專利名稱：抑制血小板衍生生長因子基因表達的三鏈形成寡核苷酸及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸及其在基因治療中的應用血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一種強有力的有絲分裂原和化學趨化劑，其主要的靶細胞是中胚層來源的平滑肌細胞、成纖維細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。它是由A、B兩種同源肽鏈(60％的同源性)經(jīng)二硫鍵相連的30KD的二聚體，其B鏈基因與猴肉瘤病毒的癌基因v-sis有92％的同源性，因此PDGF-B基因又稱為c-sis原癌基因。作為一種多功能的信號分子，PDGF在腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應等病理狀態(tài)中扮演著極其重要的角色。自八十年代以來，人們一直在孜孜不倦地探究新的PDGF的拮抗劑以用于臨床治療。PDGF的特異性抗體和可溶性PDGF受體是目前比較有效和專一的拮抗劑，但其制備困難，價格昂貴。其它的PDGF拮抗劑，例如蘇拉明(suramin)、新霉素(neomycin)和一些由PDGF衍生的肽均已有報道，然而這些物質(zhì)不是毒性太大就是專一性和藥力不夠理想。另一類可能用于臨床的拮抗劑是tyrphostins，它們可以選擇性抑制PDGF受體的酪氨酸激酶活性。近年來，隨著基因治療這一領(lǐng)域的不斷擴展，寡核苷酸藥物越來越引起人們的廣泛注意，按其特異性作用位點，目前的寡核苷酸藥物可分為三類(1)三鏈形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides，TFO)(作用于DNA)；(2)反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides)和核酶(ribozyme)(作用于mRNA)；(3)Aptamers(作用于蛋白質(zhì))。其中，三鏈形成寡核苷酸可以a．結(jié)合于基因的啟動子區(qū)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，b．結(jié)合于基因內(nèi)部，阻止轉(zhuǎn)錄延伸，或通過激發(fā)突變、同源重組來破壞靶基因；反義寡核苷酸和核酶可以破壞特定的mRNA或抑制其翻譯；Aptamers可干擾或選擇性激活特定的蛋白質(zhì)。目前，反義寡核苷酸和核酶技術(shù)已經(jīng)比較成熟，已有部分進入Ⅰ期臨床應用。1994年Nitta et al．(Neurosurgery，34309，1994)利用針對PDGF-B／c-sis基因的反義寡核苷酸處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，得到很好的抑制癌細胞生長的效果；同年，Thambi et al．(Mo1．Pharmacol．，46437，1994)發(fā)現(xiàn)錘頭狀Ribozyme可在人間皮瘤細胞中切割PDGF-B mRNA而抑制瘤細胞的繁殖。
50年代后期，F(xiàn)elsenfeld在研究核酸同聚物時，最早發(fā)現(xiàn)了RNA-DNA雜交三鏈UAT(U代表PolyU，A代表PolyA，T代表PolyT)，后來全DNA三鏈很快被發(fā)現(xiàn)，即TAT和C+GC(C+是指質(zhì)子化的PolyC，G代表PolyG)。1968年，Morgan發(fā)現(xiàn)E．Coli中RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄可被第三條RNA鏈所抑制。由于當時尚無成熟的寡核苷酸合成技術(shù)，因此對三鏈的研究僅限于核酸同聚物。直到80年代末期，Moser利用合成的寡核苷酸證明，一段均聚嘌呤均聚嘧啶的DNA雙鏈可以與第三條特定組成的寡核苷酸鏈結(jié)合成分子間三鏈，此第三條寡核苷酸鏈被稱為三鏈形成寡核苷酸。電泳、化學探針、親和切割、酶切、遠經(jīng)外光譜分析、X-射線晶體衍射和NMR等多種手段的研究表明，任何一段均聚嘌呤均聚嘧啶組成的雙鏈分子(長度不小于10bp)，都可以與TFO結(jié)合成三鏈。TFO的組成可以是一段均聚嘧啶也可以是一段均聚嘌呤，不同組成的TFO以不同的方式結(jié)合到靶雙鏈上(1)平行方式。均聚嘧啶組成的TFO(CT TFO)占據(jù)靶雙鏈的大溝，靠Hoogsteen氫鍵結(jié)合于靶雙鏈中的嘌呤鏈，并與之有相同的5’到3’方向。(2)反平行方式。均聚嘌呤組成的TFO(GA TFO)占據(jù)靶雙鏈的大溝，靠Reverse Hoogsteen氫鍵結(jié)合于靶雙鏈中的嘌呤鏈，并與之有相反的5’到3’方向。自此，作為一種新興的“抗基因”技術(shù)，三鏈技術(shù)已被用于抑制諸如HIV、c-myc、bcl-2等有害基因的表達，但用三鏈技術(shù)來抑制PDGF-B基因的表達尚未見報道。
本發(fā)明的目的是提供一類抑制血小板衍生生長因子基因表達的三鏈形成寡核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制PDGF-B基因的表達，它們可應用于制備治療腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應等有關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明提供一類抑制血小板衍生生長因子基因表達的三鏈形成寡聚脫氧核苷酸，并通過凝膠阻滯實驗、DNaseⅠ印跡、體外轉(zhuǎn)錄抑制、核蛋白結(jié)合抑制實驗、瞬時表達抑制實驗和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制實驗的結(jié)果證明了它們可與血小板衍生生長因子B鏈基因的5’端上游啟動子核心區(qū)形成穩(wěn)定的三鏈復合物，并可抑制其下游基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。它們可應用于制備治療腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應等有關(guān)疾病的藥物。
(一)TFO的設(shè)計首先，針對人的PDGF-B基因(c-sis原癌基因)的5’上游啟動子區(qū)核心(Jin，et al．，J．Biol．Chem．，26928648，1994)設(shè)計均聚嘌呤組成的TFO1～5。
PDGF-B基因(c-sis原癌基因)5’上游啟動子(-252～+3)的序列如下5’CCATGGTCACTGTGCTGAGGGGCGGGACGGTGGGTCACCCCTAGTTCTTTTTTCCCCAGGGCCAGATTCATGGACTGAAGGGTTGCTCGGCTCTCAGAGACCCCCTAAGCGCCCCGCCCTGGCCCCAAGCCCTCCCCCAGCTCCCGCGTCCCCCCCCTCCTGGCGCTGACTCCGGGCCAGAAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCTCGCACTCTCCCTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAAGGGT3’其中黑體部分為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核心區(qū)SPE。該SPE序列在整個255bp的啟動子中占據(jù)著極為重要的地位，它的缺失將引起整個啟動子的失活，而使PDGF-B基因無法表達。由于該SPE核心區(qū)的80％為嘧啶堿基，因此可考慮利用現(xiàn)有的三鏈技術(shù)，設(shè)計出針對于SPE區(qū)的三鏈形成寡核苷酸TFO，通過與SPE區(qū)形成三鏈來干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而達到抑制PDGF-B基因(c-sis原癌基因)表達的目的。但是，由于SPE區(qū)中間夾雜了四個嘌呤，并不是完全嚴格意義上的均聚嘧啶，因此又針對于SPE下游的一段均聚嘧啶區(qū)(下劃線部分)設(shè)計了TFO1與之完全配對；TFO2～TFO4與部分SPE區(qū)和全部的嘧啶區(qū)配對；TFO5與全長的SPE區(qū)和嘧啶區(qū)配對。