胞制備神經(jīng)前體 細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人多能干細胞（hPSCs ;包括人胚胎干細胞hESCs和人誘導(dǎo)多能干細胞hiPSCs)是 研究各種疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病的良好模型。由其分化的神經(jīng)前體能夠進一步分化為 神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)退行性疾病的疾病機制研究，藥物篩選及疾病標(biāo)志物的篩查，細 胞移植治療有很重要的作用。
[0003] 目前人多能干細胞的神經(jīng)分化方法主要有三種：
[0004] 第一種方法是類胚體（embryoid body，EB)誘導(dǎo)。將培養(yǎng)的hESC或hiPSC消化為 團塊懸浮培養(yǎng)將形成EB。EB包含三個胚層的細胞，具有向各類細胞繼續(xù)分化的能力。EB貼 壁培養(yǎng)，逐漸會出現(xiàn)神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)（rosette)的細胞團，將這類細胞挑出繼續(xù)培養(yǎng)，則可得 到神經(jīng)前體。這些神經(jīng)前體可增殖，并能向神經(jīng)元，膠質(zhì)細胞分化。在特定因子的誘導(dǎo)下可 分化為特定類型的神經(jīng)元。EB誘導(dǎo)方法的缺點是神經(jīng)元分化效率低，EB的形成效率依賴于 細胞狀態(tài)，并不是每株細胞每次分化都能獲得很多EB。而且EB包涵三個胚層的細胞，最后 挑出的神經(jīng)花環(huán)也是神經(jīng)類細胞和膠質(zhì)細胞的混合體，有很多非神經(jīng)類的細胞。這些都會 影響最后神經(jīng)分化的效率。
[0005] 第二種分化方法是與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)。在發(fā)育過程中神經(jīng)元的分化由很多信號通 路決定，參與的細胞并不是只有神經(jīng)元本身，如膠質(zhì)細胞，骨髓基質(zhì)細胞等能分泌很多因子 促進神經(jīng)元的分化。常用的基質(zhì)細胞有PA6，MS5,也可用原代膠質(zhì)細胞。分化開始時先在 培養(yǎng)皿底下鋪一層基質(zhì)細胞，再將hESC或hiPSC種上去，在一定培養(yǎng)液條件下可有導(dǎo)出成 熟神經(jīng)元。這種分化方法的缺點是，基質(zhì)細胞分泌的因子是不確定的，也不穩(wěn)定，所以不同 批次分化效率都可能會有差異。而且不能獲得神經(jīng)前體。
[0006] 第三種分化方法是單層細胞培養(yǎng)法（adherent monolayer culture system)。將 hESC或hiPSC單層貼壁培養(yǎng)，通過添加不同誘導(dǎo)因子來誘導(dǎo)神經(jīng)分化。這種方法是通過用 各種細胞因子和小分子如shh，F(xiàn)GF8, RA，SB431542等來激活神經(jīng)類細胞分化的通路或阻斷 非神經(jīng)類細胞的分化通路的作用來達到促進神經(jīng)分化的目的。
[0007] 人多能干細胞的神經(jīng)分化對神經(jīng)退行性疾病的研究提供重要的模型，獲得盡可能 多的神經(jīng)分化細胞對于科學(xué)及臨床研究都很有必要。然而，上述人多能干細胞向神經(jīng)分化 的方法均存在一些缺點，包括效率低，耗時長，所得細胞不純等。因此，本領(lǐng)域還有必要開發(fā) 改進的技術(shù)，來提高分化效率或提高細胞純度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供利用多能干細胞制備神經(jīng)前體細胞的方法。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備神經(jīng)前體細胞的方法，所述方法包括：
[0010] (1)以維甲酸（RA)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)培養(yǎng)多能干細胞，獲得神經(jīng) 球；和
[0011] (2)培養(yǎng)（1)獲得的神經(jīng)球使之成熟，獲得神經(jīng)前體細胞。
[0012] 在一個優(yōu)選例中，所述的組蛋白去乙?；敢种苿┌ǎ憾∷徕c（NaB)，丙戊酸鈉 (VPA)或MGCD0103或其組合。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，丁酸鈉的用量是：50μΜ-1πιΜ ;丙戊酸鈉的用量是50μΜ-3πιΜ ; MGCD0103 的用量是 0. 1-3 μ Μ。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，丁酸鈉的用量是 60-200 μ Μ，如 80 μ Μ，100 μ Μ，200 μ Μ，300 μ Μ。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，丙戊酸鈉的用量是100μΜ-2πιΜ，如100μΜ，150μΜ，200μΜ， 500 μ Μ〇
[0016] 在另一優(yōu)選例中，MGCDO103的用量是0.2-2 μ Μ;更佳地為0.3-1 μ Μ;如0.4 μ M， 0. 5 μ Μ, 0. 8 μ Μ。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，維甲酸的用量是2-50 μ Μ ;較佳地，維甲酸的用量是4-30 μ Μ ;更 佳地為 5-20 μ Μ ;如 8 μ Μ，10 μ Μ，12 μ Μ，15 μ Μ。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)中還包括：從培養(yǎng)物中分離出神經(jīng)前體細胞。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，以Nestin和/或S0X1分子作為神經(jīng)前體細胞的標(biāo)志物，Nestin 和/或S0X1分子陽性表明該細胞為神經(jīng)前體細胞。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，可采用流式細胞分選方法分離出神經(jīng)前體細胞。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的從培養(yǎng)物中分離出神經(jīng)前體細胞的方法是：
