一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法，具體的為，所述滴眼液其包括以下重量份組分：Lifitegrast 1?20份、硫酸類肝素0.1?5份、玻璃酸鈉1?10份、生長因子0.01?0.1份、膠原蛋白0.1?1份和水200?500份。一旦角膜受到損傷，本發(fā)明制備的仿細胞外基質(zhì)滴眼液能通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)生物功能，修復(fù)角膜細胞通信通道，達到調(diào)節(jié)修復(fù)角膜的生理功能。
【專利說明】
-種仿細胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細胞外基質(zhì)（糾化日。日11111日1'111日付;[義(3,6〔1)是由動物細胞合成并分泌到胞外、分 布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。運些物質(zhì)構(gòu)成復(fù) 雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。細胞外基質(zhì)是動 物組織的一部分，不屬于任何細胞。它決定結(jié)締組織的特性，為細胞的生存及活動提供適宜 的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。胞外基質(zhì)不 僅靜態(tài)的發(fā)揮支持、連接、保水、保護等物理作用，而且動態(tài)的對細胞產(chǎn)生全方位影響，例 如，為細胞提供支持和固定、提供組織間的分離方法、調(diào)節(jié)細胞間的溝通。此外細胞外間質(zhì) 還吸收了多種細胞生長因子和蛋白酶。當(dāng)生理條件變化時，激活蛋白酶而釋放運些細胞因 子，而無需從頭合成運些因子，從而迅速激活細胞功能。
[0003] 硫酸類肝素廣泛存在于細胞膜、胞外基質(zhì)和某些細胞器中，它們能夠與各種細胞 因子相結(jié)合，調(diào)節(jié)它們在胞外基質(zhì)中的產(chǎn)生和維持過程，控制它們的分布和壽命，如與趨化 因子IL-8相互作用將促進其活性;硫酸肝素蛋白多糖對典型的成纖維細胞生長因子信號是 一種有效的輔因子是目前公認(rèn)的結(jié)論。肝素在1985年被發(fā)現(xiàn)其可W增強成纖維細胞生長因 子1的生物學(xué)活性。并在1991年首次證明它可直接提升成纖維細胞生長因子受體結(jié)合力和 活性。此外，硫酸類肝素還可W和胞外基質(zhì)中的多種蛋白質(zhì)相結(jié)合，控制它們的分布、轉(zhuǎn)移 和信息傳遞，誘導(dǎo)修復(fù)細胞外基質(zhì)通道。
[0004] 細胞生長因子是指具有促進細胞增殖分裂作用的細胞因子。細胞生長因子通常W 一定含量維持角膜組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。當(dāng)角膜組織受損后，其分泌量發(fā)生變化，從而引起對角 膜層細胞增殖、分化、移行的促進或抑制作用。國內(nèi)有報道認(rèn)為當(dāng)角膜損傷后局部生長因子 不能滿足修復(fù)需要時給予適宜濃度的生長因子滴眼能通過刺激角膜上皮細胞及基質(zhì)成纖 維細胞的增生，移動促進細胞外基質(zhì)與膠原纖維增生使損傷加快修復(fù)。
[0005] 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)是目前已知的最大的生 長因子家族之一，對促進成纖維細胞的代謝和膠原蛋白的形成發(fā)揮著重要功能，能維持祖 細胞并介導(dǎo)祖細胞的生長、分化、存活和形態(tài)。成纖維細胞生長因子通過與特異的、高親和 的細胞膜受體結(jié)合調(diào)節(jié)細胞生長和其他功能，W此重新激活細胞外基質(zhì)信號通路介導(dǎo)代謝 功能、組織修復(fù)和再生。能促進與皮膚損傷有關(guān)細胞的迅速生長繁殖，并調(diào)節(jié)細胞間基質(zhì)的 合成、分泌及分解;促進角膜上皮細胞的再生、修復(fù)，主要用來治療角膜炎和各種角膜損傷。
[0006] 玻璃酸鋼又名透明質(zhì)酸鋼(Sodium Hyalu;ronate,HA-化)是唯一不發(fā)生硫酸化的 氨基聚糖。透明質(zhì)酸作為機體結(jié)締組織細胞外基質(zhì)成分之一，具有良好的生物相容性、無抗 原性、可吸收降解等特性，是一種理想的天然生物材料。玻璃酸鋼廣泛存在于人體內(nèi)，在眼 玻璃體、房水、皮膚、關(guān)節(jié)滑液、廝帶等處均有分布。玻璃酸鋼高度親水，可形成水膜覆蓋于 眼表面上，與蛋白類分子結(jié)合，通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)活性促進角膜上皮細胞的連接和伸展， 從而促進結(jié)膜創(chuàng)傷、角膜上皮細胞的修復(fù)，高濃度的玻璃酸鋼效果更顯著。另外玻璃酸鋼對 眼具有保濕和潤滑作用。