序列如下靶基因5’TCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT3’SPE 嘧啶區(qū)TFO1(16nt) 5’G AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO2(25nt) 5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO3(25nt) 5’GGAGA GCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO4(25nt) 5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO5(35nt) 5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO1～5均是嘌呤組成，它們以反平行的方式結(jié)合到靶雙鏈上。TFO1雖然未參入SPE區(qū)內(nèi)生成三鏈，但可以通過與SPE區(qū)下游生成三鏈來干擾SPE區(qū)的構(gòu)象而影響其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合；TFO2～4有部分參入SPE區(qū)形成三鏈；而TFO5則全部地參入SPE區(qū)并同時與其下游嘧啶區(qū)形成三鏈。TFO1～5五種寡核苷酸均在Beckman-Pligo1000 DNA合成儀上，用磷酰胺三酯固相法合成，并經(jīng)過聚丙烯酰胺變性凝膠純化。
(二)三鏈形成的檢測采用凝膠阻滯實驗、DNaseⅠ印跡法來檢測TFO與PDGF-B基因啟動子核心區(qū)的三鏈形成情況。
凝膠阻滯法的基本原理是當TFO與相應的靶雙鏈DNA片段結(jié)合成三鏈復合物后，使原來靶雙鏈DNA分子的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常比游離的靶雙鏈DNA片段的泳動速率慢得多，在放射自顯影X光膠片上形成一較游離靶雙鏈DNA片段滯后的帶型，此方法可以非常靈敏地檢測到三鏈DNA的形成。
寡核苷酸A與B退火雙鏈AB即為PDGF-B基因啟動子核心中的3’端嘧啶區(qū)。即下圖中斜體部分。
C，5’TCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT3’AD，3’AGAGG TGGGT GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA5’BTFO1是據(jù)此設(shè)計的可與之結(jié)合成反平行三鏈的寡核苷酸。由圖1可見，第l道為同位素標記的寡核苷酸AB退火的靶雙鏈對照；第2～9道分別為濃度遞增的TFO1(0．1μmol／l、0．19μmol／l、0．38μmol／l、0．75μmol／l、1．5μmol／l、3μmol／l、6μmol／l、12μmol／l)與等體積1μmol／l AB退火雙鏈形成的三鏈混合物。由圖可見，隨著TFO1濃度的增高，靶雙鏈最終全部與TFO1結(jié)合成三鏈。另以PDGF-B基因啟動子核心區(qū)(同時含有SPE區(qū)和嘧啶區(qū))的寡核苷酸C、D退火雙鏈為靶雙鏈，同上用同位素標記，加入相同濃度的TFO1～TFO5與之結(jié)合，如圖2所示，第1道為寡核苷酸CD退火雙鏈對照(有上下兩條帶，為不同構(gòu)象)；第2～6道分別為TFO1～5各12μmol／1與1μmol／l CD退火雙鏈1μl形成的三鏈混合物。由圖2可知，TFO1使靶雙鏈完全漂移，即全部生成三鏈復合物。相比較而言，最易形成三鏈的是TFO1，其次是TFO5，再其次是TFO4，而TFO2和TFO3使靶雙鏈漂移較少，這是由于序列不同的原因，由此可見三鏈形成的序列特異性。
DNaseⅠ印跡的基本原理是首先將靶雙鏈DNA片段中的一條單鏈的一端選擇性地進行末端標記，然后在Mn2+存在下加入適當濃度的DNaseⅠ，使在DNA鏈上隨機形成缺口，經(jīng)變性后電泳分離，放射自顯影，即可形成以相差一個核苷酸為梯度的DNA條帶。當靶雙鏈DNA與其對應的TFO結(jié)合成三鏈后，TFO可保護相應的DNA順序不受DNaseⅠ的攻擊，因而在放射自顯影圖譜上，DNA梯度條帶在對應于三鏈形成的區(qū)域中斷，從而形成一空白區(qū)域，因而稱為DNaseⅠ印跡法。
選用TFO4為代表來驗證三鏈形成。合成的寡核苷酸(編號為C和D)的退火雙鏈(35bp左右)即c-sis／PDGF-B基因啟動子核心兩端加上SacⅠ和SmaⅠ限制性酶切位點，克隆至puc18中得到的pucSPE18(見圖3)用PvuⅡ和HindⅢ酶切處理后，得到了包含PDGF-B基因啟動子核心在內(nèi)的260bp左右的PvuⅡ-HindⅢ片段，Klenow酶選擇性標記其中一條鏈，DNaseⅠ在Mn2+存在下可在雙鏈DNA分子底物上隨機切一刀。當TFO4結(jié)合到靶雙鏈中的SPE區(qū)時，三鏈便不能被DNaseⅠ所識別，因此在放射白顯影膠片上在三鏈形成區(qū)域出現(xiàn)“足跡”。如圖4所示，第1道是未加TFO對照，第2，3道分別為濃度遞增的TFO4摻入，在TFO4終濃度低至5μmol／l時，就有明顯的“足跡”出現(xiàn)，充分證明了TFO4與靶雙鏈之間的三鏈形成以及三鏈形成的序列特異性。
(三)三鏈功能的檢測在確證本發(fā)明所設(shè)計的TFO可以與PDGF-B基因啟動子核心形成三鏈之后，又進行體外轉(zhuǎn)錄抑制和核蛋白結(jié)合抑制實驗，進一步從功能上證明三鏈形成的可行性和實用性。
將上述PDGF-B基因啟動子核心區(qū)寡核苷酸雙鏈克隆至pT718質(zhì)粒的T7啟動子下方，得到的pT7SPE18(見圖5)用BglⅠ限制性酶切線性化，作為T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄模板，但當啟動子核心區(qū)域分別與TFO1～5結(jié)合成三鏈后，會阻礙轉(zhuǎn)錄的延伸。為減少實驗誤差，在轉(zhuǎn)錄體系中加入了空載體pT718的線性模板，作為內(nèi)參。當TFO與pT7SPE18線性化轉(zhuǎn)錄模板結(jié)合成三鏈而阻止了轉(zhuǎn)錄的進行時，空載體pT718的線性模板的轉(zhuǎn)錄作用會加強，這樣通過比較pT7SPE18和pT718的轉(zhuǎn)錄物量的比例就可以看出TFO的結(jié)合對下游基因轉(zhuǎn)錄的抑制情況。如圖6所示，第1道為對照，即經(jīng)BglⅠ酶切線性化后pT7SPE18和pT718的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(分別用甲，乙表示)；第2～6道分別為線性化后pT7SPE18和pT718與TFO1，TFO1～5結(jié)合成三鏈后的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。設(shè)對照中pT7SPE18和pT718的轉(zhuǎn)錄物量的比例為100％，經(jīng)計算得到，加入TFO1～5后，pT7SPE18和pT718的轉(zhuǎn)錄物量的比例分別為72．7％、72．1％、62．4％、45．5％和72．1％。這表明，在TFO與pT7SPE18結(jié)合成三鏈后阻礙了轉(zhuǎn)錄的延伸，從而以空載體pT718為模板的轉(zhuǎn)錄作用加強，同時也反映了TFO的作用專一性。
由于TFO設(shè)計的目的是與PDGF-B基因啟動子核心區(qū)結(jié)合成三鏈而阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來抑制下游PDGF-B基因的表達，因此又作了核蛋白結(jié)合抑制實驗來檢測TFO對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的抑制情況。
凝膠阻滯法檢測TFO干擾核蛋白因子與*PROMOTER結(jié)合的基本原理是當DNA結(jié)合蛋白(核蛋白因子)與相應的DNA片段(*PROMOTER)結(jié)合而形成DNA-蛋白質(zhì)復合物后，使DNA分子的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常比游離的DNA片段的泳動速率慢得多，在放射自顯影X光膠片上形成一較游離DNA片段滯后的帶型。但當DNA片段上的蛋白結(jié)合位點被TFO占據(jù)而形成三鏈后便不能再與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，便不能出現(xiàn)較游離DNA片段滯后的帶型。
