衍生自前胃胞外基質(zhì)的組織支架的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)源自反芻動(dòng)物前胃的胞外基質(zhì)(ECM)支架。此類(lèi)基質(zhì)可用于許多臨床和治療應(yīng)用，包括傷口修復(fù)、組織再生和乳房重建。此外本發(fā)明的特征還在于從哺乳動(dòng)物器官，包括但不限于反芻動(dòng)物前胃分離ECM支架的方法。該方法包括在組織兩側(cè)產(chǎn)生透壁滲透流。本發(fā)明的特征還在于在各個(gè)ECM薄片之間設(shè)置含有聚合物的層疊ECM支架。該聚合物可任選含有生物活性分子以增強(qiáng)該支架的功能。
【專利說(shuō)明】衍生自前胃胞外基質(zhì)的組織支架
[0001]本發(fā)明專利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/NZ2009/000152，國(guó)際申請(qǐng)日為2009年7月30日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00980130752.7，名稱為“衍生自前胃胞外基質(zhì)的組織支架”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求2008年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/137，367和2009年4月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/172，671的優(yōu)先權(quán)。以上申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。
_4] 發(fā)明背景
[0005]胞外基質(zhì)(ECM)在為組織生長(zhǎng)和再生提供最佳化學(xué)和結(jié)構(gòu)環(huán)境中起重要作用。傳統(tǒng)上從去細(xì)胞化(decellularised)的人和動(dòng)物真皮制備用于組織再生的ECM支架，而所述真皮從各種器官、各種動(dòng)物粘膜下層和基底膜來(lái)源分離。這些支架促進(jìn)組織再生，并且在免疫學(xué)上良好耐受。普通粘膜下層的組織移植組合物源自小腸、膀胱和簡(jiǎn)單的腺胃(參見(jiàn)，例如U.S.4，902，508、U.S.5，554，389和U.S.6，099，567，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文)。
[0006]雖然ECM支架的制備和應(yīng)用中已取得進(jìn)展，但尚未鑒定到理想的支架組合物。理想的支架是非過(guò)敏性、非致癌性、連續(xù)應(yīng)激下在機(jī)械上穩(wěn)定、多孔性足以毛細(xì)管化(capiIIarisation)、能促進(jìn)和引導(dǎo)合適的細(xì)胞和血管內(nèi)生長(zhǎng)、與宿主組織有相似順應(yīng)性、耐感染、不形成血栓、廉價(jià)并能變成原組織的完全功能類(lèi)似物。具有這些特性的ECM支架可用于各種臨床應(yīng)用，包括傷口修復(fù)和軟組織再生。
[0007]發(fā)明概沭
`[0008]本發(fā)明提供源自反芻動(dòng)物前胃的胞外基質(zhì)(ECM)支架，在本文也稱為“前胃基質(zhì)”(FM)支架。本發(fā)明的FM支架提供優(yōu)于現(xiàn)有組織支架的許多優(yōu)點(diǎn)，可用于各種臨床和治療領(lǐng)域，包括傷口修復(fù)和組織再生。此外，本發(fā)明提供從哺乳動(dòng)物器官，包括但不限于反芻動(dòng)物前胃產(chǎn)生ECM支架的改進(jìn)方法。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明FM支架可源自屬于山羊?qū)?Capra)、牛屬(Bos)、鹿屬(Cervus)或綿羊?qū)?Ovis)的反芻動(dòng)物,例如山羊(Capraaegagrus hircus)、牛(Bos taurus)或綿羊(Ovis aries)。
[0009]因此，在第一方面，本發(fā)明的特征在于包含反芻動(dòng)物前胃的固有-粘膜下層(propria-submucosa)的ECM的組織支架(FM支架)。在具體的實(shí)施方式中，所述固有-粘膜下層來(lái)自前胃的瘤胃、網(wǎng)胃或重瓣胃。這些組織支架通常具有浮雕狀內(nèi)腔表面(contouredluminal surface)。本發(fā)明的ECM組織支架還可含有去細(xì)胞化的組織,包括上皮組織、基底膜或肌層和它們的組合。組織支架還可包含一種或多種纖絲蛋白，包括但不限于膠原1、膠原III或彈性蛋白和它們的組合。在其它實(shí)施方式中，組織支架可包含一種或多種生長(zhǎng)因子，包括但不限于:FGF-2、TGFbl、TGFb2或VEGF和它們的組合。在還有其它實(shí)施方式中，所述組織支架可包含一種或多種糖胺聚糖，包括但不限于:透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素及它們的組合。在另一實(shí)施方式中，所述組織支架可包含一種或多種粘連蛋白，包括但不限于膠原IV或?qū)诱尺B蛋白和它們的組合。
