專利名稱：：含色素上皮衍生因子的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含色素上皮衍生因子(PigmentEpithelium-DerivedFactor,PEDF)的復(fù)合物，尤其涉及一種能延長(zhǎng)PEDF體內(nèi)半衰期的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：新生血管生成是指在原有的血管上生成新的毛細(xì)血管。腫瘤的生長(zhǎng)和遷移依賴于新生血管的生成，因此抑制新生血管的發(fā)生成為一種抗腫瘤治療的新的手段。(FolkmanJ.NEnglJMed1971;285:1182—1186)。色素上皮衍生因子(PEDF)是人和動(dòng)物眼中天然存在的一種糖蛋白，分子量為46KD，具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域N端的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)區(qū)域和C端的絲氨酸蛋白酶抑制超基因家族反應(yīng)環(huán)。DNA序列分析顯示PEDF屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑基因超家族，但它不具有抑制蛋白酶的活性。PEDF最初是Tombran-Tink等于1989年從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來(lái)的，由此得名。它可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Y79Rb神經(jīng)元分化。在人胚胎發(fā)育到17周的RPE細(xì)胞就已經(jīng)具有這種活性，PEDF被認(rèn)為是影響早期神經(jīng)元發(fā)育的一個(gè)候補(bǔ)因子。1999年Dawson等首次發(fā)現(xiàn)PEDF具有很強(qiáng)的抑制血管的作用，可能是維持角膜、玻璃體等眼內(nèi)組織無(wú)血管形成的主要原因，在玻璃體內(nèi)是主要的血管增生抑制劑(DawsonDW，Volpert0V，Science1999;285(5425)245-248)。PEDF具有抑制病理性血管新生和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)雙重生物學(xué)功能，既可以有效地抑制血管新生，又能有效地保護(hù)神經(jīng)元，為眼部新生血管性疾病的治療提供了新的思路。PEDF將成為控制糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等疾病很有潛力的藥物。PEDF可特異性地作用在腫瘤新生血管豐富的區(qū)域，而對(duì)正常存在的血管沒(méi)有作用，PEDF這種對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的特異性抑制，使其成為一種潛在的新生血管抑制劑類抗腫瘤藥物。但是，PEDF蛋白質(zhì)藥物在給藥后其體內(nèi)半衰期短，除了體內(nèi)蛋白降解作用外，會(huì)通過(guò)腎小球過(guò)濾途徑從體內(nèi)被排除，在有些情況下，因結(jié)合特異性抗體而被清除或失活。為維持體內(nèi)有效的治療濃度，就需要頻繁地注射給藥，這種治療方式雖然可以達(dá)到治療目的，但給病人帶來(lái)不便與痛苦，且增加了用藥成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決PEDF在體內(nèi)半衰期短的技術(shù)問(wèn)題，提供一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物。此外，還需要提供含色素上皮衍生因子的復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物，所述色素上皮衍生因子與聚烯醇類化合物或免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)。所述聚烯醇類化合物選自聚乙二醇(PolyethyleneGlycol,PEG)、聚乙稀醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或它們的衍生物，優(yōu)選的，所述聚烯醇類化合物為聚乙二醇，更優(yōu)選的，該聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。聚乙二醇是線形或分叉，平均分子量為1，000100,000道爾頓之間，優(yōu)選10，00040，000道爾頓之間，更優(yōu)選分子量為20，000Da和40，000Da的聚乙二醇。所述復(fù)合物中，一個(gè)色素上皮衍生因子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，該偶聯(lián)的位點(diǎn)為色素上皮衍生因子的N端a氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈的e氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一個(gè)或其多個(gè)組合。優(yōu)選的，所述復(fù)合物中，一個(gè)色素上皮衍生因子與一個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，該偶聯(lián)的位點(diǎn)為色素上皮衍生因子的N端a氨基。色素上皮衍生因子N末端單一位點(diǎn)的修飾，使修飾后的色素上皮衍生因子分子結(jié)構(gòu)均一，更有利于藥物開(kāi)發(fā)的應(yīng)用。所述復(fù)合物中，一個(gè)色素上皮衍生因子和一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)，該偶聯(lián)可以是融合表達(dá)得到，也可以是通過(guò)體外蛋白偶聯(lián)得到。優(yōu)選的，該免疫球蛋白Fc片斷為人免疫球蛋白IgG中的Fc片斷。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含上述復(fù)合物的緩釋制劑，該緩釋制劑的緩釋材料選自微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵或脂質(zhì)體。