[0022] 分選細胞表面Nestin分子和/或S0X1分子陽性的細胞群，所述的細胞群是純的 神經(jīng)前體細胞的細胞群。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)獲得的Nestin和S0X1陽性的神經(jīng)前體細胞占細胞培 養(yǎng)物總細胞的94%或更高；Nestin陽性的神經(jīng)前體細胞占細胞培養(yǎng)物總細胞的97%或更 高；S0X1陽性的神經(jīng)前體細胞占細胞培養(yǎng)物總細胞的99%或更高。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)包括：將多能干細胞處理成500-1000個細胞的小 克隆，以添加了維甲酸和組蛋白去乙?；敢种苿┑母杉毎S持培養(yǎng)基（feeder-free stem-cell maintenance medium;如mTeSRl)進行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7±2天（較佳地 為7±1天，更佳地為7±0.5天）。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)包括：將步驟（1)的細胞處理成含500-1000個細胞的 團塊，在神經(jīng)球培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)11 ±2天（較佳地11 ± 1天）。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，前4±1天用KSR培養(yǎng)液培養(yǎng)，后7±1天用N2培養(yǎng)液培養(yǎng)，至神 經(jīng)球成熟。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的多能干細胞包括：胚胎干細胞或誘導(dǎo)多能干細胞。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的多能干細胞是人多能干細胞。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的胚胎干細胞是人胚胎干細胞。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的誘導(dǎo)多能干細胞是人誘導(dǎo)多能干細胞。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（1)之前，還包括：在所述的多能干細胞中降低HDAC3或 SMRT的表達或活性。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，利用RNA干擾的方法降低HDAC3或SMRT的表達。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，利用干擾HDAC3表達的慢病毒載體轉(zhuǎn)染多能干細胞，從而降低 HDAC3的表達。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，利用干擾SMRT表達的慢病毒載體（較佳地，所述的慢病毒載體 中，用于干擾的siRNA序列為SEQ ID N0:1或SEQ ID勵:2)轉(zhuǎn)染多能干細胞，從而降低311^ 的表達。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種組蛋白去乙?；敢种苿┑挠猛?，用于誘導(dǎo)多能 干細胞分化為神經(jīng)前體細胞。
[0036] 在一個優(yōu)選例中，所述的組蛋白去乙?；敢种苿┯糜谥苽湔T導(dǎo)多能干細胞分化 為神經(jīng)前體細胞的制劑。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的組蛋白去乙酰化酶抑制劑包括：丁酸鈉（NaB)，丙戊酸鈉 (VPA)或MGCD0103或其組合。
[0038] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備神經(jīng)前體細胞的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基 包括：干細胞維持培養(yǎng)基以及2-50 μ Μ維甲酸；和50 μ M-lmM 丁酸鈉，50 μ M-3mM丙戊酸鈉 或（λ 1-3μΜ MGCD0103。
[0039] 在一個優(yōu)選例中，培養(yǎng)基中丁酸鈉的量是60-200 μ Μ，如80 μ Μ，100 μ Μ，200 μ Μ， 300 μ Μ〇
[0040] 在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)基中丙戊酸鈉的量是100μΜ-2πιΜ，如100μΜ，150μΜ， 200 μ Μ, 500 μ Μ〇
[0041] 在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)基中MG⑶0103的量是0. 2-2 μ Μ ;更佳地為0. 3-1 μ Μ;如 0. 4 μ Μ, 0. 5 μ Μ, 0. 8 μ Μ〇
[0042] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的培養(yǎng)基的用途，用于制備神經(jīng)前體細胞。
[0043] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種HDAC3或SMRT下調(diào)劑的用途，用于促進多能干細 胞分化為神經(jīng)前體細胞。
[0044] 在一個優(yōu)選例中，所述的HDAC3或SMRT下調(diào)劑用于制備促進多能干細胞分化為神 經(jīng)前體細胞的制劑。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的HDAC3或SMRT下調(diào)劑是干擾HDAC3或SMRT轉(zhuǎn)錄或表達 的試劑。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的HDAC3抑制劑是干擾HDAC3表達的慢病毒載體；或
[0047] 所述的SMRT抑制劑是干擾SMRT表達的慢病毒載體（較佳地，所述的慢病毒載體 中，用于干擾的siRNA序列為SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2)。
[0048] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備神經(jīng)前體細胞的方法，所述方法包括：
[0049] (i)提供一種多能干細胞，該多能干細胞中HDAC3或SMRT的表達或活性被降低； 以維甲酸（RA)誘導(dǎo)培養(yǎng)該多能干細胞，獲得神經(jīng)球；和
[0050] (ii)培養(yǎng)（i)獲得的神經(jīng)球使之成熟，獲得神經(jīng)前體細胞。
[0051] 在一個優(yōu)選例中，利用HDAC3或SMRT下調(diào)劑降低多能干細胞中HDAC3或SMRT的表 達或活性；較佳地，所述的HDAC3或SMRT下調(diào)劑是干擾HDAC3或SMRT轉(zhuǎn)錄或表達的試劑。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，步驟⑴中，維甲酸的用量是2_50μΜ。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，維甲酸的用量是4_30μΜ ;更佳地為5_20μΜ ;如8μΜ，10μΜ， 12 μ Μ, 15 μ Μ〇
[0054] 將多能干細胞處理成500-1000個細胞的小克隆，以添加了維甲酸和組蛋白去乙 醜化酶抑制劑的干細胞維持培養(yǎng)基（feeder-free stem-cell maintenance medium;如 mTeSRl)進行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7±2天（較佳地為7±1天，更佳地為7±0. 5天）。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，步驟（ii)包括：將步驟（i)的細胞處理成含500-1000個細胞的 團塊，在神經(jīng)球培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)11 ±2天（較佳地11 ± 1天）；更佳地，前4±