專利名稱：8,8-二取代-13,13a-二氫小檗堿衍生物及其藥物組合物和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和藥物治療學(xué)領(lǐng)域，更具體而言，涉及可作為胰島素增敏劑 的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物及其藥物組合物和醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
從上世紀(jì)五十年代起，一些專家學(xué)者和醫(yī)務(wù)人員對(duì)臨床上廣泛使用的黃連素進(jìn)行 了大量抗糖尿病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黃連素除了抗菌也可以治療糖尿病及其并發(fā) 癥。最近，在現(xiàn)代的動(dòng)物模型上確證了其抗糖尿病的效果，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制為 通過(guò)提高ADP/ATP的比值，促進(jìn)AMPK磷酸化，從而促進(jìn)肌肉和脂肪組織對(duì)葡萄糖的吸收和 禾Ij 用[Diabetes, 2006，55 :2256_2264 ；Biochim. Biophys. Acta.，2006，1760 :1682_1689]。 藥理試驗(yàn)結(jié)果顯示黃連素的起效劑量很大(每天560mg/kg)，為獲得活性更強(qiáng)、毒性更低并 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物候選物，值得進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。本發(fā)明人首先合成了如下所示的3個(gè)系列小檗堿類(BBR analogues)、二氫小檗 堿類(DHBBR analogues)和四氫小檗堿類(THBBR analogues)共計(jì)40多個(gè)化合物
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Χχ: Λ5Γ: Λ5γ；3 ^i::
小檗堿類似物二氫小檗堿類似物四氫小檗堿類似物在L6肌肉細(xì)胞上進(jìn)行葡萄糖吸收和AMPK磷酸化水平測(cè)試，發(fā)現(xiàn)小檗堿類化合物 的促進(jìn)葡萄糖吸收和提高AMPK磷酸化水平的活性都比小檗堿差；二氫小檗堿類的活性與 小檗堿相當(dāng)；四氫小檗堿的活性則大大降低，是小檗堿的30%左右。應(yīng)用Chemdraw ultra 10軟件計(jì)算了小檗堿類和二氫小檗堿類的油水分配系數(shù)IogP分別為-0. 92和3. 88。按 Lipinski' s的五規(guī)則，0 < IogP < 5的化合物一般具有較佳的口服生物利用度，本發(fā)明 人選了 DHBBR進(jìn)行了體內(nèi)的抗糖尿病藥效學(xué)試驗(yàn)，在高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗及肥胖小 鼠、大鼠等多種模型上顯示比小檗堿提高6倍多的療效改善糖耐量和胰島素抵抗，減輕肥 胖及降低血漿中的自由脂肪酸和甘油三酯、緩解脂肪肝[Diabetes，2008，57 :1414_1418]。本發(fā)明人對(duì)BBR和DHBBR進(jìn)行了初步的藥代動(dòng)力學(xué)研究。大鼠灌胃給予BBR后， 在血漿中檢測(cè)不到原形藥物，推測(cè)該藥灌胃給藥后，體內(nèi)發(fā)生首過(guò)代謝或發(fā)生了化學(xué)變化。 灌胃給予DHBBR后，血漿中DHBBR可檢測(cè)到5h，而代謝物BBR血漿濃度可監(jiān)測(cè)到24h。將 BBR和DHBBR的AUC和Cmax加和后進(jìn)行絕對(duì)生物利用度計(jì)算，以AUC。_t計(jì)算，大鼠灌胃給予 DHBBR后，絕對(duì)生物利用度為2. 65%。DHBBR的口服生物利用度比BBR有所提高，但還是很低，分析原因是DHBBR在胃酸 性條件下易氧化成BBR。因此有必要通過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾獲得活性保留，同時(shí)又具有在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二氫小檗堿衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，提出了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于提供一類8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其 生理上可接受的鹽，其具有在酸性條件下化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、促進(jìn)肌肉細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收的活 性、高的口服生物利用度、強(qiáng)的體內(nèi)抗糖尿病活性；本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含上述8，8_ 二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生 物或其生理上可接受的鹽的藥物組合物；本發(fā)明的還一目的在于提供上述8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生 理上可接受的鹽在制備用于治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其并發(fā)癥的藥物中的用途。本發(fā)明提供如下通式(1)所示的8，8-二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物或其生 理上可接受的鹽
(1)其中，R^R2各自獨(dú)立地為H、OlC1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R1、R2 連接成為-O-CH2-O-；R3 SC1-C4 烷基；R4, R5各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R4、R5連接成 為-O-CH2-O-；或者如下通式(2)所示的8，8-二取代-13，13a_ 二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受 的鹽
