專利名稱：血小板衍生生長因子d、其編碼dna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)新生長因子受體的細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠原細(xì)胞的生長因子，本發(fā)明尤其涉及新的血小板衍生生長因子/血管內(nèi)皮生長因子樣生長因子，編碼這種因子的多核苷酸序列，以及利用或衍生自這種因子的藥物和診斷組合物和方法。
背景技術(shù)：
在發(fā)育的胚胎中，初生血管網(wǎng)的形成是通過中胚層細(xì)胞原位分化實現(xiàn)的，這個過程稱為血管發(fā)生。隨后的所有涉及胚胎中新生血管的產(chǎn)生或者成體中新血管的生成的過程，都由已形成的脈管系統(tǒng)中的毛細(xì)血管的出芽或者分裂過程決定，這個過程稱為血管生成(Pepper et al.,Enzyme&Protein,1996 49 138-162；Breier et al.,Dev.Dyn.1995 204 228-239:Risau.Nature,1997 386 671-674)。血管生成過程不僅與胚胎發(fā)育和正常組織的生長、修復(fù)和再生相關(guān)，而且涉及雌性生物的生殖周期、妊娠的形成和保持和外傷與骨折的恢復(fù)過程。血管生成不僅在正常個體中發(fā)生，還與大量的病理過程相關(guān)，尤其與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)，還與其它一些與血管增殖，尤其是微血管系統(tǒng)增殖的病理過程相關(guān)，例如糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病、牛皮癬和關(guān)節(jié)炎。那么，抑制血管生成就有助于預(yù)防疾病的發(fā)生或者減輕疾病的癥狀。
另一方面，在一些需要進(jìn)行血管化或者需要促進(jìn)血管化的場合，例如在組織或者器官移植后，或者常見于冠心病、血栓性脈管炎中需要在組織梗塞或者狹窄的動脈旁建立側(cè)支循環(huán)時，促進(jìn)血管的生成過程又是希望進(jìn)行的。
血管生成過程高度復(fù)雜，包括維持內(nèi)皮細(xì)胞處于細(xì)胞周期，降解細(xì)胞外的基質(zhì)，遷入并侵入周圍的組織，最后形成脈管。血管生成過程復(fù)雜的分子機制還遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們現(xiàn)在對它的認(rèn)識。
由于血管生成在許多生理和病理過程中的重要作用，人們已經(jīng)對參與控制血管生成相關(guān)的因子進(jìn)行了細(xì)致的研究。許多生長因子被證明可以調(diào)控血管生成過程，這些生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)移生長因子α(TGFα)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)。見Folkman et al.,J.Biol.Chem.,1992267 10931-10934(review)。
有人認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞特異性的生長因子家族中的特殊的一類，即血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)，以及它們所對應(yīng)的受體參與刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化，從而分化成為具有特定功能細(xì)胞。這些因子都屬于PDGF家族，并且主要都是通過內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(RTKs)實現(xiàn)功能。
PDGF家族中的九種不同的蛋白質(zhì)已經(jīng)被確定，即兩種PDGF(A和B)、VEGF，剩余的六個蛋白質(zhì)和VEGF密切相關(guān)。
這六個與VEGF密切相關(guān)的成員是VEGF-B，見國際專利申請PCT/US96/02957(WO96/26736)和美國專利5,840,693和5,607,918(路德維格癌癥研究所和Helsinki大學(xué))；VEGF-C，見Joukov et al.,EMBO J.,1996 15 290-298和Lee et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996 93 1988-1992；VEGF-D，見國際專利申請PCT/US97/14696(WO98/07832)和Achen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548-553；胎盤生長因子(P1GF)，見Maglione et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88 9267-9271；VEGF2，見國際專利申請PCT/US94/05291(WO95/24473)(人體基因組科學(xué)有限公司)和VEGF3，見國際專利申請PCT/US95/07283(WO96/39421)(人體基因組科學(xué)有限公司)。VEGF家族中的每個成員與VEGF相比較具有30％-45％氨基酸序列相同性。VEGF家族的成員都含有一個VEGF的同源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有由六個半胱氨酸殘基構(gòu)成的半胱氨酸結(jié)。VEGF家族的功能包括改變內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的程度、引起血管滲透性、血管生成和淋巴管生成。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是同源二聚糖蛋白，可以從多種來源中分離。VEGF呈現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞具有高度特異的促有絲分裂活性。在胚胎血管發(fā)生過程中形成新的血管或者在成體的血管生成過程中，VEGF都起著非常重要的調(diào)控作用(Carmeliet et al.,Nature,1996380 435-439；Ferrara et al.,Nature 1996 380 439-442；Freeara,Davis-Smyth,Endocrine Rev.,1997 18 4-25)。如果使一個VEGF的等位基因失活，胚胎就會因為脈管系統(tǒng)無法發(fā)育而致死，可見VEGF所執(zhí)行功能的重要性(Carmeliet et al.,Nature,1996 380 435-439；Ferrara etal.,Nature 1996 380 439-442)。此外，VEGF對單核細(xì)胞還具有很強的化學(xué)引誘作用，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生血纖維蛋白溶酶原激活劑和血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑，還可以促使微血管產(chǎn)生通透性。由于VEGF可以促使微血管產(chǎn)生通透性，所以常常也被稱為血管滲透因子(VPF)。VEGF的分離方法和性質(zhì)可以參見Ferrara et al.,J.Cellular Biochem.,1991 47 211-218和Connolly et al.,J.CellularBiochem.,1991 47 219-223。對單一VEGF基因進(jìn)行可變mRNA剪切產(chǎn)生了五種VEGF同種型。
VEGF-B和VEGF相比，具有相似的血管生成和其它性質(zhì)，但是在組織中的表達(dá)和分布不同。VEGF-B在心臟中大量表達(dá)，而在肺中很少表達(dá)，而VEGF恰恰相反。這表明，雖然VEGF-B和VEGF在許多組織中共表達(dá)，但是可能行使的功能有差異。
VEGF-B是通過酵母共雜交相互作用捕獲篩選技術(shù)進(jìn)行分離的。篩選可以和Ⅰ型細(xì)胞樹脂狀酸性結(jié)合蛋白(CRABP-Ⅰ)發(fā)生相互作用的細(xì)胞蛋白。具體的分離過程及其性質(zhì)可見專利申請PCT/US96/02957和Olofsson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996 932576-2581。
VEGF-C是從培養(yǎng)PC-3前列腺癌細(xì)胞系(CRL1435)的條件培養(yǎng)基中，根據(jù)是否可以對內(nèi)皮細(xì)胞上特異的受體酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)進(jìn)行酪氨酸磷酸化這一現(xiàn)象進(jìn)行篩選得到的。其中，VEGFR-3由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表達(dá)。再利用連有重組VEGFR-3的親和層析柱對VEGF-C進(jìn)行純化，再將其從PC-3 cDNA文庫中克隆出來。具體的分離過程和它的有關(guān)性質(zhì)可見Joukov et al.,EMBO J.,1996 15 290-298。
VEGF-D可以從人類乳腺cDNA文庫中分離得到，這個文庫可以從Clontech直接購買。以人cDNA文庫中的“Soares Breast3NbHBst”(Achen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548-553)這一表達(dá)序列標(biāo)記作為雜交探針進(jìn)行篩選。具體的分離過程和它的有關(guān)性質(zhì)可見國際專利申請PCT/US97/14696(WO98/07832)。
VEGF-D基因在成人體內(nèi)廣泛表達(dá)，但當(dāng)然也不是普遍表達(dá)。VEGF-D在心臟、肺和骨骼肌中大量表達(dá)。VEGF-D在脾、卵巢、小腸和結(jié)腸中等程度表達(dá)，在腎臟、胰腺、胸腺、前列腺和睪丸中的表達(dá)程度低。而在腦、胎盤、肝或者外周血白細(xì)胞中檢測不到VEGF-D的mRNA。
P1GF可以從足月的胎盤cDNA文庫中分離得到。具體的分離過程和它的有關(guān)性質(zhì)可見Maglione et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88 9267-9271。其具體的生物學(xué)功能目前尚不清楚。
VEGF2可以從高致瘤性不依賴雌激素的人類乳腺癌細(xì)胞系中分離得到。VEGF2和PDGF具有22％的同源性，與VEGF具有30％的同源性?，F(xiàn)在還沒有方法可以分離編碼VEGF2的基因，也沒有VEGF2生物學(xué)活性的有關(guān)數(shù)據(jù)。
VEGF3可以從來源于結(jié)腸組織的cDNA文庫中分離得到。VEGF3與VEGF相比，有36％相同性，66％相似性?，F(xiàn)在還沒有方法可以分離編碼VEGF3的基因，也沒有VEGF3生物學(xué)活性的有關(guān)數(shù)據(jù)。
兩個蛋白的相似性是通過比較氨基酸序列和兩個蛋白質(zhì)之間保守氨基酸的取代決定的，而兩個蛋白質(zhì)的相同性只是比較氨基酸序列，而不比較兩個蛋白質(zhì)之間保守氨基酸取代。
PDGF/VEGF家族成員主要通過和酪氨酸激酶受體結(jié)合而起作用。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有五種內(nèi)皮細(xì)胞特有的酪氨酸激酶受體，分別命名為VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)、Tie和Tek/Tie-2。它們?nèi)季哂行盘杺鲗?dǎo)必須的酪氨酸激酶活性。在血管發(fā)生和血管生成中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Tie和Tek/Tie-2起著非常關(guān)鍵和特異的作用，這已經(jīng)通過在小鼠胚胎中通過定點突變使這些受體失活的試驗得以證明。
現(xiàn)在所知的能和VEGFs結(jié)合的酪氨酸激酶受體為VEGFR-1VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2可以高特異的和VEGF結(jié)合，同時VEGFR-1還可以和VEGF-B和P1GF結(jié)合。VEGF-C是VEGFR-3的配體，同時也可以激活VEGFR-2(Joukov et al.,TheEMBO Journal,1996 15 290-298)。VEGF-D與VEGFR-2和VEGFR-3都可以結(jié)合。關(guān)于Tek/Tie-2的配體可以參見國際專利申請No.PCT/US95/12935(WO96/11269)(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)。Tie的配體至今仍然沒有發(fā)現(xiàn)。
最近，一種新的VEGF同種型的特異受體已經(jīng)被純化并克隆，大小為130-135Kda(Soker et al.,Cell,1998 92 735-745)。這個VEGF受體可以通過外顯子7編碼的序列非常特異地和VEGF165結(jié)合，但是它和肝素只有較弱的結(jié)合能力(Soker et al.,Cell,1998 92 735-745)。令人驚訝的是，這個受體與人類NP-1是相同的，NP-1是參與神經(jīng)早期發(fā)生的一個受體。P1GF-2也可以和NP-1相互作用(Migdalet al.,J Biol.Chem.,1998 273 22272-22278)。
VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3由內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)。VEGFR-1和VEGFR-2在血管內(nèi)皮中表達(dá)(Oelrichs et al.,Oncogene,1992 8 11-18；Kaipainen et al.,J.Exp.Med.,1993 178 2077-2088；Dumont et al.,Dev.Dyn.,1995 203 80-92；Fong et al.,Dev.Dyn.,1996207 1-10)。VEGFR-3在成體組織的淋巴內(nèi)皮中表達(dá)(Kaipainen et al.,Proc.Natl.Acad.Sic.USA,1995 9 3566-3570)。VEGFR-3同時也可以在圍繞腫瘤的血管中表達(dá)。
去除VEGFR基因會導(dǎo)致血管系統(tǒng)發(fā)育異常，使得在妊娠中期胚胎死亡。通過對帶有完全失活VEGFR-1基因的胚胎的分析顯示這個受體在內(nèi)皮功能性組織過程中是必須的(Fong et al.,Nature1995376 66-70)。但是,僅僅缺失了編碼VEGFR-1的胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域部分的基因卻產(chǎn)生可以存活的具有正常血管系統(tǒng)的小鼠(Hiratsukaet al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998 95 9349-9354)。上述差異的原因仍然有待解釋，但是可以由此推測通過酪氨酸激酶進(jìn)行的受體信號傳導(dǎo)對于VEGFR-1的正常功能的實現(xiàn)并不是必須的。通過對具有失活的VEGFR-2基因的純合體小鼠的研究表明，這個受體對于細(xì)胞增殖、血細(xì)胞生成和血管系統(tǒng)的生成是必須的(Shalaby et al.,Nature,1995 376 62-66；Shalaby et al.,Cell,1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活會造成心血管系統(tǒng)的錯誤，因為這會使得大血管結(jié)構(gòu)異常(Dumont et al.,Science,1998 282 946-949)。
雖然VEGFR-1主要在發(fā)育過程中在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但是在胚胎發(fā)生早期在造血前體細(xì)胞中也產(chǎn)生(Fong et al.,Nature 1995 37666-70)。在成體中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也表達(dá)這種受體(Barleon etal.,Blood,1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1被絕大多數(shù)，但不是全部血管表達(dá)(Breier et al.,Dev.Dyn.,1995 204 228-239；Fong et al.,Dev.Dyn.,1996 207 1-10)。
受體VEGFR-3在胚胎發(fā)育早期在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但是隨著胚胎發(fā)生的進(jìn)程，它僅在靜脈內(nèi)皮和淋巴內(nèi)皮中表達(dá)(Kaipainen etal.,Cancer Res.,1994 54 6571-6577；Kaipainen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 92 3566-3570)。VEGFR-3在成體組織的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。這個受體在胚胎發(fā)生過程中對于血管發(fā)育是非常關(guān)鍵的。把小鼠的VEGFR-3基因進(jìn)行定向的失活，由于帶有缺陷腔體的大血管發(fā)生異常自組，會導(dǎo)致有缺陷的血管的形成，從而使得液體在心包腔中滯留，在性交后9.5天心血管系統(tǒng)發(fā)生功能障礙。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以推測VEGFR-3在從初級血管網(wǎng)向更大的血管發(fā)育過程中是必須的。但是，VEGFR-3在淋巴管發(fā)育中的功能現(xiàn)在無法研究，因為上述的小鼠胚胎在淋巴系統(tǒng)形成之前已經(jīng)死亡?？茖W(xué)家們推測VEGFR-3在淋巴發(fā)生和成體中的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中有一定的表達(dá)，從而對淋巴管發(fā)育和淋巴發(fā)生起作作用。這是根據(jù)在轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚中發(fā)現(xiàn)VEGF-C的異位表達(dá)現(xiàn)象而作出的推測，得到的是一種VEGFR-3的配基，它的產(chǎn)生是由于真皮中淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的增大。這個發(fā)現(xiàn)還進(jìn)一步的顯示，VEGF-C也許最基本的功能是它在淋巴內(nèi)皮中的作用，另外輔助功能是與VEGF共同行使在血管生成中的作用，并且對血管滲透壓進(jìn)行調(diào)控(Joukov et al.,EMBO J.,1996 15 290-298)。
由于具有抗腫瘤組織血管發(fā)生的機制，一些VEGF和VEGF受體系統(tǒng)的抑制劑可以抑制腫瘤的生長。見Kim et al.,Nature,1993 362841-844；Saleh et al.,Cancer Res.,1996 56 393-401。