首先人工合成了PDGF-B基因上游255bp(-252～+3)啟動子，由于DNA合成儀合成長度大于100Nt的核苷酸的產(chǎn)率較低，因此采取分段合成后再退火連接的方法，通過PCR(聚合酶鏈式反應)(見圖7)，擴增出足量的PDGF-B基因5’上游啟動子(-252～+3)片段，再克隆至puc18質(zhì)粒的SacⅠ和SmaⅠ酶切位點之間，這樣構(gòu)建的質(zhì)粒命名為puc18PDGFpromoter(圖8)。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切下啟動子片段并用同位素標記，記作*PROMOTER，與PMA(佛波酯)處理過的人K562細胞(慢性髓原白血病細胞)核蛋白抽提物作結(jié)合實驗。由于K562細胞在PMA處理后高表達PDGF-B基因，因此其核蛋白抽提物中含有與PDGF-B表達有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可以與*PROMOTER結(jié)合，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上轉(zhuǎn)錄因子*PROMOTER復合物比游離的*PROMOTER遷移得慢。如圖9所示，第1道為游離的新鮮熱變性的*PROMOTER探針，第2道為新鮮熱變性的*PROMOTER探針與核蛋白結(jié)合，第3道為新鮮熱變性的*PROMOTER探針與20倍量的非放射性的PROMOTER探針混合后再與核蛋白結(jié)合。由圖9可見，第2道有清晰的蛋白結(jié)合條帶，而相應的游離探針(第1道)和含有非放競爭性探針結(jié)合(第3道)的均未出現(xiàn)蛋白結(jié)合條帶，說明這種DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合是序列特異性的。第4道為三鏈形成條件下的游離*PROMOTER探針，第5道為三鏈形成條件下的*PROMOTER探針與核蛋白結(jié)合，結(jié)果第5道同第2道一樣出現(xiàn)蛋白結(jié)合條帶，而對照第4道未出現(xiàn)。第6～8道、第9～0道、第12～14道分別為TFO1(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO4(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO5(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)與*PROMOTER探針的三鏈混合物與核蛋白的結(jié)合。由圖可見，隨著TFO濃度的遞增，*PROMOTER探針與核蛋白的結(jié)合逐漸減弱，尤其是TFO4和TFO5，在100μmol／l高濃度時，幾乎完全占據(jù)了*PROMOTER探針與蛋白的結(jié)合位點，使之不能與相應的蛋白因子結(jié)合。由于與*PROMOTER探針結(jié)合的蛋白因子已被證明是Sp家族的轉(zhuǎn)錄因子(Yuxin Liang，et al．，Oncogene，13863，1996)，因此，實驗結(jié)果證明，本發(fā)明所設(shè)計的TFO可以干擾PDGF-B基因啟動子核心區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。
(四)三鏈形成寡核苷酸抑制腫瘤細胞c-sis／PDGF-B的基因表達。
選擇人慢性髓原白血病K562細胞做為模型細胞。該細胞在藥物PMA的作用下可高效表達c-sis／PDGF-B基因。
(1)瞬時表達抑制實驗。構(gòu)建載體ⅠpGLpromoter，即將c-sis／PDGF-B基因的啟動子區(qū)(255bp)克隆至熒火蟲熒光素酶報告基因的上游。載體Ⅰ電轉(zhuǎn)至K562細胞中，在PMA作用下，c-sis／PDGF-B基因的啟動子發(fā)揮效力使其下游的熒火蟲熒光素酶報告基因在細胞內(nèi)獲得瞬時表達。熒光素酶活力的高低反映了表達水平的高低，即c-sis／PDGF-B基因的啟動子的活力。預先將TFO與載體Ⅰ形成三鏈后再將該三鏈混合物電轉(zhuǎn)至K562細胞中，其熒光素酶活力大大低于對照空載體。如圖10看到，TFO1，4，5分別使熒光素酶活力降低了56．2％，85．3％和76．3％，即TFO1，4，5對c-sis／PDGF-B基因的啟動子的抑制率達到了56．2％，85．3％和76．3％。
(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制實驗。構(gòu)建載體ⅡneorpGLpromoter，在載體Ⅰ的基礎(chǔ)上克隆入新霉素抗性基因(neor)，使其獲得了穩(wěn)定整合至真核細胞染色體內(nèi)的篩選信號。載體Ⅱ電轉(zhuǎn)入細胞后，穩(wěn)定整合至染色體的細胞株因獲得了新霉素的抗性而可在G418選擇培養(yǎng)基上生長，這樣篩選出的單克隆細胞株攜帶c-sis／PDGF-B基因啟動子控制下的熒光素酶報告基因，在PMA誘導下，可高效表達熒光素酶基因。用含有一定濃度的TFO的培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間后，檢測熒光素酶活力發(fā)現(xiàn)，TFO1，4，5分別使酶活力下降了50．7％，65．8％，84％(見圖11)。進一步證明本發(fā)明所設(shè)計的TFO可在腫瘤細胞水平上有效地抑制c-sis／PDGF-B基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄活力。
綜合上述，凝膠阻滯實驗、DNaseⅠ印跡、體外轉(zhuǎn)錄抑制、核蛋白結(jié)合抑制實驗、瞬時表達抑制和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制實驗的結(jié)果均證明了本發(fā)明所設(shè)計的TFO可與靶位點(PDGF-B基因5’上游啟動子核心區(qū))形成穩(wěn)定的三鏈復合物，并可抑制其下游基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合及啟動子的轉(zhuǎn)錄活力。它們可應用于配制治療腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應等有關(guān)疾病的藥物。該藥物具有價格便宜，專一性好，穩(wěn)定性高等優(yōu)點。
本發(fā)明優(yōu)點隨著基因治療領(lǐng)域的不斷擴展，寡核苷酸越來越成為一種極具吸引力的藥物，它具有以下幾個得天獨厚的優(yōu)點(1)可由機器自動、快速、大批量合成，價格便宜；(2)，專一性好，可以識別特異的核酸序列；(3)具有特定性質(zhì)的寡核苷酸可由體外“定向進化”系統(tǒng)篩選得來；(4)修飾堿基、骨架成分及活性化學基團可以摻入到寡核苷酸中，以提高穩(wěn)定性、結(jié)合力和藥效。因此，越來越多科學家們正致力于各種寡核苷酸藥物的開發(fā)。本發(fā)明所設(shè)計的TFO可以特異性與PDGF-B基因的啟動子核心區(qū)結(jié)合成穩(wěn)定的三鏈，并可抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。它們可應用于制備治療腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應等有關(guān)疾病的藥物。與反義寡核苷酸和核酶技術(shù)相比，新興的三鏈技術(shù)則更具其自身獨特的優(yōu)點，即，TFO是在轉(zhuǎn)錄的水平上直接作用于基因本身，因此，只需很少量的TFO分子就可以達到調(diào)控靶基因表達的目的，而反義寡核苷酸和核酶則需要大大過量的分子來結(jié)合或切割相應的mRNA。


圖1，凝膠阻滯電泳圖譜(以c-sis／PDGF-B基因的5’上游啟動子核心的嘧啶區(qū)為靶雙鏈)第1道，寡核苷酸AB退火雙鏈對照；第2～9道，0．1μmol／l、0．19μmol／l、0．38μmol／l、0．75μmol／l、1．5μmol／l、3μmol／l、6μmol／l、12μmol／l TFO1各2．5μl與等體積lμmol／l AB退火雙鏈形成的三鏈混合物。
圖2，凝膠阻滯電泳圖譜(以c-sis／PDGF-B基因的5’上游啟動子核心為靶雙鏈)第1道，寡核苷酸CD退火雙鏈對照；第2～6道，TFO1，TFO2，TFO3，TFO4，TFO5各12μmol／l與1μmol／lCD退火雙鏈1μl形成的三鏈混合物。
圖3，pucSPE18質(zhì)粒圖譜。黑體部分是c-sis／PDGF-B基因啟動子核心，序列為3’CCC TTTCCTCTTCCCTCTCACGCTCTCCACCCACCTCT C 5’ (C)5’GGG AAAGGAGAAGGGAGAGTGCGAGAGGTGGGTGGAGA GAGCT3’ (D)左右兩端劃線處分別為SmaⅠ和SacⅠ酶切位點。