該緩釋制劑在保留色素上皮衍生因子生物學(xué)活性的同時(shí)，能夠依靠緩釋進(jìn)一步延長(zhǎng)色素上皮衍生因子的體內(nèi)半衰期。優(yōu)選的方案為用聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物微球?qū)EDF進(jìn)行包埋，達(dá)到體內(nèi)緩釋PEDF的目的。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，包括上述復(fù)合物和可藥用載體。該可藥用載體為含水的緩沖液，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、或其它有機(jī)酸的緩沖液、抗壞血酸或其它抗氧化劑、低分子量多肽、血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白或其它蛋白質(zhì)、聚乙烯吡咯烷酮或其它親水性多聚體。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含上述復(fù)合物的試劑盒。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟用活化的聚烯醇類化合物與色素上皮衍生因子以1:5至5:l的摩爾比混合，并在pH為3-10，溫度為4-3(TC的條件下進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選的，所述聚烯醇類化合物為聚乙二醇。優(yōu)選的，還包括用陽(yáng)離子柱或用分子篩分離反應(yīng)后獲得的不同修飾的色素上皮衍生因子，以得到色素上皮衍生因子N末端單一位點(diǎn)修飾PEG的復(fù)合物。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述復(fù)合物在制備預(yù)防、診斷或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤包括肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、骨癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、宮頸癌或其它腫瘤。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述復(fù)合物在制備預(yù)防、診斷或治療包括增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性及年齡相關(guān)性黃斑變性的新生血管異常增生疾病的藥物中的應(yīng)用。由本發(fā)明含色素上皮衍生因子的復(fù)合物組成的藥物，其給藥方式包括靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、口服、粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其它給藥方式。本發(fā)明中的色素上皮衍生因子，其來(lái)源可以是人、鼠或其他哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人色素上皮衍生因子，包括人體內(nèi)自然存在的野生型色素上皮衍生因子(SEQNO.1序列)，或是其具有活性的突變體、片段、異構(gòu)體或衍生物。色素上皮衍生因子的突變體是指通過(guò)氨基酸的取代、缺失、增加而得到的仍具有活性的色素上皮衍生因子。色素上皮衍生因子的片斷是指SEQNO.1序列中任何更短的部分序列，可通過(guò)酶切，或通過(guò)基因工程表達(dá)，或通過(guò)肽合成方法得到，其中優(yōu)選SEQNO.1序列的19121位氨基酸序列。色素上皮衍生因子異構(gòu)體具有相同序列，但具有與天然結(jié)構(gòu)不同的構(gòu)象。色素上皮衍生因子衍生物是指在本發(fā)明所述序列上進(jìn)行修飾的產(chǎn)物，如連接小分子、短肽等，其中小分子優(yōu)選磷酸分子、糖分子，短肽優(yōu)選含有His-tag的15個(gè)氨基酸以內(nèi)的小肽。本發(fā)明含色素上皮衍生因子的復(fù)合物，不僅具有與色素上皮衍生因子相同甚_至更高的抑制新生血管生成的活性，而且與未經(jīng)修飾的色素上皮衍生因子相比，能顯著減緩色素上皮衍生因子在體內(nèi)的代謝、延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明由聚烯醇類化合物或免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)修飾的色素上皮衍生因子形成的復(fù)合物，其中色素上皮衍生因子的半衰期從修飾前的4.5小時(shí)延長(zhǎng)到修飾后的82.3小時(shí)，半衰期延長(zhǎng)17.3倍左右，并且修飾后的色素上皮衍生因子仍具有很高的抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)的活性。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的PEDF蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)圖2是本發(fā)明實(shí)施例lPEDF包涵體三次洗滌過(guò)程中上清液和沉淀的SDS-PAGE電泳圖3是本發(fā)明實(shí)施例1PEDF復(fù)性后純化過(guò)程中洗脫組分的SDS-PAGE電泳圖4是本發(fā)明實(shí)施例2的20KD聚乙二醇與具有SEQNO.2序列的重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)的電泳圖5是本發(fā)明實(shí)施例3的20KD聚乙二醇與具有SEQNO.2序列的重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后用陽(yáng)離子柱純化的SDS-PAGE電泳圖6是本發(fā)明實(shí)施例4的40KD聚乙二醇與具有SEQNO.2序列的重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)的電泳圖7是本發(fā)明實(shí)施例5的40KD聚乙二醇與具有SEQNO.2序列的重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