由上述提及的內(nèi)容，生長因子的VEGF家族是PDGF家族的成員。PDGF在結(jié)締組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長和運動方面均具有重要的作用(Heldin et al.,“Structureofplatelet-derived growth factor:Implications for functional properties”,Growth Factor,1993 8 245-252)。在成體中，PDGF可以促進(jìn)創(chuàng)傷組織的愈合(Robson et al.,Lancet,1992 339 23-25)。結(jié)構(gòu)上，PDGF是由二硫鍵連接的同源多肽鏈A或者B組成的同源二聚體(PDGF-AA或者PDGF-BB)或者異源二聚體(PDGF-AB)。
PDGF及其異構(gòu)體是通過與靶細(xì)胞上兩個結(jié)構(gòu)相聯(lián)系的受體酪氨酸激酶(RTKs)結(jié)合而實現(xiàn)其功能的。受體α和PDGF的A鏈、B鏈都能結(jié)合，而受體β只能和B鏈結(jié)合。這兩種受體可以被許多體外培養(yǎng)的細(xì)胞系表達(dá)，但主要由體內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。PDGFs可以在體外調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和對細(xì)胞的趨化性(可見綜述Heldin et al.,Biochim Biophys Acta.,1998 1378 F79-113)。在體內(nèi)，由于PDGFs在上皮細(xì)胞(PDGF-A)或者內(nèi)皮細(xì)胞(PDGF-B)中表達(dá)，接近PDGFR表達(dá)的間質(zhì)，所以PDGF可以以較快的方式發(fā)揮功效。在腫瘤細(xì)胞或者體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中，PDGFs和PDGF受體的共表達(dá)會產(chǎn)生信號的自動傳遞環(huán)，這對細(xì)胞轉(zhuǎn)型非常重要(Betsholtz et al.,Cell,1984 39 447-57；Keating et al.,J.R.Coil SurgEdinb.,1990 35 172-4)。PDGFs的過度表達(dá)在一些病理情況下被發(fā)現(xiàn)，包括惡性腫瘤、動脈硬化和纖維增殖病(Heldin et al.,TheMolecular and Cellular Biology of Wound Repair,New York:PlenumPress,1996,249-273)。
作為細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活調(diào)控子的PDGFs的重要性在最近進(jìn)行的小鼠相關(guān)基因的定向研究中被認(rèn)識到，試驗顯示了除了不同的PDGFRs的配基之間會發(fā)生一些重疊之外，PDGFs和它們的受體在生理過程中所發(fā)揮的特有作用。具有兩個無效突變的PDGF配基或者其受體的純合體是無法存活的。大約50％的PDGF-A缺陷的純合體小鼠具有早期致死表型，而剩余的存活的小鼠具有復(fù)雜的產(chǎn)后表現(xiàn)型，具體狀況為由于缺少肺泡肌成纖維細(xì)胞而導(dǎo)致肺泡隔膜的異常形成，從而患有肺氣腫(Bostrom et al.,Cell,1996 85 863-873)。另外，PDGF-A缺陷的小鼠還會具有表皮缺陷的表現(xiàn)型，特征為真皮組織較薄、畸形的毛囊和稀疏的毛發(fā)(Karlsson et al.,Development,1999 126 2611-2)。在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成的過程中也需要PDGF-A(Fruttiger et al.,Development,1999126 457-67)。PDGFR-α缺陷的表現(xiàn)型更容易發(fā)生早期胚胎死亡、頭部非完全閉合、神經(jīng)冠發(fā)育異常、心血管系統(tǒng)缺陷和骨骼缺陷(Soriano et al.,Development,1997 124 2691-70)。PDGF-B和PDGFR-β缺陷的小鼠也具有與上述相似的表現(xiàn)型，特征常常為腎、血液和心血管系統(tǒng)的異常(Leveen et al.,Genes Dev.,1994 8 1875-1887；Soriano et al.,Genes Dev.,1994 8 1888-96；Lindahi et al.,Science,1997277 242-5；Lindahi,Development,1998 125 3313-2)。其中腎和心血管系統(tǒng)的異常至少部分上與缺乏壁細(xì)胞(心血管平滑肌細(xì)胞、外膜細(xì)胞或者腎小球膜細(xì)胞)的正確重組到血管相關(guān)(Leveen et al.,GenesDev.,1994 8 1875-1887；Lindahl et al.,Science,1997 277 242-5；Lindahlet al.,Development,1998 125 3313-2)。
本發(fā)明概述本發(fā)明揭示了一種具有刺激和/或增強表達(dá)PDGF-D受體的細(xì)胞增殖或分化和/或生長和/或運動性活性的新的生長因子，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。另外，編碼新的生長因子的分離的多核苷酸序列和用于診斷和/治療的組合物都屬于本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明一方面提供了一種分離的及純化的核酸分子，其包含的多核苷酸序列與圖3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，圖5所示序列(SEQ ID NO:5)的至少1～966位核苷酸，圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176～1288位核苷酸，或圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938～1288位核苷酸具有至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的相同性。圖3所示序列的至少1-600位核苷酸或圖5所示序列的至少1-966位核苷酸的序列編碼稱為PDGF-D(先前稱為“VEGF-G”)的5’截短的多肽，而圖7所示序列的至少173-1288位核苷酸編碼全長PDGF-D。PDGF-D在結(jié)構(gòu)上與PDGF-A,PDGF-B,VEGF,VEGF-B,VEGF-C和VEGF-D同源。圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸序列編碼PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的一部分，其是PDGF-D的生物學(xué)活性片段。此生物學(xué)活性片段還由圖3所示序列的至少1～600位核苷酸序列，或圖5所示序列的至少1～966位核苷酸序列編碼。在優(yōu)選的實施方案中，此核酸分子是一cDNA，其包含圖3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1-600位核苷酸，圖5所示序列(SEQ ID NO:5)的至少1-966位核苷酸，圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少173-1288位核苷酸，或圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸。本發(fā)明的此方面還涵蓋了具有一序列的DNA分子，這樣所述序列在嚴(yán)格條件下與圖3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，圖5所示序列的至少1-966位核苷酸，圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少173-1288位核苷酸，或圖7所示序列的至少938-1288位核苷酸或它們的片段雜交。
本發(fā)明另一方面提供一種多肽，其具有刺激和/或增強表達(dá)PDGF-D受體的細(xì)胞增殖和/或分化和/或生長和/或運動性(motility)的能力，所述表達(dá)PDGF-D受體的細(xì)胞包括但非限于內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，該多肽包含相當(dāng)于圖4(SEQ ID NO:4)或圖6(SEQ ID NO:6)或圖8(SEQ ID NO:8)所示氨基酸序列或其片段或類似物的氨基酸序列，所述片段或類似物能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，分化，遷移和/或結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)的存活和/或生長和/或運動性。此多肽優(yōu)選與圖4(SEQ IDNO:4)或圖6(SEQ ID NO:6)或圖8(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列，或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物有至少85％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％相同性，一優(yōu)選的片段是包含PDGF-D的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域(PVHD)一部分的截短形式的PDGF-D。該部分PVHD是圖8所示序列的255-371位殘基，其中推定的蛋白酶解加工位點RKSK在255位殘基(SEQ ID NO:8)開始。然而，PVHD自N末端延伸至圖8序列(SEQ ID NO:8)的235位殘基。在此PVHD被定義為截短的PDGF-D。截短的PDGF-D是PDGF-D的推定的活化形式。
本申請中所用的序列相同性百分比是使用Lasergene程序包的“MEGALIGN”序列對比工具(DNASTAR,Ltd.,Abacus House,ManorRoad,West Ealing,London W130AS Unified Kingdom)確定的。MEGALIGN基于J.Hein的方法(酶學(xué)方法，1990 183 626-645)。在成對方式序列對比中使用PAM250殘基量表，其中缺口罰分為11和缺口長度罰分為3,K-tuple值為2。此序列對比然后人工校正并在適于對比的區(qū)域內(nèi)估算相同性數(shù)目。
多肽或多核苷酸編碼的多肽優(yōu)選地能刺激一或多種表達(dá)PDGF-D受體的細(xì)胞的增殖，分化，運動性，存活或血管通透性，所述表達(dá)PDGF-D受體的細(xì)胞包括但非限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)，肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。此多肽或多核苷酸編碼的多肽優(yōu)選地能刺激傷口愈口。PDGF-D還能對細(xì)胞具有拮抗作用，但是包括在PDGF-D的生物學(xué)活性中。這些能力在后文稱作“PDGF-D的生物學(xué)活性”，并通過本領(lǐng)域已知方法而易于測試。
本文所用術(shù)語“PDGF-D”統(tǒng)指圖4(SEQ ID NO:4)，圖6(SEQID NO:6)或圖8(SEQ ID NO:8)所示多肽，及它們的具有上述PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物，還指可編碼PDGF-D或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物的多核苷酸。此多核苷酸可以是裸露的和/或在載體或脂質(zhì)體中。
另一方面，本發(fā)明提供了具有PXCLLVXRCGGNCXC(SEQ IDNO:25)氨基酸序列的多肽，其是PDGF-D獨有的而不同于生長因子的PDGF/VEGF家族的其它成員，因為在第3和第4個半胱氨酸之間插入了3個氨基酸殘基(NCG)(見圖9-SEQ ID NO:10～18)。
包含保守氨基酸取代，插入或缺失，但仍保留PDGF-D生物學(xué)活性的多肽在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知能方便用于產(chǎn)生這種多肽的方法，例如用定點誘變或特異酶切及連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道肽模擬化合物或其中一或多個氨基酸殘基被非天然發(fā)生的氨基酸或氨基酸類似物置換的化合物仍可保留所需的PDGF-D生物學(xué)活性。這種化合物可易于產(chǎn)生并通過常規(guī)活性分析程序如成纖維細(xì)胞增殖分析而測試其呈現(xiàn)PDGF-D生物學(xué)活性的能力，這種化合物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
另外，PDGF-D多肽的可能變體形式及編碼PDGF-D的核酸序列的天然發(fā)生的等位基因變體也涵蓋在本發(fā)明范圍之內(nèi)，所述PDGF-D多肽的可能變體形式可得自可變剪切，如已知的發(fā)生在VEGF與VEGF-B中的剪切。本領(lǐng)域熟知等位基因變體，并相當(dāng)于可變形式或含有一或多個核苷酸的取代，缺失或添加，但不引起編碼的多肽有任何基本功能改變的核酸序列。
這種PDGF-D的變體形式可通過定向修飾PDGF-D多肽的非必需區(qū)域而制備。這些非必需區(qū)域預(yù)期在圖9(SEQ ID NO:10-18)所示強保守的區(qū)域之外。尤其地，PDGF家族的生長因子包括PDGF-D都是二聚體的。PDGF-D與VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF,PDGF-A和PDGF-B略有不同，因為其顯示出在PVHD的8個半胱氨酸殘基中只有7個是完全保守的(Olofsson等，美國科學(xué)院院報，1996 93 2576-2581；Joukov等，EMBO雜志，1996 15290-298)。這些半胱氨酸被認(rèn)為參與分子內(nèi)和分子間二硫鍵。由分子內(nèi)二硫鍵形成的每個亞單位的環(huán)1,2和3參與與生長因子PDGF/VEGF家族受體的結(jié)合(Andersson等，生長因子，1995 12 159-164)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員因此熟知這些半胱氨酸殘基應(yīng)保留在任何提出的變體形式中，且也應(yīng)保留環(huán)1,2和3中存在的活性位點。然而，此分子的其它區(qū)域可預(yù)期是對生物學(xué)功能的重要性較小的，并因而允許適當(dāng)?shù)亩ㄏ蛐揎?。修飾的多肽通過常規(guī)活性分析程序如成纖維細(xì)胞增殖分析，而能易于測試其呈現(xiàn)PDGF-D生物學(xué)活性的能力。
可預(yù)期一些修飾的PDGF-D多肽具有與細(xì)胞上PDGF-D受體結(jié)合的能力，所述細(xì)胞包括但非限于內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但不能刺激細(xì)胞增殖，分化，遷移，能動或存活，或不能誘導(dǎo)血管增殖，結(jié)締組織發(fā)育或傷口愈合。這些修飾的多肽預(yù)期能作為PDGF-D多肽和PDGF/VEGF家族生長因子的競爭性或非競爭性抑制劑，并用于需要阻止或降低PDGF-D多肽或PDGF/VEGF家族生長因子作用的情況中。因此本發(fā)明也包括這種能結(jié)合受體但不促有絲分裂、不誘導(dǎo)分化、不誘導(dǎo)遷移、不誘導(dǎo)運動性、不促進(jìn)存活、不促進(jìn)結(jié)締組織、不促進(jìn)傷口愈合或不誘導(dǎo)血管增殖的PDGF-D多肽的變體，在此稱為“結(jié)合受體但無其它活性的變體”。由于PDGF-D形成二聚體以激活其僅知的受體，預(yù)期一個單體包含結(jié)合受體但無其它活性的變體修飾的PDGF-D多肽，第二個單體包含野生型PDGF-D或PDGF/VEGF家族野生型生長因子。這些二聚體可結(jié)合其相應(yīng)受體，但不能誘導(dǎo)下游信號。
還預(yù)期有其它能阻止野生型PDGF-D或VEGF/PDGF家族野生型生長因子與細(xì)胞上其相應(yīng)受體結(jié)合的修飾的PDGF-D多肽，所述細(xì)胞包括但非限于內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)，肌成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此這些二聚體不能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，分化，遷移，存活或誘導(dǎo)血管通透性，和/或刺激結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和/或分化和/或運動性。這些修飾的多肽預(yù)期能作為PDGF-D生長因子或PDGF/VEGF家族生長因子的競爭性或非競爭性抑制劑，并用于需要阻止或降低PDGF-D生長因子或PDGF/VEGF家族生長因子作用的情況中。這種情況包括發(fā)生在腫瘤細(xì)胞通過原始或轉(zhuǎn)移腫瘤形成而侵染正常細(xì)胞群期間的組織重塑。因此這種結(jié)合PDGF-D或PDGF/VEGF家族生長因子，但不促有絲分裂、不誘導(dǎo)分化、不誘導(dǎo)遷移、不誘導(dǎo)運動性、不促進(jìn)存活、不促進(jìn)結(jié)締組織、不促進(jìn)傷口愈合或不促進(jìn)血管增殖的PDGF-D生長因子的變體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)，并在此稱為“形成PDGF-D生長因子二聚體但無其它活性或干擾變體”。
形成PDGF-D生長因子二聚體但無其它活性或干擾變體例如是具有阻止CUB結(jié)構(gòu)域從蛋白質(zhì)裂解的突變的PDGF-D。進(jìn)一步預(yù)期可產(chǎn)生包含與CUB結(jié)構(gòu)域連接的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-C,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D或P1GF的單體，優(yōu)選活化的單體的形成PDGF生長因子二聚體但無其它活性的變體，該CUB結(jié)構(gòu)域具有阻止CUB結(jié)構(gòu)域從蛋白質(zhì)裂解的突變。上述形成PDGF-D生長因子但無其它活性的變體與連接有突變CUB結(jié)構(gòu)域的單體形成的二聚體不能結(jié)合其相應(yīng)受體。
此期望變體的一個變化是在VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-C,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D或P1GF的活化的單體與突變CUB結(jié)構(gòu)域的連接之間，插入一蛋白酶解位點，所述突變CUB結(jié)構(gòu)域是與活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D或P1GF單體二聚體化的。加入此蛋白酶解位點特異的蛋白酶將酶切CUB結(jié)構(gòu)域，從而釋放活化的二聚體，其隨后能與其相應(yīng)受體結(jié)合。在此方式中，可對活化的二聚體的釋放加以控制。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了編碼上述本發(fā)明多肽或多肽片段的純化的及分離的核酸。此核酸可以是DNA，基因組DNA,cDNA或RNA，且可以是單鏈或雙鏈的。此核酸可以分離自細(xì)胞或組織來源，或是重組或合成起源的。由于遺傳密碼的簡并，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到許多這樣的編碼序列是可能的，其中每個序列編碼圖4(SEQID NO:4)，圖6(SEQ ID NO:6)或圖8(SEQ ID NO:8)所示氨基酸序列，其生物學(xué)活性片段或類似物，其結(jié)合受體但無其它活性或部分失活的變體，或其形成PDGF-D二聚體但無其它活性或干擾變體。