圖4，DNaseⅠ印跡圖譜第1道，pucSPE18用PvuⅡ和HindⅢ酶切處理后的含c-sis／PDGF-B基因啟動子核心在內(nèi)的PvuⅡ-HindⅢ片段30nmol／l，經(jīng)DNaseⅠ酶切圖；第2，3道，10和20μmol／l TFO4與PvuⅡ-HindⅢ片段的三鏈DNaseⅠ酶切圖。
圖5，pT7SPE18質(zhì)粒圖譜。黑體部分是c-sis／PDGF-B基因啟動子核心，序列為3’CCC TTTCCTCTTCCCTCTCACGCTCTCCACCCACCTCT C 5’ (C)5’GGG AAAGGAGAAGGGAGAGTGCGAGAGGTGGGTGGAGA GAGCT3’ (D)左右兩端劃線處分別為SmaⅠ和SacⅠ酶切位點。
圖6，三鏈抑制T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄圖譜第1道，對照，經(jīng)BglⅠ酶切線性化后pT7SPE18和pT718的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(分別用A，B表示)；第2～6道，線性化后pT7SPE18和pT718與TFO1，TFO2，TFO3，TFO4，TFO5的三鏈的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
圖7，PDGF-B基因5’上游啟動子(-252～+3)的合成和PCR體外擴增示意圖A、B、C、D、E、F、引物1、引物2序列如下A5’CCCATG GTCAC TGTGC TGAGG GGCGG GACGG TGGGTCACCC CTAGT TCTTT TTTCC CCAGG GCCAG ATTCA TGGACTGAAG GGTTG3’；B5’C CTTCA GTCCA TGAAT CTGGC CCTGG GGAAA AAAGA ACTAGGGGTG ACCCA CCGTC CCGCC CCTCA GCACA GTGAC CATGG GAGCT 3’；C5’CTCGG CTCTC AGAGA CCCCC TAAGC GCCCC GCCCT GGCCCCAAGC CCTCC CCCAG CTCCC GCGTC CCCCC CCTCC TGGCGCTGAC 3’；D5’G CGCCA GGAGG GGGGG GACGC GGGAG CTGGG GGAGGGCTTG GGGCC AGGGC GGGGC GCTTA GGGGG TCTCT GAGAGCCGAG CAAC 3’；E5’TCCGG GCCAG AAGAG GAAAG GCTGT CTCCA CCCAC CTCTCGCACT CTCCC TTCTC CTTTA TAAAG GCCGG AACAG CTGAAAGGGT CCC 3’；F5’GGG ACCCT TTCAG CTGTT CCGGC CTTTA TAAAG GAGAAGGGAG AGTGC GAGAG GTGGG TGGAG ACAGC CTTTC CTCTTCTGGC CCGGA GTCA 3’；引物15’ATTCG AGCTC CCATG GTCAC TGTGC 3’；引物23’TTGTC GACTT TCCCA GGG CC CCTAG 5’圖8，puc18PDGFpromoter質(zhì)粒圖譜。黑體部分是PDGF-B基因5’上游啟動子(-252～+3)，序列為5’CCATGGTCACTGTGCTGAGGGGCGGGACGGTGGGTCACCCCTAGTTCTTTTTTCCCCAGGGCCAGATTCATGGACTGAAGGGTTGCTCGGCTCTCAGAGACCCCCTAAGCGCCCCGCCCTGGCCCCAAGCCCTCCCCCAGCTCCCGCGTCCCCCCCCTCCTGGCGCTGACTCCGGGCCAGAAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCTCGCACTCTCCCTTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAAGGGT3’圖9，TFO干擾核蛋白因子與PDGF-B基因啟動子結(jié)合的凝膠電泳圖譜第1道，游離的新鮮熱變性的*PROMOTER探針；第2道，新鮮熱變性的*PROMOTER探針與核蛋白結(jié)合；第3道，新鮮熱變性的*PROMOTER探針與20倍量的非放射性的PROMOTER探針的混合物與核蛋白結(jié)合；第4道，三鏈形成條件下的游離*PROMOTER探針；第5道，三鏈形成條件下的*PROMOTER探針與核蛋白結(jié)合；第6～8道、第9～10道、第12～14道，TFO1(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO4(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO5(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)與*PROMOTER探針的三鏈混合物與核蛋白的結(jié)合。
*PROMOTER濃度為0．1μmol／l。核蛋白濃度2μg／μl。
圖10，熒光素酶瞬時表達抑制實驗的酶活測定，縱坐標相對熒光素酶活力，即來自于pGL3promoter的熒火蟲熒光素酶活力相對于來自pRLSV40的Renilla熒光素酶的比例。
圖11，熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制實驗的酶活測定，縱坐標相對熒光素酶活力，即設(shè)未加TFO的K562對照細胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的K562細胞熒光素酶活力為100％。
本發(fā)明通過以下實施例來具體說明。
實施例1 TFO及相應靶雙鏈的合成一 ，合成下列寡核苷酸TFO1， 5’G AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO2， 5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO3， 5’GGAGA GCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO4， 5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO5， 5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’編號A，5’CTC TCC CTTCTC CTT T3’編號B，5’AAA GGA GAA GGG AGA G3’編號C，5’CTCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’編號D，5’GGG AAAGG AGAAG GGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3其中，編號A、B退火雙鏈為PDGF-B基因的5’上游啟動子核心的嘧啶區(qū)；編號C、D退火雙鏈為PDGF-B基因的5’上游啟動子核心兩端各加上SacⅠ和SmaⅠ酶切位點。
以上寡核苷酸均在Beckman-Olig01000 DNA合成儀上，用磷酰胺三酯固相法，用0．2μmole dT固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，以0．2μmole合成程序合成。
二，寡核苷酸的純化用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法純化。
1，合成柱注入3ml濃氨水，放置10分鐘，抽出濃氨水，裝入可密封的小瓶，蓋緊瓶口，55℃保溫過夜。
2，吸出瓶中液體，真空濃縮至干，重新溶于100μl 50％甲酰胺(0．05％二甲苯青，0．05％溴酚藍)
3，7mol／l尿素-15～20％聚丙酰胺凝膠電泳。
4，回收在增感屏上割下紫外照射下的黑色目的條帶，用核酸浸泡液(0．1％SDS，0．5mol／l乙酸胺，10mmol／l乙酸鎂)浸泡，測A260，計算產(chǎn)物量，乙醇沉淀兩次，吹干，-20℃保存。