[0007]角膜是一種無血管的透明組織，由上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層組成。角膜損傷的誘因 有化學(xué)、機械、激光等，其病理機制除了直接損傷作用外，免疫系統(tǒng)的參與也起著非常重要 的作用，免疫炎性細胞和免疫分子相互作用，形成復(fù)雜的免疫炎癥網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)角膜損傷的病 理變化。近年來由于角膜外傷的增多，加之廣譜抗生素、皮質(zhì)類固醇在臨床上的廣泛應(yīng)用及 角膜接觸鏡的使用增多，導(dǎo)致角膜炎的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，目前常見的治療方法為 使用抗生素類滴眼液，包括氯霉素滴眼液、紅霉素滴眼液及W左氧氣沙星為代表的第4代哇 諾酬類滴眼，但是濫用抗生素滴眼液的后果非常嚴(yán)重，首先使病原菌耐藥性增加，臨床療效 降低，造成疾病久治不愈，其次是抗生素本身及其輔助成分一定程度上會影響眼睛的正常 生理環(huán)境，干擾角膜上皮的正常代謝，甚至加重原有的病情，不能長期使用。因此需要開發(fā) 一種生物安全性高、效果明顯、使用方便的滴眼液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明主要提供了一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法，一旦角膜受到損傷， 能通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)生物功能，修復(fù)角膜細胞通信通道，達到調(diào)節(jié)修復(fù)角膜的生理功能。 [0009]其技術(shù)方案如下：一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分： Lifitegrast 1-20份、硫酸類肝素0.1-5份、玻璃酸鋼1-10份、生長因子0.01-0.1份、膠原蛋 白0.1-1份和水200-500份。
[0010] -種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 5-10份、硫酸類 肝素1-3份、玻璃酸鋼4-7份、生長因子0.5-0.07份、膠原蛋白0.4-0.6份和水300-400份。
[0011] 優(yōu)選的，所述滴眼液的抑為5.5-7.5，采用憐酸鹽緩沖液和/或棚酸緩沖液調(diào)節(jié)，采 用憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)時，憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液W任意比例混溶。
[0012] 優(yōu)選的，所述滴眼液的滲透壓為280-350m0sm/L，采用氯化鋼和/或氯化鐘調(diào)節(jié)，氯 化鋼的質(zhì)量濃度為0.3-0.8%，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.1-0.3%，采用氯化鋼和氯化鐘調(diào)節(jié) 時，氯化鋼和氯化鐘W任意比例混溶。
[0013] 優(yōu)選的，硫酸類肝素提取自天然成分或采用細菌發(fā)酵法制得，硫酸類肝素的濃度 為0.5-50mg/ml。
[0014] 優(yōu)選的，生長因子濃度為lOOO-lOOOOIU/ml，生長因子選自表皮生長因子、成纖維 細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胎盤生長因子中的一種或幾種。
[0015] 優(yōu)選的，生長因子濃度為2000-6000IU/ml，生長因子采用表皮生長因子:成纖維細 胞生長因子:堿性成纖維細胞生長因子:胎盤生長因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而 成。
[0016] Lifitegrast的化學(xué)名為N-[ [2-(6-苯并巧喃甲酯基）-5,7-二氯-1，2,3,4，-四氨 異哇嘟-6-基]甲酯基]-3-甲橫酷基-L-苯基丙氨酸，分子式：C2姐24C12N207S，CAS號： 1025967-78-5，結(jié)構(gòu)式如下式（I)所示：
[0017]
[001引 Lifitegrast屬于淋己細胞功能相關(guān)抗原-ULFA-1)括抗劑。LFA-1是存在于白細 胞表面的一種蛋白。在干眼癥中，ICAM-1在角膜和結(jié)膜組織中過量表達。LFA-l^CAM-l相互 作用促進免疫突觸的形成，導(dǎo)致T細胞激活并遷移至目標(biāo)組織。Lifitegrast作用于LFA-1， 括抗LFA-1與ICAM-1的相互作用，從而避免T細胞的產(chǎn)生、遷移，從而達到治療干眼的效果。
[0019] 優(yōu)選的，玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā)酵法制得，玻璃酸鋼分子量為40-150wDa。
[0020] -種仿細胞外基質(zhì)滴眼液的制備方法，包括W下步驟：
[0021] (1)先稱取配方量的氯化鋼和/或氯化鐘，加入40-60%體積的注射用水中，攬拌使 完全溶解，用0.2μπι的濾膜過濾除菌，收集濾液；
[0022] (2)稱取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，適宜溫度下攬拌，直至玻璃酸鋼完全溶 解；