本發(fā)明第四方面提供了包含本發(fā)明的cDNA或核酸分子的載體，及用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。這些細(xì)胞尤其適于表達(dá)本發(fā)明的多肽，其包括昆蟲細(xì)胞如Sf9細(xì)胞，Sf9細(xì)胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC SRL-171)，并用桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞還包括用適當(dāng)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的人胚胎腎細(xì)胞系293-EBNA。本發(fā)明優(yōu)選的載體是表達(dá)載體，其中本發(fā)明的核酸有效地連接于一或多個適當(dāng)?shù)膯幼雍?或其它控制序列，這樣用載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞能表達(dá)本發(fā)明的多肽。其它優(yōu)選的載體是那些適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，或適于基因治療的載體，如腺病毒載體，痘苗載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或脂質(zhì)體。本領(lǐng)域已知許多這種載體。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生能表達(dá)由本發(fā)明核酸分子編碼的多肽的載體的方法，包括如上述將核酸分子有效地與一或多個適當(dāng)?shù)膯幼雍?或其它控制序列連接。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子或載體，并從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中分離多肽。
本發(fā)明另一方面提供了與本發(fā)明的多肽或多肽片段特異反應(yīng)的抗體。此抗體包括特異于PDGF-D的變體、免疫反應(yīng)片段、類似物及重組體的抗體。這種抗體用作PDGF-D的抑制劑或興奮劑并用作診斷劑以檢測并定量PDGF-D?？墒褂枚嗫寺』騿慰寺】贵w。單克隆和多克隆抗體可以用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法，通過針對本發(fā)明的多肽或其片段或類似物而產(chǎn)生。另外，此多肽可與表位標(biāo)記如FLAG八肽(Sigma,St.Louis,Mo)結(jié)合，以助于親和純化。為了某些目的，例如單克隆抗體用于臨床抑制PDGF-D的功效時，需要用人化或嵌合的單克隆抗體。這種抗體可以是通過加入胞毒性或細(xì)胞抑制性藥物而進(jìn)一步修飾的。本領(lǐng)域熟知生產(chǎn)這些抗體的方法，包括重組DNA方法。
本發(fā)明的抗體還包括識別PDGF-D并適當(dāng)標(biāo)記的抗體。
本發(fā)明的多肽或抗體可用可檢測標(biāo)志物標(biāo)記以用于診斷目的。相似地，本發(fā)明這樣標(biāo)記的多肽可用于鑒別其體內(nèi)相應(yīng)受體。此多肽或抗體可共價或非共價地偶聯(lián)于適當(dāng)?shù)某判缘?，順磁性的，電子致密的，生態(tài)的或放射活性的試劑以顯影。診斷分析可使用放射性或非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記例如包括放射性原子或基團(tuán)如125I或32P。非放射性標(biāo)記例如包括酶標(biāo)記如辣根過氧化物酶，或熒光性標(biāo)記如異硫氰酸熒光素(FITC)。標(biāo)記可以是直接或間接的，共價或非共價的。
本發(fā)明的臨床應(yīng)用包括診斷應(yīng)用，加速組織或器官移植中血管生成，或刺激傷口愈合或結(jié)締組織發(fā)育，或在梗塞組織或狹窄動脈情況下如冠狀動脈疾病時建立側(cè)支循環(huán)，及抑制癌癥或糖尿病視網(wǎng)膜病變中的血管生成，并抑制發(fā)生在腫瘤細(xì)胞通過原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤形成而侵染正常細(xì)胞群期間的組織重塑。PDGF-D在癌癥活組織檢查樣品中的數(shù)量可用作進(jìn)一步轉(zhuǎn)移的危險指標(biāo)。
PDGF-D還與各種肺系疾病相關(guān)。PDGF-D分析可用于診斷各種肺部疾病。PDGF-D還用于治療肺部疾病以改良肺部血液循環(huán)和/或肺與血液之間的氣體交換。相似地，PDGF-D可用于改良心臟病人的心臟血液循環(huán)及氧氣的通透性。以相似的方式，PDGF-D可用于改善慢性阻塞性呼吸道疾病中的血液流動及氣體交換。
因此，本發(fā)明提供了在需要這種治療的哺乳動物體內(nèi)刺激血管生成，淋巴管生成，神經(jīng)發(fā)育，結(jié)締組織發(fā)育和/或傷口愈合的方法，包括給哺乳動物施用有效量的PDGF-D，或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物。任選地，PDGF-D或其片段或類似物可與一或多個VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,FGF和/或肝素一起或綴合施用。
相反，PDGF-D拮抗劑(如抗體和/或二聚體形成及受體結(jié)合中PDGF-D結(jié)合的競爭性或非競爭性抑制劑)可用于治療一些疾病，如充血性心臟病，包括由于血管通透性增加導(dǎo)致的肺內(nèi)積液，可通過對血管通透性施加分流作用以抵銷積液。施用PDGF-D可用于治療腸道，肝或腎吸收不良綜合征，使其血液循環(huán)增加及血管通透性提高。
因此，本發(fā)明提供了一種在需要這種治療的哺乳動物體中抑制血管生成，淋巴管生成，神經(jīng)發(fā)育，結(jié)締組織發(fā)育和/或傷口愈合的方法，包括給此哺乳動物施用有效量的PDGF-D的拮抗劑。該拮抗劑可以是阻止PDGF-D作用的任何制劑，可通過阻止PDGF-D與其靶細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，或如用結(jié)合受體的PDGF-D變體阻止受體的作用而進(jìn)行。適當(dāng)?shù)霓卓箘┌ǖ窍抻诳筆DGF-D的抗體；PDGF-D與PDGF-D受體結(jié)合的競爭性或非競爭性抑制劑，如上述結(jié)合受體或形成PDGF-D二聚體但不促有絲分裂的PDGF-D變體；和如下述的反義核苷酸序列。
本發(fā)明提供了一種確定與活化的截短形式的PDGF-D結(jié)合的制劑的方法。此方法包括將活化的截短形式的PDGF-D與測試的制劑接觸，并通過任何適當(dāng)方法監(jiān)測結(jié)合情況。制劑中包括化合物和其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種篩選系統(tǒng)，以揭示與活化的截短形式的PDGF-D結(jié)合的制劑。此篩選系統(tǒng)包括制備活化的截短形式的PDGF-D，將此活化的截短形式的PDGF-D暴露于測試制劑，并通過任何適當(dāng)方式確定所述制劑與活化的截短形式的PDGF-D的結(jié)合數(shù)量。此篩選系統(tǒng)還可用于鑒別抑制全長PDGF-D蛋白的蛋白酶裂解，從而阻止活化的截短形式的PDGF-D釋放的制劑。為此，必須制備全長PDGF-D。
使用此篩選系統(tǒng)可確定可以改變PDGF-D生物學(xué)功能的化合物。此篩選方法可適應(yīng)大規(guī)模的自動程序如PANDEX(Baxter-DadeDiagnostics)系統(tǒng)，以充分高容量篩選潛在的治療劑。
為了此篩選系統(tǒng)，如本文所述制備活化的截短形式的PDGF-D或全長PDGF-D，優(yōu)選用重組DNA技術(shù)制備。將一測試制劑如化合物或蛋白質(zhì)導(dǎo)入含有活化的截短形式的或全長PDGF-D的反應(yīng)容器中。通過任何適當(dāng)方式確定測試制劑與活化的截短形式的或全長PDGF-D的結(jié)合情況，包括但非限于使用放射性或化學(xué)性標(biāo)記的測試制劑。活化的截短形式的或全長PDGF-D的結(jié)合也可如美國專利5,585,277中所述方法進(jìn)行。在此方法中，通過監(jiān)測折疊的蛋白與未折疊蛋白的比率，確定測試制劑與活化的截短形式的或全長PDGF-D的結(jié)合情況。此監(jiān)測例如可包括但非限于監(jiān)測活化的截短形式的或全長PDGF-D對蛋白酶的敏感性，或監(jiān)測抗折疊蛋白的特異抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合的性質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到IC50值取決于測試制劑的選擇性。例如，IC50小于10nM的制劑通常被認(rèn)為是藥物治療的良好候選物。然而，對于特定靶具有低親和性但有選擇性的制劑可以是更好的候選物。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到關(guān)于特定制劑的結(jié)合潛能，抑制活性或選擇性的信息對藥物的開發(fā)是有用的。
在PDGF-D或PDGF-D拮抗劑用于治療目的時，施用劑量和途徑將依賴于患者的性質(zhì)及要治療的疾病而定，且隨醫(yī)生或獸醫(yī)診斷而定。適當(dāng)?shù)氖┯猛緩桨诜?，皮下注射，肌肉注射，腹膜?nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，非腸道施用，局部應(yīng)用，植入等，PDGF-D局部應(yīng)用與VEGF的局部應(yīng)用方式相同。在用于傷口愈合或增加血管生成是有利的情況下，施用于生物體的活化的截短形式的PDGF-D的有效量是在每公斤體重0.1～1000μg之間。
PDGF-D或PDGF-D拮抗劑可與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體組合應(yīng)用。所得組合物包括治療有效量的PDGF-D或PDGF-D拮抗劑，及其藥物可接受無毒性鹽，和藥物可接受固態(tài)或液體載體或佐劑。這種載體或佐劑例如包括但非限于鹽水，緩沖鹽水，Ringer’s溶液，礦物油，滑石，玉米淀粉，明膠，乳糖，蔗糖，微晶纖維素，高嶺土，甘露糖醇，磷酸二鈣，氯化鈉，藻酸，葡萄糖，水，甘油，乙醇，增稠劑，穩(wěn)定劑，懸浮劑及其組合。這種組合物可以是溶液，懸浮液，片劑，膠囊，乳劑，油膏，酏劑，糖漿，糊片包干藥，軟膏或其它常用形式。配方要適于施用方式。含有PDGF-D的組合物還可任選地進(jìn)一步包含一或多種PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF和/或肝素。含有PDGF-D的組合物將含有大約0.1％～90％(重)的活性化合物，優(yōu)選10％～30％的活性化合物。
為制備肌內(nèi)注射劑，可將一無菌配方優(yōu)選活化的截短形式PDGF-D的適當(dāng)可溶性鹽，如鹽酸鹽，溶解并于藥物稀釋劑如無熱原水(蒸餾水)，生理鹽水或5％葡萄糖溶液中施用?？芍苽溥m當(dāng)?shù)牟蝗苄问降幕衔?，并于水性基質(zhì)或藥物可接受油性基質(zhì)例如長鏈脂肪酸酯如油酸乙酯中形成懸浮液而施用。
本發(fā)明另一方面提供了典型地為測試試劑盒形式的診斷/預(yù)防裝置。例如在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種診斷/預(yù)防性測試試劑盒，其包括PDGF-D的抗體及檢測更優(yōu)選地評價抗體與PDGF-D之間的結(jié)合的手段。在本發(fā)明優(yōu)選的一個診斷/預(yù)防性裝置的實施方案中，提供了抗PDGF-D的抗體(一級抗體)的相同同種型和動物來源的抗體的二級抗體。此二級抗體直接或間接地與可檢測標(biāo)記偶聯(lián)，然后未標(biāo)記的一級抗體或PDGF-D結(jié)合底物，如此在一級抗體與PDGF-D結(jié)合，隨后標(biāo)記的二級抗體與一級抗體結(jié)合后，測定與底物結(jié)合的標(biāo)記數(shù)量，可確定PDGF-D/一級抗體間的相互作用。在本發(fā)明尤為優(yōu)選的實施方案中，提供的診斷/預(yù)防裝置是常用的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒。
在另一實施方案中，診斷/預(yù)防裝置可包括聚合酶鏈反應(yīng)手段，以確定測試個體PDGF-D的序列差異及對比此序列結(jié)構(gòu)與本發(fā)明揭示的序列結(jié)構(gòu)間的任何異常，以確定PDGF-D表達(dá)中的任何異常是否與給定的疾病相關(guān)。
另外，診斷/預(yù)防裝置可包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)產(chǎn)生手段，其是利用限制酶和測試個體的基因組DNA在凝膠上產(chǎn)生DNA條帶模式，并對比此模式與本發(fā)明揭示的模式，以確定PDGF-D表達(dá)中的任何異常是否與給定疾病相關(guān)。
本發(fā)明另一方面提供了檢測測試個體中PDGF-D基因結(jié)構(gòu)中異常的方法，該基因結(jié)構(gòu)異常與測試個體中給定疾病相關(guān)。此方法包括提供所述測試個體的DNA樣品；將此DNA樣品與有效地與聚合酶偶聯(lián)的一系列特異于PDGF-D DNA的引物接觸；通過聚合酶鏈反應(yīng)選擇性地擴增樣品中的DNA；并將擴增的PDGF-D DNA的核苷酸序列與圖3(SEQ ID NO:3)，圖5(SEQ ID NO:5)或圖7(SEQ ID NO:7)所示核苷酸序列相對比。本發(fā)明還提供了一種測試試劑盒，其包括有效與聚合酶偶聯(lián)的一對特異于PDGF-DDNA的引物，從而所述聚合酶能選擇性地擴增DNA樣品中的PDGF-DDNA。
本發(fā)明還提供了一種檢測生物樣品中PDGF-D的方法，包括將此樣品與能結(jié)合PDGF-D的試劑接觸，并檢測結(jié)合情況。優(yōu)選的能結(jié)合PDGF-D的試劑是抗PDGF-D的抗體，尤其是單克隆抗體。在一優(yōu)選的實施方案中，通過可檢測的標(biāo)記檢測結(jié)合情況，適當(dāng)?shù)臉?biāo)記如上所述。
本發(fā)明另一方面提供一種包含PDGF-D多肽的蛋白質(zhì)二聚體，尤其是二硫鍵連的二聚體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)二聚體包括PDGF-D多肽的同源二聚體、及PDGF-D與VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF,PDGF-A,PDGF-B或PDGF-C的異源二聚體。
本發(fā)明再一方面提供了分離PDGF-D的方法，包括將表達(dá)PDGF-D的細(xì)胞暴露于肝素，以促進(jìn)細(xì)胞釋放PDGF-D，并純化這種釋放的PDGF-D。
本發(fā)明另一方面提供了一種載體，其包含與編碼PDGF-D或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物的DNA序列的至少一部分互補的反義核苷酸序列。另外，此反義核苷酸序列可以針對PDGF-D基因的啟動子區(qū)或其它非編碼區(qū)，其可以用于抑制或至少減輕PDGF-D表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，這種含有反義序列的載體可用于抑制或至少減輕PDGF-D表達(dá)。使用這類抑制PDGF-D表達(dá)的載體在PDGF-D表達(dá)與疾病相關(guān)的情況下是有利的，所述疾病例如腫瘤產(chǎn)生PDGF-D以提供血管生成，或在腫瘤細(xì)胞通過原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤形成侵染正常細(xì)胞群期間發(fā)生的組織重塑。用含有反義核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化這種腫瘤細(xì)胞將抑制或延遲血管生成，及抑制或延遲腫瘤或重塑組織的生長。
本發(fā)明的另一方面涉及的是發(fā)現(xiàn)全長PDGF-D蛋白似乎是潛伏生長因子，其需要通過蛋白酶加工釋放活性PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域而被激活。一推定的蛋白酶解位點發(fā)現(xiàn)在全長蛋白的255-258位殘基，即RKSK殘基(SEQ ID NO:9)。這是二堿性基序。推定的-RKSK-(SEQ ID NO:9)蛋白酶解位點也發(fā)現(xiàn)在PDGF-A,PDGF-B,VEGF-C和VEGF-D中。在這四種蛋白中，還發(fā)現(xiàn)推定的蛋白酶解位點就在PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的最小結(jié)構(gòu)域之前。這些事實表明這是蛋白酶解位點。
優(yōu)選的蛋白酶包括但非限于纖溶酶，因子X和腸激酶。N末端CUB結(jié)構(gòu)域可作為抑制結(jié)構(gòu)域，其可用于在一些胞外區(qū)室中保持PDGF-D處于潛伏形式，且當(dāng)需要PDGF-D時，通過有限蛋白酶解將其除去。
本發(fā)明另一方面提供了生產(chǎn)活化的截短形式PDGF-D或調(diào)節(jié)PDGF-D結(jié)合受體的特異性的方法。這些方法包括表達(dá)含有編碼具有PDGF-D生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，并提供蛋白酶解量的至少一種酶加工表達(dá)的多肽以產(chǎn)生活化的截短形式PDGF-D。
本發(fā)明此方面還包括選擇性活化具有生長因子活性的多肽的方法。此方法包括表達(dá)含有一種多核苷酸的表達(dá)載體，該多核苷酸編碼具有生長因子活性，CUB結(jié)構(gòu)域及多肽與CUB結(jié)構(gòu)域之間的蛋白酶解位點的多肽，此方法并還包括提供蛋白酶解量的至少一種酶加工表達(dá)的多肽以產(chǎn)生具有生長因子活性的活化的多肽。
另外，本發(fā)明的此方面還包括分離編碼具有PDGF-D生物學(xué)活性的多肽，或編碼包含具有氨基酸序列RKSR(SEQ ID NO:9)或其相反結(jié)構(gòu)氨基酸序列的多肽的核酸分子的方法。
本發(fā)明的此方面還包括一種分離的二聚體，其包含一活化的PDGF-D單體和一活化的與CUB結(jié)構(gòu)域連接的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C或P1GF單體，或者是包含活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF單體及與CUB結(jié)構(gòu)域連接的活化的PDGF-D單體。此分離的二聚體可以包括或不包括在活化的單體與CUB結(jié)構(gòu)域連接之間的蛋白酶解位點。