后用陽(yáng)離子柱純化的SDS-PAGE電泳圖8是本發(fā)明實(shí)施例6的20KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后在血液中的長(zhǎng)效效應(yīng)曲線圖9是本發(fā)明實(shí)施例7的40KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后在血液中的長(zhǎng)效效應(yīng)曲線圖10是本發(fā)明實(shí)施例8的20KD、40KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后純化的單修飾組分抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的柱狀圖11是本發(fā)明實(shí)施例9的20KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后純化的單修飾組分抑制小鼠肺癌活性的柱狀圖12是本發(fā)明實(shí)施例10的40KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后純化的單修飾組分抑制小鼠肺癌活性的柱狀圖13是本發(fā)明實(shí)施例11用聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF的緩釋制劑延長(zhǎng)PEDF體內(nèi)半衰期的柱狀圖。具體實(shí)施例方式為了延長(zhǎng)色素上皮衍生因子的體內(nèi)半衰期，本發(fā)明提供一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物，該復(fù)合物的色素上皮衍生因子與聚烯醇類化合物或免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)。在本發(fā)明中，聚烯醇類化合物優(yōu)選為聚乙二醇。聚乙二醇分子具有水溶性和有機(jī)溶劑相容性，無(wú)毒、極低免疫原性，被包括美國(guó)FDA和中國(guó)SFDA在內(nèi)的許多國(guó)家的藥品管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)為可用于藥物制備的原料。色素上皮衍生因子經(jīng)聚乙二醇修飾后可增加蛋白的穩(wěn)定性、水溶性，減少非特異性吸附和抗原性。修飾后復(fù)合物達(dá)到一定分子量時(shí)(大于50KD)，可大大降低藥物的腎臟清除率，從而有效延長(zhǎng)色素上皮衍生因子的體內(nèi)半衰期。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，聚乙二醇進(jìn)一步優(yōu)選為單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。聚乙二醇修飾的色素上皮衍生因子復(fù)合物的生物活性和體內(nèi)藥學(xué)性質(zhì)除了和色素上皮衍生因子本身的性質(zhì)有關(guān)以外，還和用于修飾的聚乙二醇的分子量大小、形狀、修飾位點(diǎn)和修飾數(shù)量有關(guān)。本發(fā)明聚乙二醇的分子量為1,000100，000道爾頓之間，優(yōu)選10，00040，000道爾頓之間，更優(yōu)選分子量為20，000Da和40，000Da。本發(fā)明聚乙二醇的形狀為線形或分叉，優(yōu)選為分叉Y型。本發(fā)明中，聚乙二醇在色素上皮衍生因子上的修飾位點(diǎn)包括色素上皮衍生因子的N端a氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈的e氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基或谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一個(gè)或多個(gè)組合，聚乙二醇在色素上皮衍生因子上的修飾數(shù)量為一個(gè)或多個(gè)。但是，對(duì)于賴氨酸殘基側(cè)鏈上的e氨基的修飾往往因?yàn)榉磻?yīng)位點(diǎn)不特異而產(chǎn)生修飾后的同分異構(gòu)體。本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，優(yōu)選聚乙二醇在色素上皮衍生因子N末端單一位點(diǎn)的修飾，使修飾后的色素上皮衍生因子分子結(jié)構(gòu)均一，更有利于藥物開(kāi)發(fā)的應(yīng)用。本發(fā)明復(fù)合物中，一個(gè)色素上皮衍生因子和一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)后，能明顯延長(zhǎng)色素上皮衍生因子的體內(nèi)半衰期，且仍保持原有抗新生血管生成的活性。優(yōu)選的，該免疫球蛋白Fc片斷為人免疫球蛋白IgG中的Fc片斷。本發(fā)明含色素上皮衍生因子的復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟用活化的聚烯醇類化合物與色素上皮衍生因子以1:5至5:l的摩爾比混合，并在pH為3-10，溫度為4-3(TC的條件下進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選的，所述聚烯醇類化合物為聚乙二醇。優(yōu)選的，還包括用陽(yáng)離子柱或用分子篩分離反應(yīng)后獲得的不同修飾的色素上皮衍生因子，以得到色素上皮衍生因子N末端單一位點(diǎn)修飾PEG的復(fù)合物。本發(fā)明還提供了一種包含色素上皮衍生因子復(fù)合物的緩釋制劑，該緩釋制劑的緩釋材料選自微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵或脂質(zhì)體。該緩釋制劑在保留色素上皮衍生因子生物學(xué)活性的同時(shí)，能夠依靠緩釋進(jìn)一步延長(zhǎng)色素上皮衍生因子的體內(nèi)半衰期。優(yōu)選的方案為用聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物微球?qū)EDF進(jìn)行包埋，達(dá)到體內(nèi)緩釋PEDF的目的。