[0023] (3)稱取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0024] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類肝素和生長因子，加 憐酸鹽緩沖液和/或棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，無菌條件下灌裝即可。
[00巧]優(yōu)選的，步驟(2)中攬拌時間為3-化，轉(zhuǎn)速100-20化pm，溫度15-30 Γ。
[0026] 采用上述仿細胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法，本發(fā)明具有W下優(yōu)點：
[0027] 本發(fā)明中的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其組分是眼膜細胞外基質(zhì)固有成分，一旦角膜 受到損傷，能通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)生物功能，修復(fù)角膜細胞通信通道，達到調(diào)節(jié)修復(fù)角膜的 生理功能。目前做的Lifitegrast、硫酸類肝素、生長因子、膠原蛋白及玻璃酸鋼量效關(guān)系研 究中，結(jié)果顯示，五種藥物聯(lián)合治療頑固性角膜上皮損傷、各種原因的角膜上皮病變、角膜 炎可起到高效用藥效果。
[0028] 本發(fā)明的滴眼液模擬角膜細胞外基質(zhì)組成，不僅能各自發(fā)揮療效，由于協(xié)同作用， 能使藥物長時間停留于眼角膜損傷表面，延長藥物作用時間，大大增強對眼角膜的修復(fù)、保 護作用，提高療效，安全性高，制備方法簡單，不含防腐劑，能長期使用，大大滿足目前臨床 對此類滴眼液的需求。
【附圖說明】
[0029] 圖1為藥效學(xué)實驗1中早期角膜上皮愈合與晚期角膜愈合率比較示意圖；
[0030] 圖2為藥效學(xué)實驗1中上皮破損率比較示意圖。
【具體實施方式】
[0031] -、具體實施例
[0032] 實施例1
[0033] 1.滴眼液配方
[0034] 一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 8份、0.5mg/ml 的硫酸類肝素2份、150wDa的玻璃酸鋼6份、10000 lU/ml的生長因子0.06份、膠原蛋白0.5份 和注射用水300份。
[0035] 所述滴眼液的抑為7.5，采用棚酸緩沖液調(diào)節(jié)。
[0036] 所述滴眼液的滲透壓為300m0sm/L，采用氯化鋼和氯化鐘調(diào)節(jié)，氯化鋼的質(zhì)量濃度 為0.5%，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.1%。
[0037] 硫酸類肝素提取自天然成分或采用細菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0038] 生長因子采用表皮生長因子:成纖維細胞生長因子:堿性成纖維細胞生長因子:胎 盤生長因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而成。
[0039] 2.滴眼液制備方法
[0040] (1)先稱取配方量的氯化鋼和氯化鐘，加入40%體積的注射用水中，攬拌使完全溶 解，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，收集濾液；
[0041 ] (2)稱取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，20°C下攬拌4h，轉(zhuǎn)速20化pm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0042] (3)稱取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0043] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類肝素和生長因子，加 棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，無菌條件下灌裝即可。
[0044] 實施例2
[0045] 1.滴眼液配方
[0046] 一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 5份、30mg/ml的 硫酸類肝素0.1份、40w化的玻璃酸鋼4份、4000IU/ml的生長因子0.1份、膠原蛋白0.1份和注 射用水200份。
[0047] 所述滴眼液的抑為5.5,采用憐酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)。
[004引所述滴眼液的滲透壓為350m0sm/L，采用氯化鋼調(diào)節(jié)，氯化鋼的質(zhì)量濃度為0.3%。
[0049] 硫酸類肝素提取自天然成分或采用細菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0050] 生長因子采用表皮生長因子:成纖維細胞生長因子:堿性成纖維按照1:3:1的重量 比配置而成。
[0051] 2.滴眼液制備方法
[0052] (1)先稱取配方量的氯化鋼，加入60%體積的注射用水中，攬拌使完全溶解，用0.2 μπι的濾膜過濾除菌，收集濾液；