本發(fā)明的多核苷酸，如上述那些多核苷酸及其片段，及在嚴(yán)格條件下與那些多核苷酸的非編碼鏈雜交的多核苷酸變體都可用于鑒別，純化及分離編碼其它非人類哺乳動物的PDGF-D的多核苷酸。因此，這種多核苷酸片段和變體也是本發(fā)明的一部分。嚴(yán)格雜交條件例如是如下所示在42℃在5X SSC,20mM NaPO4,pH6.8,50％甲酰胺中雜交；并在42℃用0.2×SSC洗滌，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道根據(jù)雜交序列的長度及GC核苷酸堿基含量可對雜交條件加以改變，并且存在測定這種改變的公式。例如參見Sambrook等，“分子克隆實驗手冊”，第二版，P9.47-9.51，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989)。
另外，純化及分離的編碼其它非人類哺乳動物PDGF-D的多核苷酸，及由其編碼的多肽及與非人類PDGF-D變體特異免疫反應(yīng)的抗體也是本發(fā)明的一部分。因此，本發(fā)明包括一種純化及分離的哺乳動物PDGF-D多肽，還包括一種編碼這種多肽的純化的及分離的多核苷酸。
應(yīng)清楚的是，本發(fā)明的核酸和多肽可通過合成方式或重組方式制備，或可從天然來源中純化。
更應(yīng)清楚的是本文所用術(shù)語“包含”是指“包括但非限于”之意。
附圖簡述

圖1(SEQ ID NO:1)示出一個核苷酸序列，其包括編碼人PDGF-D(hPDGF-D)C末端部分的cDNA序列。編碼hPDGF-D部分片段的核苷酸是1～198位核苷酸。衍生自圖1所示序列1-198位核苷酸的推導(dǎo)的部分hPDGF-D氨基酸序列(SEQ ID NO:2,66個氨基酸殘基)示于圖2。
圖3(SEQ ID NO:3)示出編碼hPDGF-D的部分人cDNA的延伸序列。翻譯的cDNA序列是從1至600位核苷酸。衍生自圖3的1～600位核苷酸的推導(dǎo)的部分hPDGF-D氨基酸序列(200個殘基，SEQ ID NO:4)示于圖4。
圖5示出部分人cDNA的進(jìn)一步延伸的核苷酸序列。編碼5’截短的全長hPDGF-D的核苷酸是1～966位(SEQ ID NO:5)。衍生自圖5的1～966位核苷酸的推導(dǎo)的部分hPDGF-D氨基酸序列(322個殘基，SEQ ID NO:6)示于圖6。
圖7(SEQ ID NO:7)示出編碼hPDGF-D的cDNA的完整核苷酸序列(1116bp)，由其編碼的含有371個氨基酸殘基的推導(dǎo)的全長hPDGF-D的氨基酸序列示于圖8(SEQ ID NO:8)。
圖9示出hPDGF-D中PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域與VEGF/PDGF家族的一些生長因子(分別為SEQ ID NO:10-18)之間的氨基酸序列對比。
圖10示出VEGF/PDGF家族的一些生長因子的系統(tǒng)發(fā)育世系圖。
圖11提供了hPDGF-D中存在的CUB結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:19)和其它CUB結(jié)構(gòu)域即人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1中存在的CUB結(jié)構(gòu)域(hBMP-1,CUB1-3結(jié)構(gòu)域)(分別為SEQ ID NO:20-22)和人neuropilin-1的2個CUB結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO:23-24)之間的氨基酸序列對比。
圖12示出含有截短的PDGF-D的條件培養(yǎng)基刺激PAE-1細(xì)胞中的PDGFβ-受體的酪氨酸磷酸化。
圖13示出含有截短的PDGF-D的條件培養(yǎng)基(CM)與PDGF-β受體競爭結(jié)合PDGF-BB同源二聚體而不與PDGF-α受體競爭結(jié)合PEGF-AA同源二聚體。
優(yōu)選的實施方案詳述圖1示出了編碼稱為PDGF-D(先前稱為VEGF-G)的一種新生長因子的C末端部分的人cDNA核苷酸序列。PDGF-D是VEGF/PDGF家族的一個新成員。圖1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)衍生自位于華盛頓特區(qū)的NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫中的人EST序列(id.A1488780)。圖1(SEQ ID NO:1)的cDNA的1～198位核苷酸編碼一個66個氨基酸的多肽(圖2,SEQ ID NO:2)，該多肽與VEGF/PDGF家族的已知成員具有一些序列相似性。
由圖1(SEQ ID NO:1)所示多核苷酸的1-198位核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列示于圖2(SEQ ID NO:2)。
為產(chǎn)生更多的關(guān)于人PDGF-D的序列信息，用一個327bp的經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的探針，基于先前鑒別的EST序列篩選人胎肺λgt10 cDNA文庫。該探針通過用衍生自鑒別的EST(AI488780)的兩個引物經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生自商購的人胎肺cDNA文庫(Clontech)的DNA。此二個引物是5’-GTCGTGGAACTGTCAACTGG(正向)(SEQ ID NO:26)和5’-CTCAGCAACCACTTGTGTTC(反向)(SEQ ID NO:27)。
擴增的327bp的片段克隆至pCR2.1載體中(Invitrogen)。對核苷酸測序檢定插入物相當(dāng)于EST。此篩選鑒別了一些陽性克隆，將這些克隆中克隆5和克隆8的插入物亞克隆至pBluescript中，并用內(nèi)在的或載體特異性引物進(jìn)行核苷酸測序。確定的核苷酸序列與上述二克隆相同，并示于圖3(SEQ ID NO:3)。690bp的多核苷酸的編碼區(qū)是編碼除5’端之外大部分hPDGF-D的核苷酸1-600(SEQID NO:3)。hPDGF-D的此部分包括hPDGF-D的生物學(xué)活性片段。衍生自圖3(SEQ ID NO:3)的1～600位核苷酸的推導(dǎo)的hPDGF-D的部分氨基酸序列(200個殘基，SEQ ID NO:4)示于圖4(SEQID NO:4)。
對從這一人胎肺cDNA文庫的分離的人PDGF-D cDNA克隆的延伸的核苷酸進(jìn)行測序，提供了另外的序列。圖5(SEQ ID NO:5)示出了編碼hPDGF-D的部分人cDNA(1934bp)的核苷酸序列。此1934bp多核苷酸的編碼區(qū)是編碼除5’最末端之外hPDGF-D多肽的1-966位核苷酸。衍生自圖5(SEQ ID NO:5)1-966位核苷酸的推導(dǎo)的hPDGF-D的部分氨基酸序列(322個殘基，SEQ ID NO:6)示于圖6(SEQ ID NO:6)。
圖7示出編碼全長hPDGF-D的cDNA的多核苷酸序列。編碼PDGF-D的區(qū)域是1116bp。全長hPDGF-D的推導(dǎo)的氨基酸序列是371個氨基酸殘基(圖8,SEQ ID NO:8)。
全長PDGF-D的5’端序列是用cDNA末端快速擴增(RACE)PCR和含有人心臟cDNA的克隆(Marathon-ReadyTMcDNA,Clontech,Cat#7404-1)獲得的。這些eDNA克隆有一附著于每個克隆的5’端的銜接頭序列，其包括稱為銜接子引物1的位點(Clontech:5’9CCAT CCTAATACGACTCACTATAGGGC 3’9)(SEQ ID NO:28)。此引物和第二個引物5’AGTGGGATCCGTTACTGATGGAGAGTTAT3’(SEQ ID NO:29)用于擴增在PDGF-D5’端發(fā)現(xiàn)的序列。在PCR反應(yīng)中，使用一種特殊的聚合酶混合物(Advantage＜＜-GC cDNAPCR試劑盒，Clontech,Cat#K1907-1)。反應(yīng)混合物包括銜接子引物1 1μl基因特異性引物 1μl模板(人心臟cDNA)5μlGC-Melt(取自K1907-1試劑盒) 5μl5×GC cDNA PCR反應(yīng)緩沖液10μl50×dNTP混合物 1μl無菌水 27μl共計50μl。
將PDGF-D的5’端擴增31個循環(huán)，5個循環(huán)包括在94℃變性45秒并在72℃延伸4分鐘；另5個循環(huán)包括在94℃變性45秒并在70℃延伸4分鐘；再5個循環(huán)包括在94℃變性45秒并在68℃延伸4分鐘，且初始在94℃變性2分鐘。從該PCR中獲得大約790bp長的產(chǎn)物。將此產(chǎn)物置于1％瓊脂糖凝膠中，并從此凝膠中純化(QIA快速凝膠提取試劑盒，Qiagen,Cat#28706)及轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)中。鋪板轉(zhuǎn)化的細(xì)菌并在37℃溫育過夜。挑取單一克隆在新鮮培養(yǎng)基中生長過夜。制備質(zhì)粒(QIAprep Spin微量制備試劑盒，Qiagen,Cat#27106)，并用質(zhì)粒引物T7和M13R測序。測序結(jié)果是獲得312bp的先前未知的PDGF-D序列。此序列的剩余部分(478bp)與先前從其它PDGF-D cDNA克隆中獲得的序列相同。
圖9示出PDGF-D的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域(發(fā)現(xiàn)在多肽的C末端區(qū)內(nèi))，與PDGF/VEGF家族成員VEGF165,P1GF-2,VEGF-B167,Pox Off VEGF,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A和PDGF-Br的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO:10-18)的氨基酸序列對比。在此圖中VEGF-C和VEGF-D的N和C末端區(qū)域內(nèi)缺失一些氨基酸序列。導(dǎo)入缺口以使序列對比最佳化。此序列對比是用基于J.Hein的方法(酶學(xué)方法，1990 183 626-45)的MEGALIGN序列對比工具產(chǎn)生的。在成對序列對比中，使用使用PAM250殘基量表，其中缺口罰分為11和缺口長度罰分為3,K-tuple值為2。然后人工校正此序列對比，并確定在適于對比的區(qū)域內(nèi)相同的數(shù)目?？騼?nèi)殘基代表在二個相隔單位內(nèi)與VEGF-D配對的氨基酸。
該序列對比示出PDGF-D具有期望的不變半胱氨酸殘基模式一此家族成員的標(biāo)志，但有二個例外。第一個例外發(fā)生在半胱氨酸3和4之間。正常情況下這二個半胱氨酸間隔2個殘基，而PDGF-D有3個額外氨基酸(NCA)插入。PDGF-D中此序列特點是出乎預(yù)料的。第二個例外是在PDGF/VEGF家族其它成員中發(fā)現(xiàn)的不變的第5個半胱氨酸在PDGF/VEGF中不是保守的。這一特征是PDGF-D中特有的。
基于圖9的氨基酸序列對比，構(gòu)建發(fā)育世系圖并示于圖10。數(shù)據(jù)示出PDGF-D的PVHD與VEGF-C和VEGF-D的PVHDs密切相關(guān)。
CUB結(jié)構(gòu)域圖11的部分PDGF-D氨基酸序列的N末端區(qū)(54-171位殘基)(SEQ ID NO:8)有稱作CUB結(jié)構(gòu)域(Bork和Beckmann，分子生物學(xué)雜志，1993 231,539-545)的第二個獨特的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。此大約115個氨基酸的結(jié)構(gòu)域初始是在補體因子Clr/Cls中鑒別的，但近年來已在一些其它胞外蛋白質(zhì)中鑒別，包括信號分子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(BMP-1)(Wozney等，科學(xué)，1988 242,1528-1534)，以及一些受體分子如neuropilin-1(NP-1)(Soker等，細(xì)胞，1998 92 735-745)。CUB結(jié)構(gòu)域的作用原理還不清楚，但它們參與蛋白質(zhì)之間相互作用或與碳水化合物包括肝素硫酸粘蛋白相互作用。這些相互作用可發(fā)揮PDGF-D的蛋白酶解作用。
如圖11所示，對比了一些含有CUB的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。結(jié)果示出人PDGF-D中的單一CUB結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:19)與大多數(shù)密切相關(guān)的CUB結(jié)構(gòu)域明顯一致。圖中示出了具有3個CUB結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO:20-22)(CUB1-3)的人BMP-1序列，和具有2個CUB結(jié)構(gòu)域(CUB 1-2)(分別為SEQ ID NO:23-24)的人neuropilin序列。此序列對比如上述產(chǎn)生。
實施例1:PDGF-D轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)為研究PDGF-D在一些人體組織中的表達(dá)，用商購的多重組織Northern印跡試劑盒(MTN,Clontech)進(jìn)行Northern印跡。根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)，用Express Hyb溶液在68℃將印跡雜交1小時(高度嚴(yán)格條件)，并用327bp的經(jīng)PCR產(chǎn)生自人胎肺組織cDNA文庫的探針(如上所述)探查。該印跡隨后在50℃用含有0.05％SDS的2X SSC洗滌30分鐘，并在50℃用含有0.1％SDS的1X SSC洗滌40分鐘。然后將此印跡進(jìn)行照相并在-70℃曝光。概括于表1的結(jié)果示出PDGF-D轉(zhuǎn)錄物在心臟，胰腺和卵巢是高度表達(dá)的，而在胎盤，肝，腎，前列腺和睪丸是低表達(dá)的。人PDGF-D轉(zhuǎn)錄物長度大約為4kb。
表1通過Northern印跡分析測定的PDGF-D轉(zhuǎn)錄物在一些人體組織中的相對表達(dá)水平組織水平* 表達(dá)心臟 +++++腦n.d.
胎盤 ++肺+肝++骨骼肌n.d.
腎++胰腺 ++++脾+胸腺 +前列腺++睪丸 +++卵巢 +++++小腸 ++結(jié)腸 +外周血白細(xì)胞 +*條帶的相對強度目視確定，最高表達(dá)(+++++)，最低表達(dá)(+),n.d代表未檢測到。
實施例2截短的PDGF-D的受體結(jié)合性質(zhì)為確定截短的PDGF-D與VEGF受體間的相互作用，對截短的PDGF-D結(jié)合含有人VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3的胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性Ig-融合蛋白的能力進(jìn)行測試(Olofsson等，美國科學(xué)院學(xué)報，1998 95 11709-11714)。一種編碼PDGF-D的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體在載體pSecTag(Invitrogen)中產(chǎn)生。引物5’-CCCAAGCTTGAAGATCTTGAGAATAT 3’(正向)(SEQ ID NO:30)和5’TGCTCTAGATCGAGGTGGTCTT3’(反向)(SEQ ID NO:31)用于擴增編碼圖6(SEQ ID NO:6)的186-322位氨基酸殘基的一個429bp的片段(圖5的556-966位核苷酸)(SEQ ID NO:5)。此片段隨后克隆入HindⅢ和XbaⅠ消化的表達(dá)載體中。用編碼截短的PDGF-D的該表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體經(jīng)磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。表達(dá)的多肽包括C末端c-myc標(biāo)記和6x His標(biāo)志(均衍生自pSecTag載體)。
將稱為VEGFR-1-Ig,VEGFR-2-Ig和VEGFR-3-Ig的Ig-融合蛋白在人293 EBNA細(xì)胞中瞬時表達(dá)。所有的Ig-融合蛋白都是人VEGFR。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后培育24小時，用含有0.2％小牛血清白蛋白(BSA)的Dulbeccos極限必需培養(yǎng)基(DMEM)洗滌并饑餓24小時。然后用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)將融合蛋白從澄清的條件培養(yǎng)基中沉淀。將珠與100微升的10X結(jié)合緩沖液(5％BSA,0.2％Tween20和10μg/ml肝素)和900微升的條件培養(yǎng)基合并，該條件培養(yǎng)基制備自用截短的PDGF-D的表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞。細(xì)胞然后用35S-半胱氨酸和甲硫氨酸(Promix,Amersham)代謝性標(biāo)記4-6小時。在2.5小時后，在室溫用結(jié)合緩沖液洗滌3次，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌1次，并在SDS-PAGE緩沖液中煮沸。對與Ig-融合蛋白結(jié)合的標(biāo)記的蛋白在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析。放射標(biāo)記的蛋白用磷光顯像分析儀和/或照相檢測。在所有這些分析中，放射標(biāo)記的PDGF-D未示出與任何VEGF受體的任何相互作用。這些結(jié)果表明分泌性截短的PDGF-D不與VEGF受體R1,R2和R3結(jié)合。
實施例3:PDGFβ-受體磷酸化為測試PDGF-D是否導(dǎo)致PDGFβ-受體磷酸化增加，對截短的PDGF-D結(jié)合PDGFβ-受體和刺激磷酸化增加的能力進(jìn)行測試。將穩(wěn)定地表達(dá)人PDGFβ-受體的血清饑餓的豬動脈內(nèi)皮-1(PAE-1)細(xì)胞(Eriksson等，EMBO雜志，1992 11 543-550)，在冰上與一種溶液保溫90分鐘，該溶液為條件培養(yǎng)基與等體積的含有1mg/ml BSA的PBS混合形成。此條件培養(yǎng)基制備自用PDGF-A或截短的PDGF-D的表達(dá)載體(如實施例1中構(gòu)建)，或模擬對照載體轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時后，將培養(yǎng)基用含有1mg/ml血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基置換。另外培養(yǎng)48小時后收獲條件培養(yǎng)基。在加入條件培養(yǎng)基60分鐘后，細(xì)胞在裂解緩沖液(20mMTRIS-HCl,pH7.5,0.5％Triton X-100,0.5％脫氧膽酸，10mM EDTA,1mM正鋇酸鹽，1mM PMSF,1％抑肽酶)中裂解。PDGFβ-受體用抗人PDGFβ-受體的兔抗血清(Eriksson等，EMBO雜志，199211 543-440)從澄清的裂解物中免疫沉淀出來。此沉淀的受體施加于SDS-PAGE凝膠，在SDS凝膠電泳后，將沉淀的受體移至硝基纖維素濾膜，并將濾膜用抗磷酸酪氨酸抗體PY-20(轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗室)探查。然后將此濾膜與辣根過氧化物酶綴合的抗鼠抗體保溫。結(jié)合的抗體用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL,Amershal Inc.)檢測。然后將濾膜切成細(xì)條并用PDGFβ-受體兔抗血清再探查，受體的量通過與辣根過氧化物酶綴合的抗兔抗體保溫而測定。結(jié)合的受體用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL,Amersham Inc)檢測。用PDGFβ-受體抗體探查濾膜證實在所有泳道中受體的量相等。用人重組PDGF-BB(100ng/ml)和未處理的細(xì)胞作對照實驗。圖11示出含有條件培養(yǎng)基的截短的PDGF-D刺激PDGFβ-受體酪氨酸磷酸化。這表明截短的PDGF-D是PDGFβ-受體的配體/興奮劑。