[0010]可將本發(fā)明FM支架制成各種形式，例如單一薄片或包含多層FM的層疊薄片。在某些實(shí)施方式中，所述FM支架包含2-15個(gè)層疊薄片?？赏ㄟ^(guò)縫線或縫合線將此類(lèi)層疊薄片結(jié)合在一起?；蛘?，可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)薄片之間的聚合物將層疊薄片結(jié)合在一起。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)縫線或縫合線連接各層疊薄片，并且在一個(gè)或多個(gè)薄片之間還含有聚合物。在另一實(shí)施方式中，層疊組織支架包含設(shè)置在各層疊薄片之間的聚合物。聚合物可以散布在薄片之間，或者可以聚合物層的形式均勻分散。本發(fā)明FM支架中可利用任何合適的聚合物，包括但不限于:膠原、殼聚糖、藻酸鹽、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素和它們的組合。
[0011]在【具體實(shí)施方式】中，聚合物還包含生物活性分子，例如小分子或肽。生物活性分子可以非共價(jià)摻入聚合物，例如，作為混懸液、包封成顆粒、微粒或膠體，或作為它們的組合物。也可采用連接生物活性分子與聚合物的任何合適的化學(xué)方法將生物活性分子共價(jià)摻入聚合物。生物活性分子可以是任何治療所需的分子，例如生長(zhǎng)因子、抗微生物劑、鎮(zhèn)痛劑、止血?jiǎng)⒋傺苌蓜┗蚩寡苌蓜?。在示范性?shí)施方式中，聚合物包含F(xiàn)GF2、NGF、多西環(huán)素、阿莫西林和聚-L-賴氨酸中的一種或多種。
[0012]在另一【具體實(shí)施方式】中，F(xiàn)M支架的寬度為至少10cm。例如，所述支架的寬度為至少10cm，長(zhǎng)度為至少10cm。因此，某些FM支架可具有IOOcm2以上，例如400cm2的表面積。在一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)M支架的單一或?qū)盈B薄片是穿孔的。在另一實(shí)施方式中，F(xiàn)M經(jīng)流化或微粉化。
[0013]本發(fā)明FM支架的雙軸強(qiáng)度通常高于其它胃腸或泌尿生殖來(lái)源的支架。因此，在具體的實(shí)施方式中，F(xiàn)M支架的平均雙軸強(qiáng)度為至少80N或更高。
[0014]本發(fā)明的組織支架可用于多種領(lǐng)域，包括但不限于:覆蓋組織缺陷(tissued e f i c i t)或加強(qiáng)軟組織。在具體的實(shí)施方式中，所述組織缺陷或軟組織的寬度為至少I(mǎi)Ocm0在另一實(shí)施方式中，所述組織缺陷或軟組織的寬度為至少10cm，長(zhǎng)度為至少10cm。在還有另一實(shí)施方式中，所述組織缺陷或軟組織的表面積為至少100cm2。
`[0015]因此，一方面，本發(fā)明的特征在于誘導(dǎo)受損組織修復(fù)的方法，包括使該受損組織接觸本發(fā)明FM支架，例如，包含反芻動(dòng)物固有-粘膜下層的ECM的支架。本發(fā)明的特征還在于刺激軟組織再生的方法，包括使該軟組織接觸本發(fā)明FM支架。
[0016]當(dāng)FM支架與組織接觸時(shí)，該FM支架能增加位于該支架附近的細(xì)胞增殖。此外，F(xiàn)M支架可促進(jìn)其所粘附的組織內(nèi)的血管化。因此，在另一方面，本發(fā)明提供刺激組織中細(xì)胞增殖的方法，包括使該組織接觸FM支架，從而刺激細(xì)胞增殖。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)組織的血管化的方法，包括使該組織接觸FM支架，從而在該組織內(nèi)發(fā)生血管化。
[0017]一方面，本發(fā)明的特征在于支持患者的乳房組織的可植入組織支架器件，其中所述器件包含反芻動(dòng)物前胃的固有-粘膜下層的胞外基質(zhì)。所述乳房組織可包含乳房假體，即乳房植入物。可將所述組織支架器件制成包含兩層或多層胞外基質(zhì)的層疊薄片。在具體的實(shí)施方式中，層疊薄片包含2-15層胞外基質(zhì)。
[0018]所述組織支架器件可以是平的，或者其可具有一定凹度。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)縫線或縫合線將所述器件的各層胞外基質(zhì)固定在一起。所述胞外基質(zhì)可以穿孔或不穿孔。在一些實(shí)施方式中，所述器件具有月牙形形狀。在其它實(shí)施方式中，所述器件具有橢圓形狀。