實施例2凝膠阻滯電泳實驗所用的緩沖液TE(pH 8．0)10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；lmmol／l EDTA(pH 8．0)10×T4 Polynucleotide kinase緩沖液700mmol／l Tris-HCl(pH 7．6)，100mmol／l MgCl2，50mmol／l DTTAsb20mmol／l二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl2TBM89mmol／l Tris-硼酸；20mmol／l MgCl2一，以c-sis／PDGF-B基因的5’上游啟動子核心的嘧啶區(qū)為靶雙鏈1，合成的寡核苷酸(編號A，5’CTC TCC CTT CTC CTT T3’；編號B，5’AAA GGA GAA GGG AGA G3’)各1OD，分別溶于100μl TE。取1μlA進行5’γ-P標記。寡核苷酸A1μl10×kinase緩沖液 1μlγ-p32ATP 1μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)T4kinase 1μl(2U)H2O 6μl37℃ 30分鐘，加入2μl寡核苷酸B，100℃ 3分鐘，退火，15％非變性膠回收退火雙鏈。
2，雙鏈沉淀一次，溶于20μl Asb，終濃度為～1μmol／l。
3，合成的寡核苷酸(TFO1，5’G AGA GGG AAG AGG AAA3’)5OD，溶于100μl Asb，按一系列稀釋度用Asb進行稀釋。終濃度分別為0．1μmol／l、0．19μmol／l、0．38μmol／l、0．75μmol／l、1．5μmol／l、3μmol／l、6μmol／l、12μmol／l，各取2．5μl，100℃ 3分鐘，驟冷至0℃，立即與等體積的標記雙鏈混合，65℃ 10分鐘，室溫2小時，4℃過夜。15％非變性聚丙烯酰胺凝膠4℃，75V電泳4小時。抽干，-70℃放射自顯影。
15％非變性聚丙烯酰胺凝膠參見分子克隆(金冬雁，黎孟楓等譯，第二版，1996)。將TBE換成TBM。
結(jié)果(見圖1)寡核苷酸A與B退火雙鏈AB即為PDGF-B基因啟動子核心中的3’端嘧啶區(qū)。即下圖中斜體部分。
5’TCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT 3’SPE3’AGAGG TGGGT GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 5’TFO1是據(jù)此設(shè)計的可與之結(jié)合成反平行三鏈的寡核苷酸。凝膠阻滯實驗結(jié)果表明，同位素標記的靶雙鏈可全部與TFO1結(jié)合，生成遷移率相對較低的三鏈復合物。從圖1上可看出，當TFO1的濃度為0．38μmol／l時，同位素標記的靶雙鏈有一半?yún)⑴c了三鏈形成，因而TFO1與靶雙鏈AB的表觀結(jié)合常數(shù)Km為0．38μmol／l。
二，以PDGF-B基因的5’上游啟動子核心為靶雙鏈1，合成的寡核苷酸(編號C 5’C TCTCC ACCCA CCTCT CGCACTCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’；編號D 5’GGG AAAGG AGAAGGGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3’)各2OD，分別溶于40μl TE。取1μl D進行5’γ-P標記。
寡核苷酸D1μl10×kinase緩沖液 1μl7-p32ATP1μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)T4kinase1μl(2U)H2O 6μl37℃ 30分鐘，加入1μl寡核苷酸C，100℃ 3分鐘，退火，15％非變性膠回收退火雙鏈。
2，雙鏈沉淀一次，溶于20μl Asb，終濃度為～1μmol／l。
3，合成的寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO2，5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO3， 5’GGAGAGCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO4， 5’GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA 3’； TFO5，5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA3’)5OD，分別用Asb，稀釋至終濃度為12μmol／l，各取5μl，100℃ 3分鐘，驟冷至0℃，立即與1μl步驟2中標記的雙鏈混和，65℃ 10分鐘，室溫2小時，4℃過夜。12％非變性膠4℃，75V電泳4小時。抽干，-70℃放射白顯影。
結(jié)果(見圖2)寡核苷酸C與D退火雙鏈C-D即為PDGF-B基因啟動子核心區(qū)(兩端加上SacⅠ和SmaⅠ酶切位點)。TFO1～TFO5在等濃度下與之結(jié)合的情況如圖2所示TFO1使靶雙鏈完全漂移，即全部生成三鏈復合物。相比較而言，最易形成三鏈的是TFO1，其次是TFO5，再其次是TFO4，而TFO2和TFO3使靶雙鏈漂移較少。
實施例3 DNaseⅠ印跡法的檢測實驗所用的緩沖液TE(pH 8．0)10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；1mmol／l EDTA (pH 8．0)10×Klenow酶緩沖液500mmol／1 Tris-HCl(pH 7．2)，10mmol／l MgSO4，1mmol／l DTTAsb20mmol／l二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl2甲酰胺上樣緩沖液98％甲酰胺，10mmol／l EDTA(pH 8．0)，0．1％二甲苯青，0．1％溴酚藍1，質(zhì)粒pucSPE18的構(gòu)建(圖3)合成的寡核苷酸(編號C 5’C TCTCC ACCCA CCTCT CGCACTCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’；編號D 5’GGG AAAGG AGAAGGGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3’)各1OD，分別溶于100μlTE。退火，克隆至puc18質(zhì)粒(購自華美生物工程公司)的SmaⅠ和SacⅠ酶切位點之間，所得的質(zhì)粒命名為pucSPE18。
2，合成的寡核苷酸(TFO4，5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGAGGAAA 3’)用Asb分別稀釋到10、20μmol／l。
3，pucSPE18用PvuⅡ和HindⅢ雙酶切，1％低熔點膠回收含有C-D的PvuⅡ-HindⅢ片段。
4，Klenow酶標記PvuⅡ-HindⅢ片段 3pmol10×Klenow酶緩沖液 1μlKlenow酶 1μl(5U)α-p32ATP 1μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)H2O 7μl室溫15分鐘，補加1μl 2mmol／l dNTP，繼續(xù)室溫5分鐘，90℃ 3分鐘使酶失活。乙醇沉淀。溶于TE至終濃度為30nmol／l。
5，DNaseⅠ印跡a，標記的PvuⅡ-HindⅢ片段分別與一系列稀釋度的TFO2各4μl等體積混和，65℃ 10分鐘，室溫2小時，4℃過夜。(FFO25-80μmol／l，PvuⅡ-HindⅢ片段30nmol／l)；b，8μl三鏈混合物中，加入0．9μl 10×(10mmol／l Tris．Cl，5mmol／lMnCl2)，5μl(0．1U／μl)DNaseⅠ，室溫40秒，立即加入14μl甲酰胺上樣緩沖液，90℃ 3分鐘，9％變性膠上樣。
DNaseⅠ5U稀釋至50μl，用(20mmol／l NaCl，2mmol／l MgCl2，2mmol／lMnCl2)稀釋。
結(jié)果(見圖3、圖4)合成的寡核苷酸(編號為C和D)的退火雙鏈(35bp左右)即c-sis／PDGF-B基因啟動子核心兩端加上SacⅠ和SmaⅠ限制性酶切位點，克隆至puc18中得到的pucSPE18(見圖3)用PvuⅡ和HindⅢ酶切處理后，得到了包含PDGF-B基因啟動子核心在內(nèi)的260bp左右的PvuⅡ-HindⅢ片段，Klenow酶選擇性標記其中一條鏈，DNaseⅠ在Mn2+存在下可在雙鏈DNA分子底物上隨機切一刀。當TFO4結(jié)合到靶雙鏈中的SPE區(qū)時，三鏈便不能被DNaseⅠ所識別，因此在放射自顯影膠片上在三鏈形成區(qū)域出現(xiàn)“足跡”。如圖4所示，最左邊是未加TFO對照，向右依次是濃度遞增的TFO4摻入，在TFO4終濃度低至5μmol／l時，就有明顯的“足跡”出現(xiàn)，充分證明了TFO4可以與靶雙鏈形成穩(wěn)定的三鏈。