[0053] (2)稱取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，30°C下攬拌化，轉(zhuǎn)速10化pm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0054] (3)稱取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0055] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類肝素和生長因子，加 憐酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，無菌條件下灌裝即可。
[0056] 實施例3 [0化7] 1.滴眼液配方
[0化引一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lif itegrast 10份、30mg/ml 的硫酸類肝素3份、lOOwDa的玻璃酸鋼1份、5000IU/ml的生長因子0.01份、膠原蛋白1份和注 射用水500份。
[0059] 所述滴眼液的抑為6,采用憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)。
[0060] 所述滴眼液的滲透壓為280m0sm/L，采用氯化鐘調(diào)節(jié)，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.1%。 [0061 ]硫酸類肝素提取自天然成分或采用細菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0062]生長因子采用表皮生長因子:堿性成纖維細胞生長因子:胎盤生長因子按照1:4:3 的重量比配置而成。
[00創(chuàng) 2.滴眼液制備方法
[0064] (1)先稱取配方量的氯化鐘，加入60%體積的注射用水中，攬拌使完全溶解，用0.2 μπι的濾膜過濾除菌，收集濾液；
[0065] (2)稱取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，15 °C下攬拌化，轉(zhuǎn)速15化pm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0066] (3)稱取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0067] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類肝素和生長因子，加 憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，無菌條件下灌裝即可。
[006引實施例4
[0069] 1.滴眼液配方
[0070] 一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 20份、50mg/ml 的硫酸類肝素0.1份、40w化的玻璃酸鋼10份、lOOOOIU/ml的生長因子0.07份、膠原蛋白0.6 份和注射用水200份。
[0071] 所述滴眼液的抑為7.0,采用憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)。
[0072] 所述滴眼液的滲透壓為300m0sm/L，采用氯化鋼和氯化鐘調(diào)節(jié)，氯化鋼的質(zhì)量濃度 為0.8%，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.2%。
[0073] 硫酸類肝素提取自天然成分或采用細菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0074] 生長因子采用表皮生長因子:成纖維細胞生長因子:堿性成纖維細胞生長因子:胎 盤生長因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而成。
[00對 2.滴眼液制備方法
[0076] (1)先稱取配方量的氯化鋼和氯化鐘，加入40%體積的注射用水中，攬拌使完全溶 解，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，收集濾液；
[0077] (2)稱取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，25°C下攬拌地，轉(zhuǎn)速l(K)rpm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0078] (3)稱取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0079] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類肝素和生長因子，加 憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過濾除菌，無菌條件下灌裝即可。
[0080] 對比例1