實施例4競爭性結(jié)合分析接下來測試截短的PDGF-D結(jié)合人PDGFβ-受體的能力，這通過分析其與PDGF-BB競爭結(jié)合PDGFβ-受體的能力進(jìn)行。在分別穩(wěn)定表達(dá)人PDGFα-和β-受體的豬動脈內(nèi)皮1(PAE-1)細(xì)胞上進(jìn)行結(jié)合試驗(Eriksson等，EMBO雜志，1992 11 543-550)?；救鏗eldin等所述(EMBO雜志，1988,7 1387-1393)進(jìn)行結(jié)合試驗。分別表達(dá)PDGF-A，截短的PDGF-D，或模擬對照物的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用等體積的BSA/PBS稀釋，并與在結(jié)合緩沖液(含有1mg/ml BSA的PBS)中100ng/ml125I-PDGF-BB或125I-PDGF-AA(α-受體的配體)混合。分析來自這些COS細(xì)胞的兩套獨立的條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基等份與在24孔培養(yǎng)皿中鋪板的表達(dá)受體的PAE-1細(xì)胞在冰上保溫90分鐘。在用結(jié)合緩沖液洗滌3次后，結(jié)合的125I-PDGF-BB或125I-PDGF-AA通過在20mM Tric-HCl,pH7.5,10％甘油，1％Triton X-100中裂解細(xì)胞而提取。用γ計數(shù)儀測定細(xì)胞結(jié)合的放射性量。圖12的結(jié)果示出含有截短的PDGF-D的條件培養(yǎng)基與PDGFβ-受體競爭結(jié)合PDGF-BB同源二聚體，而不與PDGFα-受體競爭結(jié)合PDGF-AA同源二聚體。
PDGF-D不與任何已知的VEGF受體結(jié)合。PDGF-D是目前唯一的能結(jié)合并提高PDGFβ受體的磷酸化的VEGF家族成員。這些特點表明截短的PDGF-D可能不是VEGF家族成員，而是一種新的PDGF。另外，其全長蛋白似乎是需要由蛋白酶解以釋放活性PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域而激活的潛伏生長因子。N末端CUB結(jié)構(gòu)域可作為抑制結(jié)構(gòu)域表達(dá)，其可用于將這一潛伏生長因子定位于一些胞外區(qū)室(如胞外基質(zhì))中，且其當(dāng)需要時可通過限制性蛋白酶解而除去，如在胚胎發(fā)育，組織再生，組織重塑包括骨重塑，激活血管生成，腫瘤發(fā)展，腫瘤侵染，轉(zhuǎn)移形成和/或傷口愈合期間。
確定PDGF-D功能的生物分析進(jìn)行分析以評判PDGF-D是否具有類似于PDGF-A,PDGF-B,VEGF,VEGF-B和/或VEGF-D在關(guān)于結(jié)締組織細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長和/或運動性；及關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞功能；關(guān)于血管生成及傷口愈合中的作用。也可根據(jù)受體結(jié)合分布研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析。
Ⅰ．PDGF-D對內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂性為測試PDGF-D對內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂能力，將PDGF-D多肽導(dǎo)入含有5％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，并施加于在含有10％血清的培養(yǎng)基中增殖的牛動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEs)中。在加入PDGF-D前一天，此BAEs預(yù)先以1000個細(xì)胞/孔的密度種植于24孔培養(yǎng)皿中。加入PDGF-D多肽3天后，將細(xì)胞用胰蛋白酶解離并計數(shù)。純化的VEGF在本試驗中用作陽性對照。
Ⅱ．PDGF-D對成纖維細(xì)胞的促有絲分裂性為測試PDGF-D對成纖維細(xì)胞的促有絲分裂能力，將不同濃度的PDGF-DD或PDGF-AA(作對照)的截短的同源二聚體在0.2μmCi[3H]胸苷存在下加入血清饑餓的人包皮成纖維細(xì)胞中。然后將此成纖維細(xì)胞用1ml含有1mg/ml BSA的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。在經(jīng)三氯乙酸(TCA)沉淀后，用β計數(shù)儀測定摻入DNA的[3H]胸苷的數(shù)量。此分析基本如Mori等，生物化學(xué)雜志，1991 266 21158-21164所述進(jìn)行。
Ⅲ．分析內(nèi)皮細(xì)胞功能a)內(nèi)皮細(xì)胞增殖通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞生長分析，例如Frerrara和Henzel，自然，1989 380 439-443,Gospodarowicz等，美國科學(xué)院學(xué)報，1989 86 7311-7315，和/或Claffey等，生物化學(xué)生物物理雜志，1995 1246 1-9中所述方法。
b)細(xì)胞粘附分析測試PDGF-D對多形核粒細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的影響c)趨化標(biāo)準(zhǔn)Boyden室趨化性分析用于測試PDGF-D對趨化性的影響。
d)纖溶酶原激活物分析用Pepper等，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊，1991 181 902-906的方法，測試內(nèi)皮細(xì)胞以研究PDGF-D對纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活抑制劑物產(chǎn)生的影響。
e)內(nèi)皮細(xì)胞遷移分析f)如Montesano等，美國科學(xué)院學(xué)報，1986 83 7297-7301所述，分析PDGF-D刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移及脈管形成的能力。或者，可使用Joukov等，EMBO雜志，1996 15 290-298所述的三維膠原凝膠分析或修改的Boyden室中的明膠化膜(Glaser等，自然，1980 288 483-484)。
Ⅳ．血管生成分析如Leung等，科學(xué)，1989 246 1306-1309中所述，測試PDGF-D誘導(dǎo)雞絨毛尿囊膜中血管生成應(yīng)答的能力?；蛘?，可使用Rastinejad等，細(xì)胞，1989 56 345-355所述的鼠角膜分析；這是一種分析體內(nèi)血管生成的認(rèn)可方法，且此結(jié)果能易于移至其它體內(nèi)系統(tǒng)。
Ⅴ．傷口愈合如Schilling等，外科學(xué)，1959 46 702-710所述，并利用Hunt等，外科學(xué)，1967 114 302-307所述方法，測試大多數(shù)臨床相關(guān)模型中PDGF-D刺激傷口愈口的能力。
Ⅵ．造血系統(tǒng)本領(lǐng)域已知用造血系統(tǒng)的特異細(xì)胞群進(jìn)行的各種體外和體內(nèi)分析，并在以下略述。特別常用的是用熒光激活細(xì)胞分選儀分選純化的細(xì)胞的各種體外鼠干細(xì)胞分析a)再集群干細(xì)胞這些是能再集群輻射致死鼠的骨髓的細(xì)胞，且具有Lin-,Rhh1,Ly-6A/E+,c-kit+表型。在單獨這些細(xì)胞或與其它因子共培養(yǎng)的這些細(xì)胞上測試PDGF-D，隨后通過摻入3H-胸苷測定細(xì)胞增殖。
b)晚期干細(xì)胞這些是具有相對較小骨髓再集群能力，但能產(chǎn)生D13 CFU-S的細(xì)胞。這些細(xì)胞具有Lin-,Rhh1,Ly-6A/E+,c-kit+表型。將PDGF-D與這些細(xì)胞培養(yǎng)一段時間，注射至輻射致死的受體中，并計數(shù)D13脾集落數(shù)目。
c)祖細(xì)胞富集的細(xì)胞這些是體外應(yīng)答單一生長因子并具有Lin-,Rhh1,Ly-6A/E+,c-kit+表型的細(xì)胞。此分析將示出PDGF-D是否能直接作用于造血祖細(xì)胞。PDGF-D與這些細(xì)胞在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并計數(shù)7-14天后存在的集落數(shù)目。
Ⅶ．粥樣硬化平滑肌細(xì)胞在粥樣硬化的發(fā)生或進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，要求其表型從收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變至舒張狀態(tài)。巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和血小板，通過影響平滑肌細(xì)胞的生長及表型調(diào)節(jié)而均在粥樣硬化斑的進(jìn)展中起作用。一種用修改的Rose室的體外分析，其中不同類型的細(xì)胞種植于相反蓋片，測定了平滑肌細(xì)胞在多細(xì)胞環(huán)境中的增殖速度及表型調(diào)節(jié)，并用于確定PDGF-D對平滑肌細(xì)胞的影響。
Ⅷ．癌轉(zhuǎn)移PDGF-D抑制癌轉(zhuǎn)移的能力可使用Lewis肺癌模型，例如用Cao等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1995 182 2069-2077的方法進(jìn)行分析。
Ⅸ．平滑肌細(xì)胞的遷移PDGF-D對平滑肌細(xì)胞和其它類型細(xì)胞遷移的影響可用Koyama等，生物化學(xué)雜志，1992 267 22806-22812的方法分析。
Ⅹ．趨化性PDGF-D對成纖維細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞和其它細(xì)胞趨化性的影響可用Siegbahn等，臨床研究雜志，1990 85 916-920的方法分析。
Ⅺ．其它類型細(xì)胞中的PDGF-DPDGF-D對其它類型細(xì)胞如肝細(xì)胞，心肌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞及成骨細(xì)胞的增殖，分化及功能的影響，可通過本領(lǐng)域已知方法如3H-胸苷由體外培養(yǎng)物而易于分析。
Ⅻ．PDGF-D變體及類似物的構(gòu)建PDGF-D是生長因子PDGF家族成員，其與PDGF家族其它成員呈高度同源性。PDGF-D含有7個保守的半胱氨酸殘基，這是生長因子此家族的特點。這些保守的半胱氨酸殘基形成產(chǎn)生半胱氨酸剔除結(jié)構(gòu)的鏈內(nèi)二硫鍵，和形成蛋白二聚體的鏈間二硫鍵，這些是生長因子PDGF家族成員的特點。PDGF-D與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶生長因子受體相互作用。
與對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，受體結(jié)構(gòu)所需的活性位點及隨之的活性都了解很少或不了解的蛋白質(zhì)相反，PDGF-D的活性突變體的設(shè)計，通過對生長因子PDGF家族成員的活性位點和重要氨基酸的大量認(rèn)知而十分便利。
闡明生長因子PDGF家族成員的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系的發(fā)表的文章包括闡述PDGF的Oestman，生物化學(xué)雜志，1991 266 10073-10077；Andersson等，生物化學(xué)雜志，1992 267 11260-1266；Oefner等，EMBO雜志，1992 11 3921-3926；Flemming等，分子及細(xì)胞生物學(xué)，199313 4066-4076；闡述VEGF的Kim等，生長因子，1992 7 53-64；Potgens等，生物化學(xué)雜志，1994 269 32879-32885及Claffey等，生物化學(xué)生物物理學(xué)雜志，1995 1246 1-9。這些文章揭示由于有8個保守的半胱氨酸殘基，因而生長因子的PDGF家族呈現(xiàn)特征化的打結(jié)的折疊結(jié)構(gòu)及二聚體化，導(dǎo)致在二聚體化的分子的每個末端均形成三個曝露的環(huán)區(qū)，活性受體結(jié)合位點可預(yù)期位于此處。
基于此信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計高度保持PDGF活性的PDGF-D變體，這可通過保守負(fù)責(zé)打結(jié)的折疊和二聚體化的8個半胱氨酸殘基，且也可通過保守或在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的環(huán)1,2,3區(qū)的可能的受體序列中只進(jìn)行保守氨基酸取代而進(jìn)行。
在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中特異定向的位點形成所需突變被認(rèn)為是蛋白質(zhì)學(xué)專家的一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Kumkel等，酶學(xué)方法，1987 154 367-382)。這種用VEGF的定點誘變例如可見于Potgen等，生物化學(xué)雜志，1994269 32879-32885及Claffey等，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報，1995 12461-9。事實上，定點誘變非常普通，其試劑盒可商購而簡化這種程序(如Promega 1994-1995 Catalog,P142-145)。
PDGF-D突變體的結(jié)締組織細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長和/或運動性活性，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，血管生成活性和/或傷口愈合活性通過熟知的篩選方法可易于確定。例如，可使用類似于Claffey等所述的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂分析的方法(生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報，1995 1246 1-9)。同樣，PDGF-D對其它類型細(xì)胞增殖，對細(xì)胞分化及人癌轉(zhuǎn)移的影響用本領(lǐng)域熟知方法可測定。
前面的闡述及實施例只是舉例說明而非限制本發(fā)明。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明精神及原理范圍內(nèi)可對本發(fā)明所揭示的實施方案加以修改，因此本發(fā)明在所附權(quán)利要求書及其等價物的范圍內(nèi)可做各種改動。
序列表<110>烏爾夫·埃里克松卡琳·奧瑟李旭日安尼卡·蓬滕馬爾科·于特拉卡里·阿利塔洛阿恩·厄斯特曼卡爾-亨里克·黑爾丁<120>血小板衍生生長因子D，其編碼DNA及其應(yīng)用<130>烏爾夫·埃里克松等1064-44833PC<140><141><150>60/107,852<151>1998-11-10<150>60/113,997<151>1999-12-28<150>60/150,604<151>1999-08-26<150>60/157,108<151>1999-10-04<150>60/157,756<151>1999-10-05<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>360<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1aattgtggct gtggaactgt caactggagg tcctgcacat gcaattcagg gaaaaccgtg 60aaaaagtatc atgaggtatt acagtttgag cctggccaca tcaagaggag gggtagagct 120aagaccatgg ctctagttga catccagttg gatcaccatg aacgatgtga ttgtatctgc 180agctcaagac cacctcgata agagaatgtg cacatcctta cattaagcct gaaagaacca 240ttagtttaag gagggtgaga taagagaccc ttttcctacc agcaaccaga cttactacta 300gcctgcaatg caatgaacac aagtggttgc tgagtctcag ccttgctttg ttaatgccat 360<210>2<211>66<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Asn Cys Gly Cys Gly Thr Vel Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser1 5 10 15Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly20 25 30His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile35 40 45Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Sar Arg Pro50 55 60Pro Arg65<210>3<211>690<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3ggaagatttc caacccgcag cagcttcaga gaccaactgg aatctgtcac aagctctgtt 60tcagggtatc cctataactc tccatcagta acggatccca ctctgattgc ggatgctctg 120gacaaaaaaa ttgcagaatt tgatacagtg gaagatctgc tcaagtactt caatccagag 180tcatggcaag aagatcttga gaatatgtat ctggacaccc ctcggtatcg aggcaggtca 240taccatgacc ggaagtcaaa agttgacctg gataggctca atgatgatgc caagcgttac 300agttgcactc ccaggaatta Ctcggtcaat ataagagaag agctgaagtt ggccaatgtg 360gtcttctttc cacgttgcct cctcgtgcag cgctgtggag gaaattgtgg ctgtggaact 420gtcaaactgg agtcctgcac atgcaattca