下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1重組色素上皮衍生因子的制備(1)菌株的構(gòu)建從人cDNA文庫(kù)中克隆編碼SEQNO.2所示多肽的DNA片段，并構(gòu)建入PET30a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，表達(dá)SEQNO.2所示多肽。(2)蛋白表達(dá)將PEDF菌種接種至30mlLB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm搖床培養(yǎng)5小時(shí)，轉(zhuǎn)接入500mlLB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件如上。將此培養(yǎng)液接入5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37。C、pH7.0，溶氧2030%，在OD,達(dá)到10以前，控制殘?zhí)菫?g/L，在0D,達(dá)到10以后，控制殘?zhí)菫閘g/L以內(nèi)。每小時(shí)取樣檢測(cè)殘?zhí)呛?D6。。，OD,為6時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加氮源。0D,達(dá)到20左右時(shí)，加入終濃度為50mg/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并控制殘?zhí)?.3g/L誘導(dǎo)45個(gè)小時(shí)停止培養(yǎng)并收集菌體。PEDF蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1，在圖1中，數(shù)字l指未誘導(dǎo)的菌株，25:分別表示用IPTG誘導(dǎo)1、2、3、4小時(shí)后的表達(dá)情況。(3)包涵體洗滌將菌體放入-20"C冰箱凍存過(guò)夜，然后用菌體濕重58倍體積的裂解液(50mMTris，50mMNaCl，5mMEDTA，5mMNa2S0:i，2mMDTT，pH8.5)重懸，混勻。每克濕菌體加5000單位酶活的溶菌酶，攪拌均勻。l小時(shí)后加入DNasel(每克菌體加10U'g)，室溫?cái)嚢杓s30分鐘。高壓勻漿機(jī)破菌，壓力60MPa，循環(huán)3次。離心，收集破菌沉淀。以上沉淀中加入IO倍濕重體積的洗滌液(2%TritonX-IOO，2MUrea，10mMTris，5mMEDTA，2mMDTT，pH8.0)，使液固相充分混勻。室溫下靜置30min后，離心，收集沉淀。重復(fù)以上洗滌過(guò)程2遍，收集沉淀，該沉淀即PEDF包涵體蛋白。PEDF包涵體洗滌過(guò)程見(jiàn)圖2。在圖2中，1:PEDF表達(dá)菌體；2:破菌上清液；3;破菌沉淀；4:第一次洗滌上清液；5:第一次洗滌液沉淀；6:第二次洗滌上清液；7:第二次洗滌液沉淀；8:第三次洗滌上清液；9:第三次洗滌液沉淀(PEDF包涵體蛋白)。(4)PEDF的復(fù)性將洗滌得到的PEDF包涵體蛋白用尿素溶液(8M尿素，50mMTris，5mMEDTA，2mMDTT，pH8.0)溶解過(guò)夜，然后以1比50的比稀釋到復(fù)性液(50mMTris，20%甘油，5mMEDTA，lmMDTT，pH8.0)中，8小時(shí)后對(duì)10mMTris，5mMEDTA，lmMDTT，pH8.0溶液進(jìn)行透析。離心去除沉淀，收集上清。上清中存留的PEDF即復(fù)性的PEDF。(5)PEDF的純化采用SPHP層析介質(zhì)(GE公司)純化PEDF。用20raMNaH2P04，1MNaCl，pH6.5溶液對(duì)層析介質(zhì)進(jìn)行預(yù)先處理，然后用20mMNaH2P04，pH6.5溶液進(jìn)行平衡。上樣后，用20mMNaH2P04，p服.5溶液沖洗2個(gè)柱體積，然后用20mMNaH2P04，200mMNaCl，pH6.5溶液洗脫有活性的PEDF蛋白，最后用20mMNaH2P04，1MNaCl，pH6.5溶液進(jìn)行清柱。將得到的活性PEDF溶液對(duì)pH5.5的30mM醋酸鈉溶液進(jìn)行透析，以備進(jìn)行PEG修飾。純化過(guò)程見(jiàn)圖3。在圖3中，1:復(fù)性后的PEDF;2:上樣穿透液；3:沖洗組分；4:200mMNaCl洗脫組分；5:清柱組分。實(shí)施例220KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)本實(shí)施例涉及的重組人色素上皮衍生因子包括具有SEQN0.2序列的重組人色素上皮衍生因子。具體方式為將重組人色素上皮衍生因子透析到pH5.5的30mM醋酸鈉溶液中，測(cè)量蛋白濃度，并調(diào)整其濃度至3-8mg/ml之間。按照目的蛋白與聚乙二醇的摩爾比1比2計(jì)算需要加入的分子量為20KD的單甲氧基聚乙二醇丙醛的質(zhì)量，同時(shí)按照最終溶液體積計(jì)算還原劑CH3BNNa的用量，其濃度為20mM。最后調(diào)整溶液pH值至5.1-5.3。反應(yīng)溶液攪拌均勻后于室溫靜止4-6小時(shí)或4'C10小時(shí)。此時(shí)重組人9色素上皮衍生因子被一個(gè)聚乙二醇修飾的比例在50%以上，即一個(gè)重組人色素上皮衍生因子被一個(gè)分子量為20KD的單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾，且修飾位點(diǎn)為重組人色素上皮衍生因子的N末端(見(jiàn)圖4)。在圖4中，1:Marker,由上依次為97，66，45，35，20KD;2:分子量為20KD的單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF;3:未修飾的PEDF。實(shí)施例320KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后用陽(yáng)離子柱純化具體實(shí)施方式是將修飾后的重組人色素上皮衍生因子用陽(yáng)離子柱分離純化。具體選擇GE公司的SPHP層析介質(zhì)，并將修飾后的反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH值為6.3。陽(yáng)離子柱用30mM、pH6.3的醋酸鈉溶液平衡，并上樣。再用30mM醋酸鈉、1M氯化鈉、pH6.3的溶液進(jìn)行梯度洗脫。