[0081 ]制備100ml滴眼液:將透明質(zhì)酸鋼Ig完全溶解于40ml注射用水中，備用；另取50ml 注射用水，加入5g甘露醇、ο. 9g氯化鋼，完全溶解后加入l(K)yg人堿性成纖維細胞生長因子， 再加入事先準(zhǔn)備好的透明質(zhì)酸鋼溶液，混合均勻后，加注射用水定容至所需體積并同時加 入氨氧化鋼溶液使抑為7.0，用0.2-0.5皿的微孔濾膜過濾除菌，濾液分裝至滴眼液塑料瓶 中，即制成滴眼液成品。
[0082] 二、動物耐受試驗
[0083] 目的:考察本發(fā)明的滴眼液對兔眼的刺激性。
[0084] 樣品：實驗組:實施例1制備的滴眼液樣品；對照組:0.9%生理鹽水。
[0085] 動物:健康家兔5只。
[0086] 操作：將每只動物眼睫毛剪去，每只動物左側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)均滴實驗組的滴眼液 (0.1ml/眼），右側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)滴對照組的0.9%生理鹽水。每次給藥時壓迫鼻淚管，并使眼 被動閉合5-lOs。每日5次，連續(xù)給藥4周于試驗開始后每周觀察并記錄至試驗結(jié)束。
[0087] 結(jié)果:測定記錄各組動物滴眼藥后lOmin內(nèi)的巧眼次數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理t檢驗。結(jié)果 見表1。
[0088] 表1兔巧眼次數(shù)測定結(jié)果(n = 5)
[0089]
[0090] 表中結(jié)果表明，實驗組滴眼液組與對照組比較無顯著性差異(P〉0.05)，說明實驗 組滴眼液對兔眼無刺激性。
[0091] Ξ、藥效學(xué)實驗1
[0092] 目的:考察滴眼液對堿燒傷兔眼修復(fù)作用
[0093] 樣品：實驗組:按照本實施例1制備的滴眼液樣品；對照組:對比例1制備的滴眼液 樣品；
[0094] 動物:新西蘭兔。
[009引操作:取新西蘭兔，眼表采用3.5 %利多卡因麻醉，將直徑8mm的濾紙原片置0.5N的 NaO田容液中浸濕，置角膜正中1分鐘后取下，立即用無菌生理鹽水沖洗。
[0096] 取造模成功的兔6只，傷后6小時即刻右眼滴實驗組的滴眼液樣品，左眼滴對照的 樣品，5次/日，共2周。
[0097] 評價：角膜上皮愈合率及破損率計算:相機配近攝接圈，固定焦距，于傷后化、2化、 24h、3化、4化在角膜巧光著色區(qū)拍攝，沖洗后繪出巧光著色區(qū)，SPSS軟件測出各時點面積 值，經(jīng)線性回歸計算上皮愈合率(mm2A)。于傷后3-15天每天觀察角膜2次，凡巧光著色為陽 性，上皮破損率=(治療眼或?qū)φ昭坳栃詳?shù)/治療眼或?qū)φ昭劭倲?shù)）X 100%。
[009引結(jié)果；
[0099] (1)早期角膜上皮愈合與晚期角膜愈合觀察
[0100] 早期(傷后6小時）角膜愈合十分緩慢，傷后6~48小時，角膜愈合趨于一條直線，見 附圖1。實驗組角膜平均愈合率1.42 ± 0.027iWVh，對照組角膜平均愈合率0.89 ± 0.047mm2/ 11，前者明顯較后者快(口<0.01)。
[0101] (2)上皮破損率
[0102] 結(jié)果見附圖2。實驗組上皮破損率明顯低于對照組，于燒傷后第6天角膜上皮痊愈， 對照組于第10天角膜上皮痊愈。
[0103] 實驗結(jié)果可見，實施例1滴眼液治療堿燒傷角膜上皮效果明顯優(yōu)于對比例1滴眼 液，對臨床應(yīng)用有指導(dǎo)意義。
[0104] 四、藥效學(xué)實驗2
[0105] 目的:考察制劑對兔腺病毒性角膜炎治療作用。
[0106] 樣品：實驗組:按照本實施例2制備的滴眼液樣品、對照組1:阿昔洛韋滴眼液(修正 藥業(yè)）；對照組2:對比例1制備的滴眼液樣品；
[0107] 動物:新西蘭兔24只（雌雄各半）。
[0108] 操作:實驗動物檢查雙眼均無異常后，雙眼用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液進行表面 麻醉，后將小鼠置于裂隙燈顯微鏡下，用4.5號無菌針頭交叉劃傷右眼角膜上皮層多次，呈 1mm大小"井"形劃痕，然后給結(jié)膜囊內(nèi)滴入50μ1含有15TCID/0.1ml的腺病毒3型病毒液，連 續(xù)感染3d。腺病毒感染5d后出現(xiàn)病毒性角膜炎典型病變（角膜出現(xiàn)點狀、地圖狀、樹枝狀病 灶，虹膜充血，畏光流淚癥狀）。
[0109] 造模成功后，隨機分為治療組(實施例2制備的復(fù)合滴眼液）、對照組1(阿昔洛韋滴 眼液）、對照組2(對比例1制備的滴眼液）。出現(xiàn)典型病變Id后，開始結(jié)膜囊給藥，2滴/次，4 次/天，連續(xù)給藥lOd。于用藥后第3、6、10天，W2%巧光素鋼染色，裂隙燈下觀察角膜病變范 圍。10天后處死各組白兔，取其角膜，常規(guī)處理后，肥染色，光鏡觀察。
[0110] 評價:角膜病變程度判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)化ilienhaus等上皮表面缺損面積W0至4計分， 結(jié)果見表2所示。
[0111] 表2角膜上皮病變程度分級
[0112]
[0113] 結(jié)果；
[0114] (1)于用藥后第3、6、10天觀察各組兔眼角膜情況，^393313.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計 分析，計量數(shù)據(jù)WX±s表示，組間差異采用多因方差分析，結(jié)果見表3所示。與陰性對照組比 較，治療組於〇. 02，陽性對照組於0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0115] 表3兔腺病毒性角膜炎病變評分(g± S)