實施例4 T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄的抑制實驗所用的緩沖液TE(pH 8．0)10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；1mmol／l EDTA(pH 8．0)5×轉(zhuǎn)錄緩沖液200mmol／l Tris-HCl(pH 7．9)，30mmol／l MgCl2，10mmol／lspermidine，50mmol／l NaCl．Asb20mmol／l二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl2甲酰胺上樣緩沖液98％甲酰胺，10mmol／l EDTA(pH 8．0)，0．1％二甲苯青，0．1％溴酚藍1，質(zhì)粒pT7SPE18的構(gòu)建(圖5)合成的寡核苷酸(編號1093 5’C TCTCC ACCCA CCTCT CGCACTCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’；編號1094 5’GGG AAAGG AGAAGGGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3’)各1OD，分別溶于100μl TE。退火，克隆至pT718質(zhì)粒(購白GibcoBRL公司)中(用SmaⅠ和SacⅠ雙酶切)，所得的質(zhì)粒命名為pT7SPE18。
2，合成寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO2，5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO3， 5’GGAGAGCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO4， 5’GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA 3’； TFO5， 5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA3’)各用Asb溶解至終濃度為100μmol／l。
3，體外轉(zhuǎn)錄(一)，模板制備a)BglⅠ酶切pT718和pT7SPE18使之完全線性化；b)蛋白酶K處理；在上述酶切液中加入1／10體積的10×蛋白酶K緩沖液(500mmol／l NaCl，50mmol／l EDTA(pH 8．0)，100mmol／l Tris．Cl(pH 8．0))，1／10體積5％SDS，終濃度為100μg／ml的蛋白酶K，37℃溫育1小時，酚氯仿抽提及乙醇沉淀。
c)處理后的線性pT718和pT7SPE18模板混和溶于TE至終濃度分別為0．5 μg／μl。先分別與TFO1～TFO5各1μl等體積混合，65℃ 10分鐘，室溫2小時，4℃過夜。對照組用1μl Asb代替TFO。
(二)，轉(zhuǎn)錄反應模板(TFO1～5分別與線性pT718、pT7SPE18混合物)2μl5×轉(zhuǎn)錄緩沖液2μlNTP(20 mmol／l) 0．25μlRNasin(50U／μl) 0．5μlT7RNA聚合酶 0．5μl(5U)α-p32ATP0．25 μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)H2O 3．5μl30℃ 30分鐘，加入等體積的甲酰胺上樣緩沖液，100℃ 3分鐘，迅速冰浴，6％變性膠上樣5μl。抽干，放射自顯影。掃描轉(zhuǎn)錄物的黑度以定量。
結(jié)果(見圖5、圖6)合成的寡核苷酸(編號為C和D)的退火雙鏈(35bp左右)即PDGF-B基因啟動子核心兩端加上SacⅠ和SmaⅠ限制性酶切位點，克隆至pT718的T7啟動子下方，得到的pT7SPE18(見圖5)用BglⅠ限制性酶切使之線性化后，可作為T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄模板，但當啟動子核心區(qū)域分別與TFO1～3結(jié)合成三鏈后，會阻礙轉(zhuǎn)錄的延伸。為減少實驗誤差，在轉(zhuǎn)錄體系中加入了空載體pT718的線性模板，作為內(nèi)參。設(shè)對照中pT7SPE18和pT718的轉(zhuǎn)錄物量的比例為100％，經(jīng)計算得到，加入TFO1～5后，pT7SPE18和pT718的轉(zhuǎn)錄物量的比例分別為72．7％、72．1％、62．4％、45．5％和72．1％(見圖6)。這表明，在TFO與pT7SPE18結(jié)合成三鏈后阻礙了轉(zhuǎn)錄的延伸，從而以空載體pT718為模板的轉(zhuǎn)錄作用加強，同時也反映了TFO的作用專一性。
實施例5TFO干擾蛋白因子與啟動子核心區(qū)的結(jié)合實驗所用的緩沖液
PBSNaCl 8g；KCl 0．2g；Na2HPO41．15g；KH2PO40．2g，定容至1000ml．緩沖液A10mmol／l HEPES(pH 7．9，4℃)；1．5mmol／l MgCl2；10mmol／lKCl；0．5mmol／l DTT緩沖液C20mmol／l HEPES(pH 7．9)；25％V／V甘油；0．42mol／l NaCl；1．5mmol／l MgCl2；0．2mmol／l EDTA；0．5mmol／l PMSF；0．5mmol／l DTT緩沖液D20mmol／l HEPES(pH 7．9)；20％V／V甘油；0．1mol／l KCl；0．2mmol／l EDTA；0．5mmol／l PMSF；0．5mmol／l DTT緩沖液E2×緩沖液D與等體積的甘油混合。
TE(pH 8．0)10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；1mmol／l EDTA(pH 8．0)Asb20mmol／l二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl210×T4 Polynucleotide kinase緩沖液700mmol／l Tris-HCl(pH 7．6)；100mmol／l MgCl2；50mmol／l DTT10×PCR緩沖液100mmol／l Tris．HCl；pH8．8at 25℃；500mmol／l KCl；0．8％NP4010×Klenow酶緩沖液500mmol／l Tris-HCl(pH 7．2)，10mmol／l MgSO4，lmmol／l DTT5×Binding緩沖液100mmol／l Tris．HCl(pH8．0)；25mmol／l MgCl2；25mmol／l CaCl2；0．5mmol／l EDTA；0．5mmol／l DTT；250μg／ml BSA500mmol／l KCl；15％甘油TBE90mmol／l Tris-硼酸；2mmol／l EDTA(一)細胞核蛋白抽提1，細胞培養(yǎng)K562細胞(慢性髓原白血病細胞，購白上海實生細胞公司)，培養(yǎng)于5％CO2，37℃，RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10％小牛血清；2，4-6×105K562細胞／毫升，室溫2000rpm，10分鐘；3，細胞重懸于5倍體積的4℃的PBS，同1離心；4，細胞懸于5倍體積緩沖液A，10分鐘，離心收獲細胞；5，懸于2倍體積(第一次用緩沖液A洗之前的體積)緩沖液A，然后用勻漿器勻漿；
6，勻漿液2000rpm，10分鐘，棄上清；7，沉淀第二次高速離心，25000g，20分鐘，去上清；8，沉淀每109細胞懸于3ml緩沖液C，勻漿器勻漿；9，勻漿液對50體積的緩沖液D透析5hr；10，透析液25000g，20分鐘；11，上清即為核蛋白抽提物，繼續(xù)對緩沖液E透析，得到的是已含50％甘油的核蛋白。