[0019]在另一方面，本發(fā)明提供支持患者的乳房組織的方法，包括將前述組織支架器件安置在該患者中相對(duì)于乳房組織的支持位置。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述乳房組織包含乳房假體。在另一實(shí)施方式中，所述乳房組織包含天然組織。在具體的實(shí)施方式中，安置組織支架包括覆蓋乳房組織的下部和側(cè)部。
[0020]在另一方面，本發(fā)明提供通過(guò)安置在各薄片間的聚合物層疊的包含兩個(gè)或更多個(gè)胞外基質(zhì)薄片的組織支架。所述支架可包含選自下組的組織的粘膜下層的胞外基質(zhì):小腸、胃、膀胱、心包和真皮。在具體的實(shí)施方式中，所述胞外基質(zhì)包含膠原。所述聚合物可包含膠原、殼聚糖、藻酸鹽、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素和它們的組合。
[0021]在以上方面的【具體實(shí)施方式】中，所述聚合物還包含生物活性分子。所述生物活性分子可以非共價(jià)或共價(jià)連接于聚合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物活性分子可以是小分子或肽，例如生長(zhǎng)因子、抗微生物劑、鎮(zhèn)痛劑、止血?jiǎng)?、促血管生成劑、抗血管生成劑或它們的組合。示范性生物活性分子包括FGF2、NGF、多西環(huán)素、聚-L-賴氨酸和它們的組合。
[0022]在還有另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)將組織整體或其一部分內(nèi)的諸層分離和/或去細(xì)胞化而產(chǎn)生ECM組織支架的方法。所述方法包括在所述組織的兩側(cè)產(chǎn)生透壁滲透流，從而將組織整體或其一部分內(nèi)的諸層分離和/或去細(xì)胞化?？蓪⑼副跐B透流從組織整體或其一部分的內(nèi)腔引向外腔側(cè)(abluminal side)。這可通過(guò),例如將組織在高滲和低滲溶液之間分開(kāi)而實(shí)現(xiàn)，從而將透壁滲透流從低滲溶液引向高滲溶液。該方法還包括除去組織層的整體或其一部分，所述組織層包括上皮組織、基底膜或肌層和它們的組合。
[0023]在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括將第一溶液包封在器官或組織(或其一部分)內(nèi)，并將該器官或組織(或其一部分)浸入相對(duì)于第一溶液高滲的第二溶液內(nèi)。該方法還包括從第二溶液中取出該器官或組織，并將該器官或組織或其一部分浸入相對(duì)于第一溶液也是高滲的第三溶液中，以便例如使該組織進(jìn)一步去細(xì)胞化。
[0024]在備選實(shí)施方式中，所述方法包括將第一溶液包封在器官或組織(或其一部分)內(nèi)，并將該器官或組織(或其一部分)浸入相對(duì)于第一溶液低滲的第二溶液內(nèi)，任選隨后將該器官或組織或其一部分浸入`相對(duì)于第一溶液也是低滲的第三溶液中。
[0025]高滲和低滲溶液可包含，例如水和任選的至少一種緩沖液、洗滌劑或鹽。高滲溶液含有的溶質(zhì)濃度可高于低滲溶液。在具體的實(shí)施方式中，高滲溶液包含4M NaCl，低滲溶液包含0.028%Triton X-200和0.P/oEDTA。在另一【具體實(shí)施方式】中，低滲溶液包含0.1%SDS。在還有另一實(shí)施方式中，低滲溶液包含0.028%Triton X_200、0.1%EDTA和0.1%SDS。
[0026]可在低溫，例如4 V或更低(例如，約2 °C -約4°C )實(shí)施本發(fā)明方法。還可在室溫下或接近室溫(例如，約18°C -約24°C )實(shí)施本發(fā)明方法。所述方法使組織層分離和去細(xì)胞化的時(shí)間還可能短于采用其它方法的時(shí)間。在【具體實(shí)施方式】中，在36個(gè)小時(shí)或更短、更優(yōu)選在24個(gè)小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)使組織層分離和去細(xì)胞化。在其它實(shí)施方式中，在6小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)(例如，5小時(shí)或更短、4小時(shí)或更短或3小時(shí)或更短)使組織層分離和去細(xì)胞化。
[0027]本發(fā)明方法可用于任何合適的組織來(lái)源或器官。在具體的實(shí)施方式中，組織包含角化復(fù)層鱗狀上皮。在其它具體的實(shí)施方式中，組織源自反芻動(dòng)物，例如山羊?qū)?Capra)、牛屬(Bos)、鹿屬(Cervus)或綿羊?qū)?Ovis)動(dòng)物的前胃。在還有其它實(shí)施方式中，組織源自前胃的瘤胃、網(wǎng)胃或重瓣胃。此類(lèi)組織可任選膨脹以增加穿過(guò)組織層的透壁滲透流，從而進(jìn)一步促進(jìn)分離和去細(xì)胞化。[0028]附圖簡(jiǎn)沭