[0116]
[0117]由結(jié)果可見，本發(fā)明的滴眼液治療兔腺病毒性角膜炎效果比對照組1、對照組2的 藥物明顯，說明Lifitegrast、類硫酸肝素、FGF、膠原蛋白和玻璃酸鋼聯(lián)合使用能大大提高 對角膜炎的治療效果。
[011引 （2)角膜病理觀察
[0119] 對照組1和對照組2可見角膜修復(fù)，但細胞層次和細胞間連接的病理損害仍存在， 實驗組可見上皮修復(fù)完整，新生的鱗狀上皮排列整齊，未見脫落或水泡?？梢奓ifitegrast、 類硫酸肝素、FGF、膠原蛋白和玻璃酸鋼聯(lián)合使用能有效抑制角膜病毒向周圍鄰近細胞擴 散，縮小病灶范圍，有利于上皮細胞的遷移和增殖來修復(fù)傷口，又防止病菌的感染。
[0120] 對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)W上描述的技術(shù)方案W及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變W及形變，而所有的運些改變W及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括以下重量份組分:Lifitegrast 1-20份、硫酸類肝 素0.1-5份、玻璃酸鈉1-10份、生長因子0.01-0.1份、膠原蛋白0.1-1份和注射用水200-500 份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其包括以下重量份組分:Lifitegrast 5-10份、硫酸類肝素1-3份、玻璃酸鈉4-7份、生長因子0.05-0.07份、膠原蛋白0.4-0.6份和 注射用水300-400份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：所述滴眼液的pH為5.5-7.5，采用磷酸鹽緩沖液和/或硼酸緩沖液調(diào)節(jié)，采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液調(diào)節(jié)時，磷 酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：所述滴眼液的滲透壓為 280-350m0sm/L，采用氯化鈉和/或氯化鉀調(diào)節(jié)，氯化鈉的質(zhì)量濃度為0.3-0.8%，氯化鉀的 質(zhì)量濃度為〇. 1-0.3%，采用氯化鈉和氯化鉀調(diào)節(jié)時，氯化鈉和氯化鉀以任意比例混溶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于:硫酸類肝素提取自天然成 分或采用細菌發(fā)酵法制得，硫酸類肝素的濃度為0.5-50mg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：生長因子濃度為1000-10000IU/ml，生長因子選自表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子 和胎盤生長因子中的一種或幾種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：生長因子濃度為2000-6000IU/ml，生長因子采用表皮生長因子:成纖維細胞生長因子:堿性成纖維細胞生長因子： 胎盤生長因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而成。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于:玻璃酸鈉采用雞冠提取或 發(fā)酵法制得，玻璃酸鈉分子量為40-150w Da。9. 一種如權(quán)利要求4所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液的制備方法，其特征在于:包括以下步 驟： (1) 先稱取配方量的氯化鈉和/或氯化鉀，加入40-60%體積的注射用水中，攪拌使完全 溶解，用0.2μπι的濾膜過濾除菌，收集濾液； (2) 稱取配方量的玻璃酸鈉加入濾液中，適宜溫度下攪拌，直至玻璃酸鈉完全溶解； (3) 稱取配方量的Lif i tegrast至剩余的注射用水中，攪拌并溶解； (4) 將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類肝素和生長因子，加磷酸 鹽緩沖液和/或硼酸緩沖液調(diào)節(jié)PH，用0.2μπι的濾膜過濾除菌，無菌條件下灌裝即可。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的仿細胞外基質(zhì)滴眼液的制備方法，其特征在于:步驟(2)中攪 拌時間為3_6h，轉(zhuǎn)速100-200rpm，溫度15-30 °C。
【文檔編號】A61P27/02GK105999235SQ201610566636
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月19日
【發(fā)明人】周曉惠, 張軍東, 陳晚華, 廉云飛, 吳劍英
【申請人】上海建華精細生物制品有限公司