(二)PDGF-B基因5’上游啟動子(-252～+3)的克隆l，合成寡核苷酸(編號A5’C CCATG GTCAC TGTGC TGAGGGGCGG GACGG TGGGT CACCC CTAGT TCTTT TTTCC CCAGGGCCAG ATTCA TGGAC TGAAG GGTTG 3’； B 5’C CTTCA GTCCATGAAT CTGGC CCTGG GGAAA AAAGA ACTAG GGGTG ACCCACCGTC CCGCC CCTCA GCACA GTGAC CATGG GAGCT 3’； C5’CTCGG CTCTC AGAGA CCCCC TAAGC GCCCC GCCCT GGCCCCAAGC CCTCC CCCAG CTCCC GCGTC CCCCC CCTCC TGGCGCTGAC 3’； D5’G CGCCA GGAGG GGGGG GACGC GGGAG CTGGGGGAGG GCTTG GGGCC AGGGC GGGGC GCTTA GGGGG TCTCTGAGAG CCGAG CAAC 3’；E5’TCCGG GCCAG AAGAG GAAAGGCTGT CTCCA CCCAC CTCTC GCACT CTCCC TTCTC CTTTATAAAG GCCGG AACAG CTGAA AGGGT CCC 3’；F5’GGG ACCCTTTCAG CTGTT CCGGC CTTTA TAAAG GAGAA GGGAG AGTGCGAGAG GTGGG TGGAG ACAGC CTTTC CTCTT CTGGC CCGGAGTCA 3’；引物15’ATTCG AGCTC CCATG GTCAC TGTGC3’(SacⅠ)；引物23’TTGTC GACTT TCCCA GGGCC CCTAG5’(SmaⅠ))2，合成的寡核苷酸A、B、C、D、E、F，T4激酶使之磷酸化。
寡核苷酸(A-F)100pmol 20μl10×kinase緩沖液 10μlATP(10mmol／l) 0．5μl
T4kinase1μl(7．5U)H2O 69μl37℃ 30分鐘，68℃ 10分鐘，1／2體積無水乙醇沉淀回收。溶于TE緩沖液，測A260，定量。
3，取A-F各7．5μl(約80pmol)兩兩退火(AB、CD、EF)，混合，45℃ 5分鐘，冰浴。
4，連接反應AB、CD、EF(各15μl) 45μl10×T4連接酶緩沖液 6μlATP(10mmol／l) 3μlT4DNA連接酶 6μl(6U)16℃連接過夜。
5，PCR克隆10×PCR緩沖液10μl(100mmol／l Tris．HCl．pH8．8 at 25℃；500mmol／lKCl；0．8％NP40)dNTP(10mmol／l) 2μlMgCl2(25mmol／l) 6μl引物1 1μl(100pmol)引物2 1μl(100pmol)步驟4中連接液 1μlTaq酶 0．5μl(2U)H2O 79μl94℃ 30s；72℃ 1∶30s；53℃ 1∶30s，30 cycle。回收260bp左右片段，克隆至puc18(購自華美生物工程公司)的SacⅠ，SmaⅠ位點間。這樣構(gòu)建的質(zhì)粒命名為puc18PDGFpromoter。
(三)32P標記的*PROMOTER探針制備1，puc18PDGFpromoter質(zhì)粒24μg，用EcoRⅠ SmaⅠ酶切，2％低熔點膠回收PDGFpromoter片段，乙醇沉淀，抽干。
2，向管中加入
10×Klenow酶緩沖液2μlH2O 15μlKlenow酶1μlα-P32dATP2μl室溫15分鐘，補加1μl 2mmol／l dNTP，繼續(xù)反應5分鐘，加入80μlH2O，50μl 7．5mol／l NH4Ac，300μl無水乙醇沉淀，抽干，溶于50μlTE，至終濃度為0．1μmol／l。
(四)凝膠阻滯法檢測TFO干擾核蛋白因子與*PROMOTER結(jié)合1，合成寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO4，5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’；TFO5，5’AGAGGAGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA3’)各用Asb溶解至終濃度為100μmol／l。
2，32P標記的*PROMOTER探針(3×106cpm／pmol)與相應的TFO(100-1，10-1，1稀釋度)各1．5μl，預先65℃10分鐘，室溫2hr，4℃過夜。
3，核蛋白抽提物3μl(6μg)預先與Poly(dI-dC)1μl(1μg／μl)、5×Binding緩沖液2μl和H2O 1μl室溫10分鐘，32p標記的*PROMOTER探針與相應的一系列稀釋度的TFO混合物及非放的競爭性PROMOTER探針然后加入，繼續(xù)室溫10分鐘。
4，電泳5％非變性聚丙烯酰胺膠，0．25×TBE，4℃ 200V電泳至溴酚蘭到底。
抽干，放射自顯影。
結(jié)果(見圖7、圖8、圖9)由于DNA合成儀合成長度大于100Nt的核苷酸的產(chǎn)率較低，因此采取分段合成后再退火連接的方法(見圖7)，通過PCR(聚合酶鏈式反應)，擴增出足量的PDGF-B基因5’上游啟動子(-252～+3)片段，再克隆至puc18質(zhì)粒的SacⅠ和SmaⅠ酶切位點之間，這樣構(gòu)建的質(zhì)粒命名為puc18PDGFpromoter(圖8)。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切該質(zhì)粒得到的含PDGF名為*PROMOTER。選用K562細胞作為研究對象，因為K562細胞經(jīng)PMA(佛波酯)處理后可高表達PDGF-B基因。通過抽提經(jīng)PMA處理后的K562細胞核蛋白，與同位素標記的*PROMOTER探針作凝膠阻滯電泳，結(jié)果見圖9。第1道為游離的新鮮熱變性的*PROMOTER探針，第2道為新鮮熱變性的*PROMOTER探針與核蛋白結(jié)合，第3道為新鮮熱變性的*PROMOTER探針與20倍量的非放射性的PROMOTER探針混合后再與核蛋白結(jié)合。由圖可見，第2道有清晰的蛋白結(jié)合條帶，而相應的游離探針(第1道)和含有非放競爭性探針結(jié)合(第3道)的均未出現(xiàn)蛋白結(jié)合條帶，說明這種DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合是序列特異性的。第4道為三鏈形成條件下的游離*PROMOTER探針，第5道為三鏈形成條件下的*PROMOTER探針與核蛋白結(jié)合，結(jié)果第5道同第2道一樣出現(xiàn)蛋白結(jié)合條帶，而對照第4道未出現(xiàn)。第6～8道、第9～10道、第12～14道分別為TFOl(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO4(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO5(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)與*PROMOTER探針的三鏈混合物與核蛋白的結(jié)合。由圖可見，隨著TFO濃度的遞增，*PROMOTER探針與核蛋白的結(jié)合逐漸減弱，尤其是TFO4和TFO5，在100μmol／l高濃度時，幾乎完全占據(jù)了*PROMOTER探針與蛋白的結(jié)合位點，使之不能與相應的蛋白因子結(jié)合。由于與*PROMOTER探針結(jié)合的蛋白因子已被證明是Sp家族的轉(zhuǎn)錄因子(Yuxin Liang，et al．，Oncogene，13863，1996)，因此，本實施例結(jié)果證明，本發(fā)明所設(shè)計的TFO可以干擾PDGF-B基因啟動子核心區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。
實施例6 TFO抑制腫瘤細胞c-sis／PDGF-B基因表達實驗所用的緩沖液PBSNaCl 8g；KCl 0．2g；Na2HPO41．15g；KH2PO40．2g，定容至1000ml。
Asb20mmol／l二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl2細胞裂解液，底物Ⅰ及底物Ⅱ均來自Promega公司熒光素酶分析試劑盒。
(一)瞬時表達抑制實驗載體ⅠpGL3promoter的構(gòu)建實施例5中PDGF-B基因5’上游啟動子(-252～+3)從puc18PDGFpromoter亞克隆至pGL3basic熒光素酶表達載體(Promega公司)的SacⅠ和HindⅢ之間。
1，TFO與載體Ⅰ的三鏈形成合成的寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO4，5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO5，5’AGAGGAGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA3’)5OD，分別用Asb，稀釋至終濃度為60μmol／l，各取5μl，100℃ 3分鐘，驟冷至0℃，立即與5μl pGL3promoter(5μg／μl)混和，65℃ 10分鐘，室溫2小時，4℃過夜。