[0029]圖1是(A)前胃壁和⑶腺胃壁的示意性剖面圖，均處于未處理狀態(tài)和STOF處理后。
[0030]圖2顯示用于乳房增大、重塑或乳房固定術(shù)的FM支架的兩個(gè)示范性形狀。㈧描述了月牙形支架。(B)描述橢圓形支架。
[0031]圖3顯示通過(guò)產(chǎn)生穿過(guò)器官的透壁滲透流來(lái)處理該器官的一個(gè)實(shí)施方式。
[0032]圖4描述了采用STOF處理組織以產(chǎn)生含斷裂基底膜的去細(xì)胞化FM支架的示范性實(shí)施方式。
[0033]圖5顯示STOF處理前后組織的總核酸含量。
[0034]圖6顯示前胃組織的表面積與STOF處理后前胃總?cè)莘e之間的線性關(guān)系。
[0035]圖7顯示透壁滲透流造成的組織重量改變。隨著組織水合增加，流體穿過(guò)并進(jìn)入組織造成重量增加。
[0036]圖8顯示STOF處理完成時(shí)STOF溶液中層粘連蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)。在圖8中，泳道I表示Magic標(biāo)記(InvitrogenTM);泳道2表示STOF方法完成后從前胃外側(cè)取得的0.028% Triton X-200溶液的樣品；泳道3表示STOF方法完成后從前胃內(nèi)側(cè)取得的4Μ NaCl溶液的樣品；泳道4表示STOF方法完成后從前胃外側(cè)取得的0.028% TritonX-200+0.1 % EDTA溶液的 樣品；泳道5表示STOF方法完成后從前胃外側(cè)取得的0.1% SDS溶液的樣品；泳道6表示層粘連蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0037]圖9顯示球爆檢驗(yàn)(Ball Burst test)的結(jié)果,顯示了 FM的相對(duì)強(qiáng)度。
[0038]圖10圖示了多疊層綿羊FM產(chǎn)品的球爆強(qiáng)度。采用球爆檢驗(yàn)測(cè)定單一或多疊層綿羊FM產(chǎn)品的雙軸強(qiáng)度，該檢驗(yàn)按照ASTM D3797-89“編織物破裂強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法:恒速穿越(CRT)球爆檢驗(yàn)(Standard Test Method for Bursting Strength of Knitted Goods,Constant-Rate-of-Traverse (CRT) Bal 1-burst Test) ”，利用裝有球爆壓縮箱(ball-burstcompression cage)的Instron5800系列機(jī)電檢測(cè)器，從而將25.4mm不鎊鋼球以305+/-13毫米/分鐘的進(jìn)料速度推向測(cè)試材料，直至衰壞。利用IkN測(cè)壓儀記錄衰壞時(shí)的最大壓縮負(fù)載(N)。誤差棒代表至少5份樣品的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0039]圖11比較了 4-疊層綿羊FM與市售可得移植物產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化最大壓縮負(fù)載。誤差棒代表至少5份樣品，或公布數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0040]圖12代表單軸檢驗(yàn)的結(jié)果，顯示了 FM的相對(duì)強(qiáng)度。
[0041]圖13比較了綿羊FM單一和多疊層產(chǎn)物的強(qiáng)度。(A)衰壞時(shí)的最大負(fù)載(N)；⑶最大切線剛度(N/mm) ；(C)最大伸長(zhǎng)(mm) ； (D)彈性模量(楊氏)(GPa) ； (E)屈服應(yīng)力(MPa)；和(F)厚度。利用Instron5800系列機(jī)電檢測(cè)器測(cè)定衰壞時(shí)單一和多疊層產(chǎn)物的最大負(fù)載。將各種材料切割成0.6cm寬的狗-骨形樣品。夾住樣品，量器長(zhǎng)度為7.5cm,以25.4毫米/分鐘的速度伸長(zhǎng)直至衰壞。利用500N測(cè)壓儀記錄負(fù)載(N)。從負(fù)載(N)與伸長(zhǎng)(mm)曲線的斜率計(jì)算剛度。利用從產(chǎn)物厚度計(jì)算的截面積將負(fù)載與伸長(zhǎng)曲線轉(zhuǎn)化為應(yīng)力(N/m2)與應(yīng)變曲線。后一曲線的斜率用于計(jì)算彈性模量或楊氏模量(GPa)。誤差棒代表至少5份樣品的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0042]圖14比較了 1-和2-疊層綿羊FM產(chǎn)物與市售可得硬腦膜修復(fù)產(chǎn)品的屈服應(yīng)力。