gggaaaaccg tgaaaaagta tcatgaggta 480ttacagtttg agcctggcca catcaagagg aggggtagag ctaagaccat ggctctagtt 540gacatccagt tggatcacca tgaacgatgc gattgtatct gcagctcaag accacctcga 600taagagaatg tgcacatcct tacattaagc ctgaaagaac ctttagttta aggagggtga 660gataagagac ccttttccta ccagcaaccc 690<210>4<211>200<212>PRT<213>Homo sagiens<400>4Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ser Ser Phe Arg Asp Gln Leu Glu Ser Val1 5 10 15Thr Ser Ser Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp20 25 30Pro Thr Leu Ile Ala Asp Ala Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp35 40 45Thr Val Glu Asp Leu Leu Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu50 55 60Asp Leu Glu Asn Met Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser65 70 75 80Tyr His Asp Arg Lys Ser Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp85 90 95Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg100 105 110Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu115 120 125Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Lys Leu Glu130 135 140Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val145 150 155 160Leu Gln Phe Glu Pro Gly His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr165 170 175Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys180 185 190Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg195 200<210>5<211>1934<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(966)<400>5ttg tac cga aga gat gag acc atc cag gtg aaa gga aac ggc tac gtg 48Leu Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val1 5 10 15cag agt cct aga ttc ccg aac agc tac ccc agg aac ctg ctc ctg aca 96Gln Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr20 25 30tgg cgg ctt cac tct cag gag aat aca cgg ata cag cta gtg ttt gac 144Trp Arg Leu His Set Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp35 40 45aat cag ttt gga tta gag gaa gca gaa aat gat atc tgt agg tat gat 192Asn Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp50 55 60ttt gtg gaa gtt gaa gat ata tcc gaa acc agt acc att att aga gga 240Phe Val Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly65 70 75 80cga tgg tgt gga cac aag gaa gtt cct cca agg ata aaa tca aga acg 288Arg Trp Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr85 90 95aac caa att aaa atc aca ttc aag tcc gat gac tac tit gtg gct aaa 336Asn Gln Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys
100 105 110cct gga ttc aag att tat tat tct ttg ctg gaa gat ttc caa ccc gca 384Pro Gly Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala115 120 125gca gct tca gag acc aac tgg gaa tct gtc aca agc tct att tca ggg 432Ala Ala Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly130 135 140gta tcc tat aac tct cca tca gta acg gat ccc act ctg att gcg gat 480Val Ser Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp145 150 155 160gct ctg gac aaa aaa att gca gaa ttt gat aca gtg gaa gat ctg ctc 528Ala Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu165 170 175aag tac ttc aat cca gag tca tgg caa gaa gat ctt gag aat atg tat 576Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr180 185 190ctg gac acc cct cgg tat cga ggc agg tca tac cat gac cgg aag tca 624Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser195 200 205aaa gtt gac ctg gat agg ctc aat gat gat gcc aag cgt tac agt tgc 672Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys210 215 220act ccc agg aat tac tcg gtc aat ata aga gaa gag ctg aag ttg gcc 720Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala225 230 235 240aat gtg gtc ttc ttt cca cgt tgc ctc ctc gtg cag cgc tgt gga gga 768Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly245 250 255aat tgt ggc tgt gga act gtc aac tgg agg tcc tgc aca tgc aat tca 816Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser260 265 270ggg aaa acc gtg aaa aag tat cat gag gta tta cag ttt gag cct ggc 864Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly275 280 285cac atc aag agg agg ggt aga gct aag acc atg gct cta gtt gac atc 912His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile
290 295 300cag ttg gat cac cat gaa cga tgc gat tgt atc tgc agc tca aga cca 960Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro305 310 315 320cct cga taagagaatg tgcacatcct tacsttaagc ctggaaagaac ctttagttta 1016Pro Argaggagggtga gataagagac ccttttccta ccagcaacca aacttactac tagcctgcaa 1076tgcaatgaac acaagtggtt gctgagtctc agccttgctt tgttaatgcc atggcaagta 1136gaaaggtata tcatcaactt ctatacctaa gaatatagga ttgcatttaa taatagtgtt 1196tgaggttata tatgcacaaa cacacacaga aatatattca tgtctatgtg tatatagatc 1256aaatgttttt tttggtatat atsaccaggt acaccagagc ttacatatgt ttgagttaga 1316ctcttaaaat cctttgccaa aataagggat ggtcaaatat atgaaacatg tctttagaaa 1376atttaggaga taaatttatt tttaaatttt gaaacacaaa acaattttga atcttgctct 1436cttaaagaaa gcatcttgta tattaaasat caaaagatga ggctttctta catatacatc 1496ttagttgatt attaaaaaag gasaaaggtt tccagagaaa aggccaatac ctaagcattt 1556tttccatgag aagcactgca tacttaccta tgtggactgt aataacctgt ctccaaaacc 1616atgccataat aatataagtg ctttagaaat taaatcattg tgttttttat gcattttgct 1676gaggcatcct tattcattta acacctatct caaaaactta cttagaaggt tttttattat 1736agtcctacaa aagacaatgt ataagctgta acagaatttt gaattgtttt tctttgcaaa 1796acccctccac aaaagcaaat cctttcaaga atggcatggg cattctgtat gaacctttcc 1856agatggtgtt cagtgaaaga tgtgggtagt tgagaactta aaaagtgaac attgaaacat 1916cgacgtaact ggaaaccg 1934<210>6<211>322<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Leu Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val1 5 10 15Gln Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr20 25 30Trp Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp35 40 45Asn Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp50 55 60Phe Val Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly65 70 75 80Arg Trp Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr85 90 95Asn Gln Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys100 105 110Pro Gly Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala115 120 125Ala Ala Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly130 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cagggcgagc gcaggcggcg agagcgcagg gcggcgcggc gtcggtcccg 120ggagcagaac ccggcttttt cttggagcga cgctgtctct agtcgctgat cccaa atg 178Met1cac cgg ctc atc ttt gtc tac act cta atc tgc gca aac ttt tgc agc 226His Arg Leu Ile Phe Val Tyr Thr Leu Ile Cys Ala Asn Phe Cys Ser5 10 15tgt cgg gac act tct gca acc ccg cag agc gca tcc atc aaa gct ttg 274Cys Arg Asp Thr Ser Ala Thr Pro Gln Ser Ala Ser Ile Lys Ala Leu20 25 30cgc aac gcc aac ctc agg cga gat gag agc aat cac ctc aca gac ttg 322Arg Asn Ala Asn Leu Arg Arg Asp Glu Ser Asn His Leu Thr Asp Leu35 40 45tac cga aga gat gag acc atc cag gtg aaa gga aac ggc tac gtg cag 370Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val Gln50 55 60 65agt cct aga ttc ccg aac agc tac ccc agg aac ctg ctc ctg aca tgg 418Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr Trp70 75 80cgg ctt cac tct cag gag aat aca cgg ata cag cta gtg ttt gac aat 466Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp Asn85 90 95cag ttt gga tta gag gaa gca gaa aat gat 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245 250 255gtt gac ctg gat agg ctc aat gat gat gcc aag cgt tac agt tgc act994Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr260 265 270ccc agg aat tac tcg gtc aat ata aga gaa gag ctg aag ttg gcc aat 1042Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn275 280 285gtg gtc ttc ttt cca cgt tgc ctc ctc gtg cag cgc tgt gga gga aat 1090Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn290 295 300 305tgt ggc tgt gga act gtc aac tgg agg tcc tgc aca tgc aat tca ggg 1138Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly310 315 320aaa acc gtg aaa aag tat cat gag gta tta cag ttt gag cct ggc cac 1186Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly His325 330 335atc aag agg agg ggt aga gct aag acc atg gct cta gtt gac atc cag 1234Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln340 345 350ttg gat cac cat gaa cga tgc gat tgt atc tgc agc tca aga cca cct 1282Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro355 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Gly1 5 10 15Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly20 25 30Ash Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly35 40 45Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu50 55 60Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu65 70 75 80Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asp Leu His Cys Val Pro85 90 95Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly100 105 110Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys115 120 125Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro130 135 140Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Asn Gln Arg Pro Thr Asp Cys145 150 155 160His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg165 170<210>12<211>188<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln20 25 30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln35 40 45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val50 