因聚乙二醇對(duì)蛋白本身的電荷有一定的屏蔽作用，多修飾的蛋白電荷強(qiáng)度最弱，其次是單修飾的蛋白，然后是未修飾的蛋白，因此洗脫時(shí)按照此順序蛋白被依次洗脫下來(lái)。根據(jù)280nm紫外吸收，收集不同的組分并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。純化過(guò)程見(jiàn)圖5。在圖5中，1:Marker,由上依次為97，66，45，35,20KD;2:分子量為20KD的單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF;3:穿透液；4:50mMNaCl洗脫組分；5:100mMNaCl洗脫組分；6:150mMNaCl洗脫組分；7:'200mMNaCl洗脫組分；8:250mMNaCl洗脫組分；9:300mMNaCl洗脫組分；10:500mMNaCl洗脫組分；11:1000mMNaCl洗脫組分。從圖5可知，第4泳道由50mMNaCl洗脫下來(lái)的蛋白即為單修飾的PEDF。實(shí)施例440KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)本實(shí)施例涉及的重組人色素上皮衍生因子包括具有SEQN0.2序列的重組人色素上皮衍生因子。具體方式為將重組人色素上皮衍生因子透析到pH5.5的30mM醋酸鈉溶液中，測(cè)量蛋白濃度，并調(diào)整其濃度至3-8mg/ral之間。按照目的蛋白與聚乙二醇的摩爾比l比2計(jì)算需要加入的分子量為40KD的單甲氧基，聚乙二醇丙醛的量，同時(shí)按照最終溶液體積計(jì)算還原劑CH3BNNa的用量，其濃度為20mM。最后調(diào)整溶液pH值至5.1-5.3。反應(yīng)溶液攪拌均勻后于室溫靜止4-6小時(shí)或4°C10小時(shí)。此時(shí)重組人色素上皮銜生因子被單一聚乙二醇修飾的比例在30%以上，即一個(gè)重組人色素上皮衍生因子被一個(gè)分子量為40KD的單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾，且修飾位點(diǎn)為重組人色素上皮衍生因子的N末端。修飾過(guò)程電泳圖譜見(jiàn)圖6。在圖6中，1:分子量為40KD10的單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF;2:Marker,由上依次為116，75，50，45，30，18，14KD。'實(shí)施例540KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后用陽(yáng)離子柱純化具體實(shí)施方式是將修飾后的重組人色素上皮衍生因子用陽(yáng)離子柱分離純化。具體選擇GE公司的SPHP層析介質(zhì)，并將修飾后的反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH值為6.3。陽(yáng)離子柱用30mM、pH6.3的醋酸鈉溶液平衡，并上樣。再用30mM醋酸鈉、1M氯化鈉、pH6.3的溶液進(jìn)行梯度洗脫。因聚乙二醇對(duì)蛋白本身的電荷有一定的屏蔽作用，多修飾的蛋白電荷強(qiáng)度最弱，其次是單修飾的蛋白，然后是未修飾的蛋白，因此洗脫時(shí)按照此順序蛋白被依次洗脫下來(lái)。根據(jù)280nm紫外吸收，收集不同的組分并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。純化過(guò)程見(jiàn)圖7。圖7中，1:Marker,從上依次為116，75，40，30，18KD;2:修飾的樣品；3:穿透；4:100mMNaCl洗脫組分(目的組分)；5:200rnMNaCl洗脫組分；6:300mMNaCl洗脫組分；7:lOOOmMNaCl洗脫組分(未修飾的PEDF)。實(shí)施例620KEf聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后在血液中的長(zhǎng)效效應(yīng)通過(guò)測(cè)量單修飾和未修飾的重組色素上皮衍生因子在大鼠體內(nèi)的藥物代謝半衰期來(lái)確定修飾蛋白的長(zhǎng)效效應(yīng)。選取8只健康Wistar大鼠，分為兩組，每組四只，分別于尾靜脈注射單修飾和未修飾的重組色素上皮衍生因子，劑量為lrag/kg體重。然后分別于注射前、注射后5分鐘、注射后10分鐘、20分鐘、40分鐘、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、168、216、264小時(shí)尾靜脈取血。收集血清，用美國(guó)ADL人色素上皮衍生因子雙抗體夾心法ELISA試劑盒測(cè)量血液中重組色素上皮衍生因子的濃度。結(jié)果表明，重組色素上皮衍生因子的半衰期從修飾前的4.5小時(shí)延長(zhǎng)到修飾后蛋白78.5小時(shí)(見(jiàn)下表1和圖8)，修飾后PEDF半衰期延長(zhǎng)16.4倍左右。在圖8中，深色曲線代表PEDF，淺色曲線代表20KD單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF。表120KD單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例740KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后在血液中的長(zhǎng)效效應(yīng)通過(guò)測(cè)量單修飾和未修飾的重組色素上皮衍生因子在大鼠體內(nèi)的藥物代謝半衰期來(lái)確定修飾蛋白的長(zhǎng)效效應(yīng)。選取8只健康Wistar大鼠，分為兩組，每組四只，分別于尾靜脈注射單修飾和未修飾的重組色素上皮衍生因子，劑量為lmg/kg體重。然后分別于注射前、注射后5分鐘、注射后10分鐘、20分鐘、40分鐘、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、168、216、264小時(shí)尾靜脈取血。收集血清，用美國(guó)ADL人色素上皮衍生因子雙抗體夾心法ELISA試劑盒測(cè)量血液中重組色素上皮衍生因子的濃度。結(jié)果表明，重組色素上皮衍生因子的半衰期從修飾前的4.5小時(shí)延長(zhǎng)到修飾后蛋白82.3小時(shí)(見(jiàn)下表2和圖9)，修飾后PEDF半衰期延長(zhǎng)17.3倍左右。在圖9中，深色曲線代表PEDF，淺色曲線代表40KD單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF。表240KD單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的PEDF的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)半衰期(h)CLsys(mlh/kg)AUC(ngh/ml)40KDPEG-PEDF82.3±15.8201.4±16.737985.5±699.2PEDF4.5±0.6854.8±71.03706.9±259.7實(shí)施例820KD、40KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后純化的單修飾組分抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性具體實(shí)施方案為將人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后饑餓細(xì)胞12小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶消化以后加入到Transwell中，每孔細(xì)胞數(shù)104個(gè)。此時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基、1%血清、10ng/mlbFGF和青霉素、鏈霉素雙抗。加藥組的培養(yǎng)孔內(nèi)加入濃度為0.5、1、5、25ug/ml的20KD聚乙二醇、40KD聚乙二醇單修飾和未修飾的重組色素上皮衍生因子。37。C培養(yǎng)8小時(shí)后，取出小皿，用1%的戊二醛固定細(xì)胞，刮掉膜上層的細(xì)胞，用蘇木精對(duì)下層細(xì)胞染色，最后在顯微鏡下取同樣視野對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。同一皿選取5個(gè)不同視野，最后計(jì)算平均抑制率。結(jié)果見(jiàn)圖10。在圖10中，l:PEDF0.5ug/ml;2:PEDFlug/ml;3:PEDF5ug/ml;4:PEDF25ug/ml;5:20KDPEG-PEDF0.5ug/ml;6:20KDPEG-PEDFlug/ml;7:20KDPEG-PEDF5ug/ml;8:20KDPEG-PEDF25ug/ml;9:40KDPEG-PEDF0.5ug/ml;10:40KDPEG-PEDF1ug/ml;11:40KDPEG-PEDF5ug/ml;12:40KDPEG-PEDF25yg/ml。圖10結(jié)果表明PEDF、20KD聚乙二醇修飾的PEDF和40KD聚乙二醇修飾的PEDF在濃度為1ug/ml時(shí)對(duì)HMEC細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到60%左右；濃度為5ug/ml時(shí)對(duì)HMEC細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到80%左右；在濃度為25ug/ml時(shí)細(xì)胞大多數(shù)均出現(xiàn)凋亡。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PEDF經(jīng)20KD、40KD聚乙二醇單修飾后，仍保持有未修飾PEDF抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性，且活性相當(dāng)。實(shí)施例920KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N水端偶聯(lián)后純化的單修飾組分抑制小鼠肺癌的活性本實(shí)施例觀察了20KD聚乙二醇修飾的重組色素上皮衍生因子對(duì)小鼠肺癌的體內(nèi)抑制活性。選用20g體重的昆明種小鼠，分別于腋下接種肺癌細(xì)胞，每只接入細(xì)胞數(shù)2X106個(gè)。第二天隨Ul分組，每組8只，分別設(shè)定陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(Endostar，3mg/kg體重，每天給藥)、未修飾的色素上皮衍生因子對(duì)照組(lmg/kg體重，每天給藥)、五組給藥組(20KD聚乙二醇修飾的重組色素上皮衍生因子，簡(jiǎn)稱PEG20K-PEDF，1mg/kg體重，每三天、七天、十二天給藥；0.3和3mg/kg體重，每七天給藥)。尾靜脈給藥，共給藥2卜24天。給藥結(jié)束后處死小鼠，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑制率結(jié)果見(jiàn)圖ll。在圖11中，1:陰性對(duì)照；2:Endostar3mg/kg，每天給藥一次；3:PEDF1mg/kg每天給藥一次；4:PEG20K-PEDF0.3mg/kg，每7天給藥一次；5:PEG20K-PEDF3mg/kg，每7天給藥一次；6:PEG20K-PEDF1mg/kg，每3天給藥一次；7:PEG20K-PEDF1mg/kg，每7天給藥一次；8:PEG20K-PEDF1mg/kg,每12天給藥一次。與陰性對(duì)照組相比，第2、4、5、7、8組P值小于0.01;第3、6組P值小于0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照藥物Endostar3mg/kg，每天給藥一次抑瘤率為53%;PEDF1mg/kg每天給藥一次抑瘤率達(dá)到81%;PEG20K-PEDF1mg/kg每7天給藥一次抑瘤率達(dá)到68%;PEG20K-PEDF1mg/kg每12天給藥一次抑瘤率仍能達(dá)到51%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PEDF經(jīng)20KD聚乙二醇單修飾后，仍具有未修飾PEDF抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)的活性，且活性相當(dāng)甚至超過(guò)未修飾PEDF。實(shí)施例1040KD聚乙二醇與重組色素上皮衍生因子的N末端偶聯(lián)后純化的單修飾組分抑制小鼠肺癌的活性本實(shí)施例觀察了40KD聚乙二醇修飾的重組色素上皮衍生因子對(duì)小鼠肺癌的體內(nèi)抑制活性。選用20g體重的昆明種小鼠，分別于腋下接種肺癌細(xì)胞，每只接入細(xì)胞數(shù)2X106個(gè)。