誤差代表至少5份樣品，或公布數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。[0043]圖15比較了多疊層綿羊FM產(chǎn)物的縫合保留強(qiáng)度(suture retention strength)。按照ANSI/AAMI VP20 - 1994牛頓檢測(cè)心血管植入物血管假體的指南(Guidelines forCardiovascular Implants Vascular Prostheses Measured in Newton’s)來(lái)檢驗(yàn)多疊層綿羊FM產(chǎn)物的縫合保留強(qiáng)度。利用2mm咬合深度(bite-depth)的縫線在4cm x2.5cm樣品中進(jìn)行縫合。利用裝有IOON測(cè)壓儀的InstrOn5800系列機(jī)電檢測(cè)器記錄衰壞時(shí)的負(fù)載，采用的前進(jìn)速度是100毫米/分鐘。將衰壞時(shí)的負(fù)載定義為觀察到的負(fù)載有90%降低。樣品的自由端維持在25_虎鉗夾口中，而縫線通過(guò)不銹鉤連接于相對(duì)的夾鉗。誤差棒代表至少6份樣品的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0044]圖16比較了綿羊FM產(chǎn)物和硬腦膜修復(fù)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化縫合保留強(qiáng)度。誤差代表至少5份獨(dú)立樣品，或公布數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0045]圖17比較了 4-疊層綿羊FM產(chǎn)物和市售可得植入物基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化縫合保留強(qiáng)度。誤差代表至少5份樣品，或公布數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。Surgisis?未有誤差報(bào)道。采用IOmm的咬合深度檢驗(yàn)Alloderm?和Strattice?,采用2mm的咬合深度檢驗(yàn)4-疊層綿羊FM和Surgisis?。
[0046]圖18顯示在豬傷口愈合研究中，在豬背上作出的全厚度切口的示例性布局。
[0047]圖19顯示傷口愈合研究期間，組織活檢中ECM支架的持久性。
[0048]圖20圖示了傷口愈合期間對(duì)細(xì)胞增殖的定量測(cè)定。用綿羊FM(1_疊層、2-疊層)、SIS處理受傷的組織，或不作處理，采用IHC和數(shù)字方法計(jì)算從再生真皮層獲得的3個(gè)40x框中的Ki67-陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)。#Ρ〈0.01采用單向AN0VA，相對(duì)于未處理對(duì)照的顯著性。
[0049]圖21圖示了定量測(cè)定 用綿羊FM(1_疊層和2-疊層)、SIS處理的受傷組織，或不作處理的受傷組織中的血管。(A)描述了對(duì)各組織活檢分析的每框中計(jì)算的平均血管總數(shù)。誤差棒代表了在所示時(shí)間點(diǎn)對(duì)各處理組作分析的20次活檢的標(biāo)準(zhǔn)誤差。**Ρ〈0.01和*Ρ〈0.05采用單向AN0VA，相對(duì)于未處理對(duì)照的顯著性。(B)描述了在所示時(shí)間點(diǎn)，血管(小的、中等的和大的)數(shù)與各次處理觀察到的血管總數(shù)的比例。(C)描述了每框中計(jì)算的小血管(300 - 500 μ m2)的平均數(shù)。取所研究的5只動(dòng)物分析的所有框的平均數(shù)。誤差棒代表了在所示時(shí)間點(diǎn)各處理組的20個(gè)分析框的標(biāo)準(zhǔn)誤差。(D)描述了每框中計(jì)算的中等血管(500 - 1500 μ m2)的平均數(shù)。取所研究的5只動(dòng)物分析的所有框的平均數(shù)。誤差棒代表了在所示時(shí)間點(diǎn)各處理組的20個(gè)分析框的標(biāo)準(zhǔn)誤差。(E)描述了每框中計(jì)算的大血管(>1500 μ m2)的平均數(shù)。取所研究的5只動(dòng)物分析的所有框的平均數(shù)。誤差棒代表了在所示時(shí)間點(diǎn)各處理組的20個(gè)分析框的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0050]發(fā)明詳沭