55 60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65 70 75 80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln85 90 95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly100 105 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys115 120 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg130 135 140Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg145 150 155 160Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu165 170 175Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Asg Arg180 185<210>13<211>364<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Met Glu Thr Leu Tyr Ser Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr1 5 10 15Ile Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Leu Cys Tyr20 25 30Ser Leu Glu His Ile Ser Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Leu Glu Leu Glu35 40 45Ala Ser Asn Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala Ser Asn Thr50 55 60His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Thr Arg Pro Ser Glu Arg Gly Leu65 70 75 80Val Ala Leu Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu85 90 95Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Arg Gly Pro Arg Ile Leu Glu100 105 110Val Ala Leu Val Ala Leu Pro Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Gly Leu115 120 125Thr His Arg His Ile Ser Pro Arg Gly Leu Leu Glu Thr His Arg Ser130 135 140Glu Arg Gly Leu Asn Ala Arg Gly Pro His Glu Ala Ser Ash Pro Arg145 150 155 160Pro Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Met Glu Thr165 170 175Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Cys180 185 190Tyr Ser Ala Ser Asn Ala Ser Pro Gly Leu Ser Glu Arg Leu Glu Gly195 200 205Leu Cys Tyr Ser Val Ala Leu Pro Arg Thr His Arg Gly Leu Gly Leu210 215 220Val Ala Leu Ala Ser Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Met Glu Thr Gly225 230 235 240Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu245 250 255Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Ser Asn Gly Leu Tyr260 265 270Met Glu Thr Gly Leu Asn Ala Arg Gly Leu Glu Ser Glu Arg Pro His275 280 285Glu Val Ala Leu Gly Leu His Ile Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Cys290 295 300Tyr Ser Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Pro Arg Ala Arg Gly305 310 315 320Pro His Glu Thr His Arg Thr His Arg Thr His Arg Pro Arg Pro Arg325 330 335Thr His Arg Thr His Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Pro Arg Pro Arg340 345 350Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly355 360<210>14<211>419<212>PRT<213>Homo sagiens<400>14Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser195 200 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile210 215 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225 230 235 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys245 250 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser260 265 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu275 280 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys290 295 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305 310 315 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu325 330 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro340 345 350Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr370 375 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385 390 395 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro405 410 415Gln Met Ser<210>15<211>358<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Met Tyr Gly Glu Trp Gly Met Gly Asn Ile Leu Met Met Phe His Val1 5 10 15Tyr Leu Val Gln Gly Phe Arg Ser Glu His Gly Pro Val Lys Asp Phe20 25 30Ser Phe Glu Arg Ser Ser Arg Ser Met Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln35 40 45Ile Arg Ala Ala Ser Ser Leu Glu Glu Leu Leu Gln Ile Ala His Ser50 55 60Glu Asp Trp Lys Leu Trp Arg Cys Arg Len Lys Leu Lys Ser Leu Ala65 70 75 80Ser Met Asp Ser Arg Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala85 90 95Thr Phe Tyr Asp Thr Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln100 105 110Arg Thr Gln Cys Ser Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu115 120 125Leu Gly Lys Thr Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val
130 135 140Phe Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Glu Glu Gly Val Met Cys Met Asn145 150 155 160Thr Ser Thr Ser Tyr Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro165 170 175Leu Thr Ser Val Pro Glu Leu Val Pro Val Lys Ile Ala Asn His Thr180 185 190Gly Cys Lys Cys Leu Pro Thr Gly Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile195 200 205Arg Arg Ser Ile Gln Thr Pro Glu Glu Asp Glu Cys Pro His Ser Lys210 215 220Lys Leu Cys Pro Ile Asp Met Leu Trp Asp Asn Thr Lys Cys Lys Cys225 230 235 240Val Leu Gln Asp Glu Thr Pro Leu Pro Gly Thr Glu Asp His Ser Tyr245 250 255Leu Gln Glu Pro Thr Leu Cys Gly Pro His Met Thr Phe Asp Glu Asp260 265 270Arg Cys Glu Cys Val Cys Lys Ala Pro Cys Pro Gly Asp Leu Ile Gln275 280 285His Pro Glu Asn Cys Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Ser290 295 300Cys Cys Gln Lys His Lys Ile Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu305 310 315 320Asp Arg Cys Pro Phe His Thr Arg Thr Cys Ala Ser Arg Lys Pro Ala325 330 335Cys Gly Lys His Trp Arg Phe Pro Lys Glu Thr Arg Ala Gln Gly Leu340 345 350Tyr Ser Gln Glu 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Leu195 200 205Lys Pro Thr210<210>17<211>241<212>PRT<213>Homo sapiens<400>17Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg1 5 10 15Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met20 25 30Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu35 40 45His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met50 55 60Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg65 70 75 80Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu85 90 95Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp100 105 110Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln115 120 125Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Ash Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr130 135 140Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg145 150 155 160Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu165 170 175Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser180 185 190Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val195 200 205Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg210 215 220Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly225 230 235 240Ala<210>18<211>121<212>PRT<213>Homo sapiens<400>18Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp1 5 10 15Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile20 25 30Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu35 40 45Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Lys Leu50 55 60Glu Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu65 70 75 80Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys85 90 95Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp100 105 110Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg115 120<210>19<211>119<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val Gln Ser Pro1 5 10 15Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr Trp Arg Leu20 25 30His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp Asn Gln Phe35 40 45Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp Phe Val Glu50 55 60Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly Arg Trp Cys65 70 75 80Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr Asn Gln Ile85 90 95Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys Pro Gly Phe100 105 110Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu115<210>20<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Cys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His Met His Cys Val Trp Arg Ile Ser20 25 30Val Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp Leu35 40 45Tyr Arg Ser Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly50 55 60Phe Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu65 70 75 80Pro Glu Pro Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg85 90 95Ser Ser Ser Asn Trp Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala100 105 110Ile<210>21<211>112<212>PRT<213>Homo sapiens<400>21Cys Gly Gly Asp Val Lys Lys Asp Tyr Gly His Ile Gln Ser Pro Asn1 5 10 15Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Val Cys Ile Trp Arg Ile Gln20 25 30Val Ser Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile35 40 45Glu Arg Met Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly50 55 60His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys65 70 75 80Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val85 90 95Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys100 105 110<210>22<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<400>22Cys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly1 5 10 15Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val20 25 30Ala Pro Thr Gln Tyr Arg Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr35 40 45Glu Gly Asn Asp