2，電轉(zhuǎn)對數(shù)生長期的K562細胞計數(shù)，離心，收獲，重懸于RPMI1640培養(yǎng)基(不含血清)至細胞濃度為1．25×107／ml。500μl K562細胞與1中三鏈混合物以及0．5ng pRLSV40質(zhì)粒(Promega)于冰上混合，Bio-Rad基因電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)，參數(shù)分別為300V，975μF。立即重懸于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO2，通氣培養(yǎng)。
3，熒光素酶測活電轉(zhuǎn)24小時后，將細胞均分兩半，一半用2ng／mlPMA處理，24小時后收獲。冰PBS洗3次。加入500μl裂解液，室溫放置1小時，取30μl細胞裂解液與30μl底物Ⅰ混勻，立即放入熒光計數(shù)計(Lumat LB9507，EG@G BERTHOLD)計數(shù)，計數(shù)時間定為10秒，該數(shù)值為pGL3promoter來源的熒火蟲熒光素酶的活力。再加入30μl底物Ⅱ，同上計數(shù)，該數(shù)值為內(nèi)參照質(zhì)粒pRLSV40來源的Renilla熒光素酶活力，二者的比例為相對熒光素酶活力。
(二)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制實驗載體ⅡneorpGLpromoter構(gòu)建質(zhì)粒pCatneor(本組保存)用KpnⅠ和SacⅠ酶切下neor片段，亞克隆至載體ⅠpGLpromoter中。
載體neorpGL3control構(gòu)建質(zhì)粒pCatneor(本組保存)用KpnⅠ和SacⅠ酶切下neor片段，亞克隆至載體ⅠpGL3control中。20μg載體ⅡneorpGLpromoter或neorpGL3control分別與1．25×107／mlK562細胞500μl冰上混合，同上做電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)48小時后向培養(yǎng)基中加入G418至終濃度為0．5mg／ml。培養(yǎng)2周后，新霉素抗性的單克隆分別命名為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細胞和K562對照細胞。移至96孔板用含有0．01，0．1，1，10，100μmol／l的TFO1，4，5的培養(yǎng)基加入2ng／mlPMA培養(yǎng)72小時后，收獲細胞，冰PBS洗3次。加入500μl裂解液，室溫放置1小時，取30μl細胞裂解液與30μl底物Ⅰ混勻，立即放入熒光計數(shù)計(Lumat LB9507，EG@G BERTHOLD)計數(shù)，計數(shù)時間定為10秒，該數(shù)值為pGL3promoter來源的熒火蟲熒光素酶的活力。
結(jié)果(見圖10、圖11)人慢性髓原K562白血病細胞在PMA誘導下可高表達c-sis／PDGFB基因，為了檢測方便，本發(fā)明利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，即將c-sis／PDGFB基因啟動子克隆到熒光素酶報告基因上游，使后者的表達完全依賴于前者的活力。當TFO與c-sis／PDGFB基因啟動子結(jié)合成三鏈后，阻礙了相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使該啟動子失活，因而熒光素酶報告基因的表達量降低，表現(xiàn)在酶活的降低，因此可以很方便地從熒光素酶的酶活力高低來檢測c-sis／PDGFB基因啟動子的活力。當質(zhì)粒載體Ⅰ電轉(zhuǎn)入K562細胞內(nèi)部，48小時內(nèi)熒光素酶可得到瞬時表達。同時電轉(zhuǎn)pRLSV40質(zhì)粒作為內(nèi)參照，該質(zhì)粒自帶強啟動子及Renilla熒光素酶，圖10所示的相對熒光素酶活力均為來自于pGL3promoter的熒火蟲熒光素酶活力相對于來自pRLSV40的Renilla熒光素酶的比例。第1道為電轉(zhuǎn)的pGL3basic質(zhì)粒(Promega)對照，該質(zhì)粒的熒光素酶報告基因上游無任何啟動子，因此電轉(zhuǎn)后無活力。證明其它道中酶活力完全來自于c-sis／PDGFB基因啟動子。第2道為未加TFO的載體Ⅰ對照。第3，4，5道分別為TFO1，4，5先與載體Ⅰ形成三鏈后再電轉(zhuǎn)后測的酶活。由圖10可見，酶活分別降低了56．2％，85．3％和76．3％，即TFO1，4，5對c-sis／PDGF-B基因的啟動子的抑制率達到了56．2％，85．3％和76．3％。載體Ⅰ雖在48小時內(nèi)有瞬時表達，但之后隨著細胞的傳代分裂，質(zhì)粒會逐漸丟失。因此，又構(gòu)建了載體Ⅱ，攜帶新霉素抗性基因neor，在藥物G418篩選下，得到載體Ⅱ穩(wěn)定整合至細胞染色體內(nèi)部的細胞株。這種細胞株在PMA處理下可高表達熒光素酶基因，可方便地用來檢測c-sis／PDGFB基因啟動子的活力。在細胞培養(yǎng)基中加入100μmol／l TFO1，4，5，培養(yǎng)72小時后，發(fā)現(xiàn)其細胞熒光素酶活力下降了50．7％，65．8％，84％(見圖11)。進一步證明本發(fā)明所設(shè)計的TFO可在腫瘤細胞水平上有效地抑制c-sis／PDGF-B基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄活力，TFO對熒光素酶活力的影響有濃度依賴性，即隨著TFO濃度的增加，熒光素酶活力逐漸下降(數(shù)據(jù)未全列出)，圖11為100μmol／l TFO時的酶活數(shù)據(jù)。K562對照細胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了neorpGL3control質(zhì)粒，該質(zhì)粒自身攜帶CMV強啟動子控制下的熒火蟲熒光素酶報告基因。CMV強啟動子不含有本發(fā)明所設(shè)計的TFO的靶序列，因而TFO不會影響它控制下的熒光素酶活力，圖11也證明，在100μmol／l TFO作用下，其熒光素酶活力未受影響。
權(quán)利要求
1.一類抑制血小板衍生生長因子基因表達的三鏈形成寡核苷酸，其特征在于是針對血小板衍生生長因子-B基因啟動子核心區(qū)SPE的三鏈形成寡核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的一類三鏈形成寡核苷酸，其特征在于包括五種三鏈形成寡核苷酸，它們的序列如下TFO1(16nt) 5’GAGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO2(25nt) 5’ GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO3(25nt) 5’ GGAGA GCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO4(25nt) 5’ GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO5(35nt)5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’
3.如權(quán)利要求1或2所述的一類三鏈形成寡核苷酸的應用，其特征在于它們在制備治療腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應有關(guān)疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類用于抑制PDGF－B基因(c－sis原癌基因)表達的五種三鏈形成寡核苷酸。通過凝膠阻滯實驗、DNasel印跡、體外轉(zhuǎn)錄抑制、核蛋白結(jié)合抑制實驗、瞬時表達抑制實驗和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制實驗證明了這些化合物可與靶位點(PDGF－B基因5’上游啟動子核心區(qū))形成穩(wěn)定的三鏈復合物,并可抑制其下游基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。它們可應用于制備治療腫瘤發(fā)生和生長、動脈粥樣硬化和炎癥反應等有關(guān)疾病的藥物。
文檔編號A61P31/00GK1281862SQ0011671
公開日2001年1月31日 申請日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月9日
發(fā)明者金由辛, 劉靜 申請人:中國科學院上海生物化學研究所