[0051]本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)源自反芻動(dòng)物前胃的固有-粘膜下層的胞外基質(zhì)(ECM)支架(FM支架)，本文稱為“前胃基質(zhì)”(FM)。FM支架的特征不同于源自包括腺胃在內(nèi)的其它器官的ECM支架。這些特征使得FM支架尤其適用于涉及組織再生和修復(fù)的臨床應(yīng)用。本發(fā)明還涉及從哺乳動(dòng)物器官(包括但不限于前胃)產(chǎn)生ECM支架的改進(jìn)方法。
[0052]1.定義
[0053]為更易于理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。
[0054]本文所用的術(shù)語(yǔ)“前胃基質(zhì)”(縮寫(xiě)為FM)指含有反芻動(dòng)物前胃的固有-粘膜下層的ECM支架。[0055]本文所用的術(shù)語(yǔ)“固有-粘膜下層”指反芻動(dòng)物前胃中的固有膜和粘膜下層組合形成的組織結(jié)構(gòu)。
[0056]本文所用的術(shù)語(yǔ)“固有膜”指固有-粘膜下層的內(nèi)腔部分，包括胞外基質(zhì)的致密層。
[0057]本文所用的術(shù)語(yǔ)“反芻動(dòng)物”指具有四室胃的哺乳動(dòng)物。這些室包括前胃，由瘤胃、網(wǎng)胃或重瓣胃組成，以及稱為皺胃的第四室。反芻動(dòng)物的非限制性例子包括屬于山羊?qū)?Capra)、牛屬(Bos)、鹿屬(Cervus)或綿羊?qū)?Ovis)的哺乳動(dòng)物。
[0058]本文所用的術(shù)語(yǔ)“源自”指ECM的組織來(lái)源或起源。ECM可源自組織的整體或其一部分，從而它們保留該組織的至少一種組分，例如固有-粘膜下層。
[0059]本文所用的術(shù)語(yǔ)“固有-粘膜下層”指反芻動(dòng)物前胃壁的一部分，由固有膜和粘膜下層構(gòu)成。
[0060]本文所用的術(shù)語(yǔ)“封閉透壁滲透流”(STOF)指使組織或器官的各層去細(xì)胞化和/或分離的方法，其中穿過(guò)該組織或器官壁的整體或一部分產(chǎn)生透壁滲透流。
[0061]本文所用的術(shù)語(yǔ)“高滲”指溶質(zhì)濃度高于另一溶液的溶液。
[0062]本文所用的術(shù)語(yǔ)“低滲”指溶質(zhì)濃度低于另一溶液的溶液。
[0063]本文所用的術(shù)語(yǔ)“分層”指分開(kāi)組織或器官內(nèi)的各層。
[0064]本文所用的術(shù)語(yǔ)“去細(xì)胞化”指從組織或器官的一部分，例如ECM中去除細(xì)胞和它們相關(guān)的碎片。
[0065]本文所用的術(shù)語(yǔ)“乳房重建`”指打算改變患者乳房的大小、形狀、位置或外觀的任何方法。此類(lèi)方法包括但不限于:乳房增大、乳房固定術(shù)(即，乳房提升)和乳房切除術(shù)后重建。
[0066]以下各個(gè)小章節(jié)進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明的各方面。除非另有限定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的意義。如有沖突，以本發(fā)明(包括定義)為準(zhǔn)。雖然可采用與本文所述那些相似或等價(jià)的方法和材料來(lái)實(shí)施本發(fā)明，但以下描述了合適方法和材料的例子。本文所述材料、方法和實(shí)例僅是說(shuō)明性而非限制性的。本文引述的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全文納入本文。
[0067]I1.解剖反芻動(dòng)物的前胃
[0068]反芻動(dòng)物(例如，牛、綿羊和山羊)具有復(fù)合式的胃，與其它哺乳動(dòng)物的簡(jiǎn)單胃相比，區(qū)別在于該復(fù)合式胃實(shí)質(zhì)上更大且分成4個(gè)部分:瘤胃、網(wǎng)胃、重瓣胃和皺胃。這些部分各自具有不同的物理和組織學(xué)結(jié)構(gòu)。瘤胃、網(wǎng)胃和重瓣胃統(tǒng)稱前胃。瘤胃和網(wǎng)胃的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，常稱為瘤網(wǎng)胃(rumenoreticulum)。僅有該復(fù)合式胃的最后一室，即皺胃的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于簡(jiǎn)單的腺胃。前胃和簡(jiǎn)單腺胃之間的解剖學(xué)差異反映出它們的功能差異。前胃的基本功能是儲(chǔ)存、發(fā)酵和吸收，而簡(jiǎn)單腺胃執(zhí)行分泌和消化功能。