Val Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly50 55 60Leu Thr Als Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys65 70 75 80Pro Glu Val Ile Thr Ser Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Pro Lys85 90 95Ser Asp Asn Thr Val Ser Lys Lys Gly Phe Lys Als His Phe Phe Ser100 105 110Glu<210>23<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<400>23Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly1 5 10 15Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln20 25 30Als Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe35 40 45Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp50 55 60Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile65 70 75 80Als Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe85 90 95Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu100 105 110Ile<210>24<211>119<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly1 5 10 15Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe20 25 30Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu35 40 45Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg50 55 60Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg65 70 75 80Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile85 90 95Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe100 105 110Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu115<210>25<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>25Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Asn Cys Xaa Cys1 5 10 15<210>26<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>26gtcgtggaac tgtcaactgg<210>27<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>27ctcagcaacc acttgtgttc 20<210>28<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>28ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>29<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>29agtgggatcc gttactgatg gagagttat29<210>30<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>30cccaagcttg aagatcttga gaatat 26<210>31<211>22<212>DNA<213>Homo sapiens<400>31tgctctagat cgaggtggtc tt 2權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其包含的多核苷酸序列與圖3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，圖5所示序列(SEQID NO:5)的至少1-966位核苷酸，圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176-1288位核苷酸，或圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸具有至少85％相同性。
2.如權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中序列相同性至少為90％。
3.如權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中序列相同性至少為95％。
4.如權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸是cDNA。
5.如權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸是一種哺乳動物多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述核酸是一種人類多核苷酸。
7.一種分離的核酸分子，其編碼一種多肽分子或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物，該多肽分子包含的氨基酸序列與圖4所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，圖6所示氨基酸序列(SEQID NO:6)，或圖8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性。
8.如權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中氨基酸序列相同性至少為90％。
9.如權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中氨基酸序列相同性至少為95％。
10.一種分離的核酸分子，其編碼包含氨基酸序列PSCLLVXRCGGNCXC(SEQ ID NO:25)的多肽。
11.一種分離的多核苷酸，其包含的多核苷酸序列與圖3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，圖5所示序列(SEQID NO:5)的至少1～966位核苷酸，圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176-1288位核苷酸，或圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸有至少85％相同性，或在嚴(yán)格雜交條件下與所述DNA序列的至少一個雜交的多核苷酸。
12.一種包含權(quán)利要求1或11的核酸的載體，其核酸與啟動子序列可操縱地連接。
13.權(quán)利要求12的載體，其中所述載體是真核載體。
14.權(quán)利要求12的載體，其中所述載體是原核載體。
15.權(quán)利要求12的載體，其中所述載體是質(zhì)粒。
16.權(quán)利要求12的載體，其中所述載體是桿狀病毒載體。
17.一種制備表達(dá)多肽或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物的載體的方法，所述多肽包含的氨基酸序列與圖4所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，圖6所示氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，或圖8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性，此方法包括將權(quán)利要求1,7,10或11的分離的核酸以可操縱地連接于啟動子的方式摻入所述載體中。
18.用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是COS細(xì)胞。
21.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
22.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是293 EBNA細(xì)胞。
23.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
24.用含有權(quán)利要求1或11的可操縱地連接于啟動子的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，這樣所述宿主細(xì)胞表達(dá)一種多肽或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物，所述多肽包含與圖4所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，圖6所示氨基酸序列(SEQID NO:6)或圖8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性的氨基酸序列。
25.一種分離的多肽，其包含與圖4所示氨基酸序列(SEQ IDNO:4)，圖6所示氨基酸序列(SEQ ID NO:6)或圖8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性的氨基酸序列，或其具有PDGF-D生物學(xué)活性的片段或類似物。
26.權(quán)利要求25的分離的多肽，其中所述多肽是人類多肽。
27.權(quán)利要求25的分離的多肽，其中所述多肽具有刺激和/或增強表達(dá)PDGF-D受體的細(xì)胞的增殖和/或分化和/或生長和/或運動性的能力。
28.權(quán)利要求27的分離的多肽，其中細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
29.一種分離的多肽，其是通過表達(dá)包含與圖3所示序列(SEQID NO:3)的至少1～600位核苷酸，圖5所示序列的至少1～966位核苷酸，圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176-1288位核苷酸，或圖7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸有至少85％相同性的多核苷酸序列的多核苷酸，或表達(dá)在嚴(yán)格條件下與所述DNA序列的至少一個雜交的多核苷酸而產(chǎn)生的。
30.一種分離的多肽，其包含特征性序列PXCLLVXRCGGNCXC(SEQ ID NO:25)。
31.一種分離的多肽二聚體，其包含權(quán)利要求25或29的多肽。
32.權(quán)利要求31的分離的多肽二聚體，其中所述多肽二聚體是所述多肽的同源二聚體。
33.權(quán)利要求31的分離的多肽二聚體，其中所述多肽二聚體是所述多肽和VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF的異源二聚體。
34.權(quán)利要求31的分離的多肽二聚體，其中所述多肽二聚體是二硫鍵連接的二聚體。
35.一種藥物組合物，其包含促進(jìn)細(xì)胞增殖有效量的權(quán)利要求25、29或30的多肽，和選自VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF的至少一種另外的生長因子。
36.權(quán)利要求35的藥物組合物，另外還包含肝素。
37.一種藥物組合物，其包含促進(jìn)細(xì)胞增殖有效量的權(quán)利要求25、29或30的分離的多肽，和至少一種藥物載體或稀釋劑。
38.權(quán)利要求37的藥物組合物，還包含肝素。
39.一種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求25、29或30的分離的多肽和肝素。
40.一種藥物組合物，其包含PDGF受體刺激量的權(quán)利要求25、29或30的分離的多肽，和至少一種藥物載體或稀釋劑。
41.一種擴增測試樣品中權(quán)利要求1或11的多核苷酸的手段，所述手段包括至少一對互補于權(quán)利要求1或11的核酸的引物。
42.一種擴增測試樣品中權(quán)利要求1或11的多核苷酸的手段，所述手段包括聚合酶及至少一對互補于權(quán)利要求1或11的核酸的引物，以通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增此多核苷酸，從而促進(jìn)對比該多核苷酸與權(quán)利要求1或11的核酸。
43.一種與權(quán)利要求25,29或30的多肽特異反應(yīng)的抗體。
44.權(quán)利要求43的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
45.權(quán)利要求43的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
46.權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
47.權(quán)利要求44,45或46的抗體，其中所述抗體是用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的。
48.權(quán)利要求47的抗體，其中所述可檢測標(biāo)記物是放射性同位素。
49.權(quán)利要求45或46的抗體，其中抗體通過加入胞毒劑或細(xì)胞抑制劑而修飾。
50.一種生產(chǎn)權(quán)利要求25,29或30的多肽的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)用一種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，該載體包含與啟動子序列可操縱地相連的編碼所述多肽的多核苷酸，這樣編碼所述多肽的核酸序列被表達(dá)；及從所述宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中分離所述的多肽。
51.一種刺激哺乳動物結(jié)締組織生長或傷口愈合的方法，包括給所述哺乳動物施用有效刺激結(jié)締組織或傷口愈合的量的權(quán)利要求25,29或30的多肽。
52.一種生產(chǎn)活化的截短形式PDGF-D的方法，包括表達(dá)包含編碼權(quán)利要求25,29或30的多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，并提供蛋白酶解量的至少一種酶以加工表達(dá)的多肽，從而產(chǎn)生活化的截短形式PDGF-D。
53.一種調(diào)節(jié)PDGF-D的受體結(jié)合特異性的方法，包括表達(dá)包含編碼權(quán)利要求25,29或30的多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，并提供蛋白酶解量的至少一種酶以加工表達(dá)的多肽，從而產(chǎn)生活化的截短形式的PDGF-D。
54.一種選擇性激活具有生長因子活性的多肽的方法，包括表達(dá)包含編碼具有生長因子活性的多肽、CUB結(jié)構(gòu)域以及多肽與CUB結(jié)構(gòu)域之間蛋白酶解位點的多核苷酸的表達(dá)載體，并提供蛋白酶解量的至少一種酶以加工表達(dá)的多肽，從而產(chǎn)生具有生長因子活性的活化的多肽。
55.權(quán)利要求25,29或30的分離的多肽，其包含一個具有氨基酸序列RKSK或其結(jié)構(gòu)保守的氨基酸序列的蛋白酶解位點。
56.權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其編碼包含有氨基酸序列RKSK或結(jié)構(gòu)保守的氨基酸序列的蛋白酶解位點的多肽。
57.一種分離的異源二聚體，其包含一個活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B或PIGF單體，和一個與CUB結(jié)構(gòu)域連接的活化的PDGF-D單體。
58.一種分離的異源二聚體，其包含一個活化的PDGF單體，和一個與CUB結(jié)構(gòu)域連接的活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF單體。
59.權(quán)利要求57的分離的異源二聚體，另外還包含一個在活化的單體和CUB結(jié)構(gòu)域連接之間的蛋白酶解位點。
60.權(quán)利要求58的分離的異源二聚體，還包含一個在活化單體和CUB結(jié)構(gòu)域連接之間的蛋白酶解位點。
61.一種誘導(dǎo)PDGFβ-受體活化的方法，包括加入PDGFβ-受體刺激量的權(quán)利要求25,29或30的多肽。
62.一種抑制哺乳動物中表達(dá)PDGF-D的腫瘤的腫瘤生長的方法，包括給所述哺乳動物施用PDGF-D抑制量的PDGF-D拮抗劑。
63.一種鑒別特異類型人類腫瘤的方法，包括取腫瘤樣品并測試PDGF-D的表達(dá)。
64.一種鑒別PDGF-D拮抗劑的方法，包括混合基本純化的活化截短形式的PDGF制備物與測試制劑；并通過任何適當(dāng)方法監(jiān)測PDGF-D生物學(xué)活性的抑制情況。
65.一種鑒別PDGF-D拮抗劑的方法，包括混合基本純化的全長PDGF-D制備物與測試制劑；并通過任何適當(dāng)方法監(jiān)測對CUB結(jié)構(gòu)域從PDGF-D中裂解的抑制情況。
66.一種制備表達(dá)多肽的載體的方法，該多肽包含與圖8(SEQ IDNO:8)的255～371位氨基酸殘基有至少85％相同性的氨基酸序列，所述方法包括將編碼所述氨基酸殘基的分離的核酸分子摻入所述載體中以與啟動子可操縱連接。
67.一種生產(chǎn)活化的截短形式PDGF-D的方法，包括表達(dá)包含編碼權(quán)利要求25,29或30的多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，并提供蛋白酶解量的至少一種酶以加工表達(dá)的多肽，從而產(chǎn)生活化的截短形式的PDGF-D。
68.一種在腫瘤細(xì)胞侵染正常細(xì)胞群期間抑制組織重塑的方法，包括給所述哺乳動物施用PDGF-D抑制量的PDGF-C拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了生長因子PDGF/VEGF家族的一個新成員PDGF－D,以及編碼PDGF－D的核苷酸序列,生產(chǎn)PDGF－D的方法,PDGF－D的抗體和其它拮抗劑,表達(dá)PDGF－D的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,含有PDGF－D的藥物組合物,以及PDGF－D在醫(yī)療和診斷中的用途。
文檔編號A61P11/08GK1325407SQ99813133
公開日2001年12月5日 申請日期1999年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月10日
發(fā)明者烏爾夫·埃里克松, 卡琳·奧瑟, 安尼卡·蓬滕, 李旭日, 馬爾科·于特拉, 卡里·阿利塔洛, 阿恩·厄斯特曼, 卡爾－亨里克·黑爾丁 申請人:路德維格癌癥研究所, 萊森希亞有限公司