第二天隨機(jī)分組，每組8只，分別設(shè)定陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(Endostar，3mg/kg體重，每天給藥)、3組給藥組(40KD聚乙二醇修飾的重組色素上皮衍生因子，簡(jiǎn)稱PEG40K-PEDF，0.3、1、3mg/kg體重，每七天給藥一次)。尾靜脈給藥，共給藥21-24天。給藥結(jié)束后處死小鼠，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑制率結(jié)果見(jiàn)圖12。在圖12中，1:陰性對(duì)照；2:Endostar3mg/kg，每天給藥一次；3:PEG40K-PEDF0.3mg/kg每7天給藥一次；4:,PEG40K-PEDF1mg/kg，每7天給藥一次；5:PEG40K-PEDF3mg/kg，每7天給藥一次。與陰性對(duì)照組相比，第2、3、4、5組P值小于0.01。圖12結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照藥物Endostar3rag/kg體重，每天給藥的抑瘤率為48%;PEG40K-PEDF0.3、1、3mg/kg體重，每七天給藥一次的抑瘤率分別為65%、70%和85%，量效關(guān)系明顯。與20KD聚乙二醇修飾的PEDF相比，同劑量、同樣給藥方式的抑瘤率類似。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PEDF經(jīng)40KD聚乙二醇單修飾后，仍具有未修飾PEDF抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)的活性，且活性相當(dāng)甚至超過(guò)未修飾PEDF。實(shí)施例ll用聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF選用聚乳酸和羥基乙酸的比例為75/25，采用雙乳液法(W/0/W法)制備聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物微球，固化溫度為45'C，將PEDF包埋。選用20g體重的昆明種小鼠，分別于腋下接種肺癌細(xì)胞，每只接入細(xì)胞數(shù)2X106個(gè)。第二天隨機(jī)分組，每組8只，分別設(shè)定陰性對(duì)照組(生理鹽水)、PEG20K-PEDFlmg/kg給藥和微囊包埋PEDF給藥組。PEG20g-PEDF每周給藥一次，連續(xù)給藥3周，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF給藥一次。3周后處死小鼠，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑制率結(jié)果見(jiàn)圖13。在圖13中，1:陰性對(duì)照組；2:PEG20K-PEDFlmg/kg給藥組；3:PLGA微囊包埋PEDF給藥組。圖13結(jié)果顯示，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF給藥一次，3周后仍能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)到61%。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。14序歹U表<110〉焦春，于昊燕<120〉含色素上皮衍生因子的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用<160〉2<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉418〈212〉PRT<213〉Homosapiens〈220〉<221〉PR0PEP<222>(1)..(19)〈220〉<221〉PEPTIDE〈222〉(19)..(121)〈400〉1MetGinAlaLeuValLeuLeuLeuCys15SerSerCysGinAsnProAlaSerPro2025ProAspSerThrGlyAlaLeuValGlu3540ValProValAsnLysLeuAlaAlaAla5055LeuTyrArgValArgSerSerMetSer6570SerProLeuSerValAlaThrAlaLeu85lieGlyLeuLeuGlyHis1015ProGluGluGlySerProAsp30GluGluAspProPhePheLys45PheGlyTyrAspValSerAsn60ThrProSer90Thr75AlaLeuAsnValLeuLeu80SerLeuGlyAla95-<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>AlaGlyThr370ProLeuAsp385ThrAspThrGlyPro〈210〉2〈211〉399〈212〉PRT〈213〉Homo〈400〉2ThrProSerProGlyLeuGinProAlaHisLeuThrPhe375380GinProPheTyrHisGlyAla405Leu390LeuAsnLeuPhelieGly410lie395LysPheValLeulieLeuAsps即iensGin1ThrAsnValSer65ThrAsnProAlaSerProProGluGluGlySerProAspProGlyLysArg50ValAlaLeu35SerLeu20Ala5ValGluGluGluAlaAlaValSerMetSerAlaThrAlaGluSerlieProAsplieProGinLeuArg130Lys115lieHis100AsnLyslie85GlyLeu70HisPro55SerSer40ThrAsp25Asn10ProPhePhePheGlyTyrThrAsnValAlaLeuSerArgThrTyrLysLeuLysSerAlaLeuSerSerPhe135Ala120ValGlu105SerTyr90LeuLeu75TyrLeu60GlyAsp45LeuAlaProLeuGlu140Phe125LysVal30LeuAspLeulieLeuAspThrArglieValVal110GluSerArgAsp400ProArg415AspSer15ProValTyrArgSerProLeuAlaGluGinArg80SerSer95ThrAhLysLysTyrGlyThrArgProArgValLeuThrGlyAsnProArgLeuAspLeuGinGlu145lieAsnAsnTrpThrLysGlulie180HisPheLysGly195AspPheLeuMet225SerValGlu210SerCysAspLysProliePhePheLeuPro260SerVal165ProGinTyrLysAla245LeuGluGlu305SerProAspPhe150GinAlaGinMetAspGlulieTrpValLeuThr200GluSer185LysGluAla230GinLeuProLeuSerLeuThr275AlaValLeuThrLysValThrPhelieGin265AspGin290ValThrLysSerLeu310LyslieThrGlySer325AlaGlyPheGluValGluHisArg340ProGlyLeuGin155LysGly170lieLeuLeuLeuAsp215ValLeuArgArgTyrlieHis280ProLysLeuVal295GinGluMetLys160LysLeuAlaArgSer175GlyValAla190LysThrSerPheAspSerArg205ArgVslProMetThrVal220LeuAspSerGly235GlySerMetSerThr250AsnLeuThrLeuAspLysLeu315ProArgGlu285Serlie270LeuTyrLeu300GinSerLeulieLys330AsnGluAspThrProSer355LeuAsnGinProTrp345AlaHisLeuThrTyrGly385His370AlaLeuLeuPhelie390Phe375GlyPro360liePheValLeuLyslieLeuAsp395LysGlyPhe365AspLeuAla350ProThrArg380ProArgGlyProAspLeu240lielie255'GluGluLysThrGluGlyPheAsp320ThrGin335GlyThrLeuAspAspThr權(quán)利要求1、一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物，其特征在于，所述色素上皮衍生因子與聚烯醇類化合物或免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)。2、如權(quán)利要求l所述的復(fù)合物，其特征在于，所述聚烯醇類化合物為聚乙二醇，該聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。3、如權(quán)利要求2所述的復(fù)合物，其特征在于，一個(gè)色素上皮衍生因子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，該偶聯(lián)的位點(diǎn)為色素上皮衍生因子的N端ci氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈的e氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一個(gè)或其多個(gè)組合。4、如權(quán)利要求3所述復(fù)合物，其特征在于，一個(gè)色素上皮衍生因子與一個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，該偶聯(lián)的位點(diǎn)為色素上皮衍生因子的N端a氨基。5、如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，一個(gè)色素上皮衍生因子和一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)。6、一種包含權(quán)利要求l所述復(fù)合物的緩釋制劑。7、如權(quán)利要求6所述的緩釋制劑，其特征在于，該緩釋制劑的緩釋材料為聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物微球。8、一種藥物組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求l所述的復(fù)合物和可藥用載體。9、一種包含權(quán)利要求1所述復(fù)合物的試劑盒。10、一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟用活化的聚烯醇類化合物與色素上皮衍生因子以l:5至5:l的摩爾比混合，并在pH為3-10，溫度為4-3(TC的條件下進(jìn)行反應(yīng)。11、如權(quán)利要求IO所述的制備方法，其特征在于，還包括用陽(yáng)離子柱或用分子篩分離反應(yīng)后獲得的不同修飾的色素上皮衍生因子。12、權(quán)利要求1所述的復(fù)合物在制備預(yù)防、診斷或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。13、權(quán)利要求1所述的復(fù)合物在制備預(yù)防、診斷或治療包括增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性及年齡相關(guān)性黃斑變性的新生血管異常增生疾病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種含色素上皮衍生因子的復(fù)合物，所述色素上皮衍生因子與聚烯醇類化合物或免疫球蛋白Fc片斷偶聯(lián)。本發(fā)明還公開(kāi)了含色素上皮衍生因子的復(fù)合物的制備方法及其在制備預(yù)防、診斷或治療腫瘤、新生血管異常增生疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明含色素上皮衍生因子的復(fù)合物，能顯著延長(zhǎng)色素上皮衍生因子在體內(nèi)的半衰期，同時(shí)具有與未修飾色素上皮衍生因子相同甚至更高的抑制新生血管生成及抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性。文檔編號(hào)C07K19/00GK101544696SQ20091004990公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年4月24日優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日發(fā)明者于昊燕,柯靜婷,春焦申請(qǐng)人:焦春;于昊燕