[0069]因此，前胃的總體解剖學(xué)和組織學(xué)特征顯著不同于腺胃。前胃的解剖學(xué)特征示于圖1A，腺胃的示于圖1B。重要的是，前胃不含有腺體粘膜，而是由非腺體角化復(fù)層鱗狀上皮構(gòu)成，其由角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層構(gòu)成，在許多方面類(lèi)似于皮膚的結(jié)構(gòu)。上皮位于前胃的內(nèi)腔側(cè)，通過(guò)基底膜與其下的固有-粘膜下層分開(kāi)。前胃的外腔側(cè)含有稱為肌層的肌肉層。[0070]上述胃粘膜下層組成源自腺胃壁，其含有以下各層:粘膜(包括上皮層，網(wǎng)狀或細(xì)小蜂窩狀組織構(gòu)成的固有層和腺體層)、粘膜下層(有蜂窩狀組織構(gòu)成并缺乏腺體)、肌層(由三層肌肉組成)和漿膜(圍繞肌肉層的松散結(jié)締組織外的間皮層)。胃壁內(nèi)存在腺體層是單胃哺乳動(dòng)物的腺胃或簡(jiǎn)單胃的特征。反芻動(dòng)物的復(fù)合式胃中僅有最后一室，即，皺胃含有該腺體層。前胃和腺胃的其它特征描述于表1。
[0071]表1.前胃和腺胃的特征
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種將組織整體或其一部分內(nèi)的諸層分離或去細(xì)胞化的方法，包括在所述組織的兩側(cè)之間產(chǎn)生透壁滲透流，從而將組織整體或其一部分內(nèi)的諸層分離或去細(xì)胞化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，從所述組織的內(nèi)腔到非內(nèi)腔側(cè)產(chǎn)生透壁滲透流。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括除去選自下組的組織層的整體或其一部分:上皮組織、基底膜、肌層和它們的組合。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織包含角化復(fù)層鱗狀上皮。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟:將第一溶液包封在組織或其一部分內(nèi)，并將該組織或其一部分浸入相對(duì)于第一溶液高滲的第二溶液內(nèi)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟:從所述第二溶液中取出該組織或其一部分，并將該組織或其一部分浸入相對(duì)于第一溶液也是高滲的第三溶液中。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟:將第一溶液包封在組織或其一部分內(nèi)，并將該組織或其一部分浸入相對(duì)于第一溶液低滲的第二溶液內(nèi)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟:從所述第二溶液中取出該組織或其一部分，并將該組織或其一部分浸入相對(duì)于第一溶液也是低滲的第三溶液中。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含水，任選包含至少一種緩沖液、洗滌劑或鹽。
10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第一溶液包含4MNaCl。
11.如權(quán)利要求10所述的`方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.028%Triton X-200和0.1%EDTA，所述第三溶液包含0.028%SDSo
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.1%SDS，所述第三溶液包含 0.028%Triton X-200 和 0.P/oEDTA。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在2°C-4°C的溫度下進(jìn)行不到36個(gè)小時(shí)。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在4°C下進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)行不到24小時(shí)。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.028%Triton X-200、0.1%EDTA 和 0.1%SDSο
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法在18°C_24°C的溫度下進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)行不到6小時(shí)。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織或其一部分膨脹以增加所述透壁滲透流。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織是整個(gè)器官或其一部分。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織源自反芻動(dòng)物的前田冃?
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述組織是瘤胃。
23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述反芻動(dòng)物屬于選自下組的屬:山羊?qū)?、牛屬、鹿屬和綿羊?qū)佟?br> 24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述反芻動(dòng)物是綿羊。
25.按照權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述方法產(chǎn)生的組織支架。
26.一種形成組織支架的方法，包括實(shí)施權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的方法。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述組織支架包含反芻動(dòng)物前胃的固有-粘膜下層的胞外基質(zhì)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述固有-粘膜下層來(lái)自瘤胃。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述組織支架還包含選自下組的去細(xì)胞化組織:上皮、基底膜、肌層和它們的組合。
30.如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織支架還包含選自下組的纖絲蛋白:膠原1、膠原II1、彈性蛋白和它們的組合。
31.如權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織支架還包含選自下組的生長(zhǎng)因子:FGF-2、TGFbl、TGFb2、VEGF和它們的組合。
32.如權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織支架還包含選自下組的糖胺聚糖:透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素及它們的組合。
33.如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織支架還包含選自下組的粘連蛋白:纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原IV和它們的組合。
34.如權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)`所述的方法，其特征在于，所述組織支架具有浮雕狀內(nèi)腔表面。
35.如權(quán)利要求27-34中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織支架制成單一或?qū)盈B的薄片。
36.如權(quán)利要求27-35中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織支架包含2-12個(gè)層疊的薄片。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述組織支架在兩個(gè)或更多個(gè)層疊薄片之間還包含聚合物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述聚合物選自下組:膠原、殼聚糖、藻酸鹽、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素和它們的組合。
39.如權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述聚合物還包含生物活性分子。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子分散在整個(gè)聚合物層中。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子非共價(jià)連接于所述聚合物。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子共價(jià)連接于所述聚合物。
43.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子是小分子或多肽。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子選自下組:生長(zhǎng)因子、抗微生物劑、鎮(zhèn)痛劑、止血?jiǎng)?、促血管生成劑、抗血管生成劑和它們的組合。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子選自下組:FGF2、NGF、多西環(huán)素、聚-L-賴氨酸和它們的組合。
46.如權(quán)利要求36-45中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述層疊的薄片通過(guò)縫線或縫合線固定在一起。
47.如權(quán)利要求27-46中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述薄片的寬度是至少I(mǎi)Ocm,長(zhǎng)度是至少10cm。
48.如權(quán)利要求27-47中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述薄片的平均破裂強(qiáng)度是至少80N。
49.如權(quán)利要求27-48中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述反芻動(dòng)物屬于選自下組的屬:山羊?qū)?Capra)、牛屬(Bos)、鹿屬(Cervus)和綿羊?qū)?Ovis)。
50.如權(quán)利要求27-4 9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述反芻動(dòng)物是綿羊。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK103751842SQ201310549035
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2008年7月30日
【發(fā)明者】K·D·約翰遜, B·C·H·梅, B·R·沃德 申請(qǐng)人:米辛瑟斯有限公司