(2)其中，R^R2各自獨(dú)立地為H、OlC1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R1、R2 連接成為-O-CH2-O-；R3 為 CN 或 COOR6, R6 為 C1-C4 烷基；R4> R5各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R4、R5連接成 為-O-CH2-O-；
或者如下通式(3)所示的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受 的鹽 其中，R1、R2各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R1、R2 連接成為-O-CH2-O-；R3為C1-C4烷基、C1-C4酰氧基或芳香基；R4, R5各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R4、R5連接成 為-O-CH2-O-。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中在通式(1)中R1, R2各自獨(dú)立地為H或C1-C2烷氧基，或禮、R2連接成為-O-CH2-O-；R3 為 C1-C3 烷基；R4, R5各自獨(dú)立地為C1-C2烷氧基；在通式(2)中R1, R2各自獨(dú)立地為H或C1-C2烷氧基，或禮、R2連接成為-O-CH2-O-；R3 為 CN 或 COOR6, R6 為 C1-C2 烷基；R4, R5各自獨(dú)立地為C1-C2烷氧基；在通式(3)中R1, R2各自獨(dú)立地為H或C1-C2烷氧基，或禮、R2連接成為-O-CH2-O-；R3為C1-C2烷基或苯基；R4, R5各自獨(dú)立地為C1-C2烷氧基。進(jìn)一步優(yōu)選，本發(fā)明的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物選自如下表所示 的化合物1-10中 本發(fā)明的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物可通過(guò)如下的合成方法合成
R3=垸基或?；鵕3 = CN或COOEt8-氧取代二氫小檗堿在三氯氧磷中回流得到重要中間體8-氯小檗堿。8-氯小檗 堿和不同的格式試劑反應(yīng)，得到8位二烷基取代二氫小檗堿，即通式(1)化合物；8-氯小檗 堿和不同的伯胺反應(yīng)，生成不同的亞胺化合物，即通式(3)化合物；8-氯小檗堿與丙二酸二 乙酯或丙二腈反應(yīng)就可以得到8位形成雙鍵的二氫小檗堿類似物，即通式(2)化合物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提供包含治療有效劑量的8，8_ 二取代-13，13a- 二氫小檗堿 衍生物或其生理上可接受的鹽的藥物組合物，該組合物可以進(jìn)一步包括藥學(xué)上的常規(guī)輔 料，例如賦形劑、甜味劑等。本發(fā)明的8，8_ 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受的鹽，具有 促進(jìn)肌肉細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收的活性，可用于制備用于治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其 并發(fā)癥的藥物。本發(fā)明的8，8_二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受的鹽可用于 治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其并發(fā)癥，該治療方法包括向病人給予治療有效量的8， 8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受的鹽。有益效果本發(fā)明設(shè)計(jì)與合成了 8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生理上可接 受的鹽，其對(duì)肌肉細(xì)胞有促進(jìn)葡萄糖吸收的作用，整體動(dòng)物試驗(yàn)表明，該類化合物具有改善 糖耐量和胰島素抵抗、減輕肥胖、緩解脂肪肝等功效，且生物利用度高，增強(qiáng)了體內(nèi)的藥效， 同時(shí)在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該類化合物可用于治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝及其并發(fā) 癥。本發(fā)明化合物合成簡(jiǎn)單，易于制備，且合成原料豐富。
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圖IA為經(jīng)化合物4治療肥胖小鼠4周后腹腔注射葡萄糖耐受(ipGTT)曲線圖，其 中CH-con為正常小鼠組，HF-con為肥胖小鼠組，HF-化合物4為化合物4治療組；圖IB為經(jīng)化合物4治療肥胖小鼠4周后腹腔注射葡萄糖耐受(ipGTT)曲線下面 積，其中CH-con為正常小鼠組，HF-con為肥胖小鼠組，HF-化合物4為化合物4治療組；圖2為經(jīng)化合物4治療肥胖小鼠4周后腹腔注射胰島素耐量(ITT)曲線圖；圖3A為經(jīng)化合物4治療4周后肥胖小鼠體重的變化圖；圖3B為經(jīng)化合物4治療4周后肥胖小鼠皮下脂肪/體重比例的變化圖；圖4A為經(jīng)化合物4治療4周后的肥胖小鼠血漿中的胰島素含量的變化圖；圖4B為經(jīng)化合物4治療4周后的肥胖小鼠血漿中的甘油三酯含量的變化圖；圖4C為經(jīng)化合物4治療4周后的肥胖小鼠肝臟中的甘油三酯含量的變化圖；圖5A為經(jīng)化合物4治療4周的db/db小鼠餐后血糖的變化圖，其中WT-con為正 常小鼠組，db/db-con為糖尿病小鼠組，db/db-化合物4為化合物4治療組；圖5B為經(jīng)化合物4治療4周的db/db小鼠饑餓血糖的變化圖，其中WT-con為正 常小鼠組，db/db-con為糖尿病小鼠組，db/db-化合物4為化合物4治療組；圖6A為化合物4和二氫小檗堿(DHBBR)治療db/db小鼠4周后腹腔注射葡萄糖 耐受(ipGTT)曲線圖；圖6B為化合物4和二氫小檗堿(DHBBR)治療db/db小鼠4周后腹腔注射葡萄糖 耐受(ipGTT)曲線下面積；圖7為經(jīng)化合物4和二氫小檗堿(DHBBR)治療db/db小鼠4周后，腹腔注射胰島 素耐量(ITT)曲線圖；圖8為經(jīng)化合物4和二氫小檗堿(DHBBR)治療4周后的db/db小鼠，其血漿中的 甘油三酯含量的變化圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不局限于此。下述制備例中，1H-NMR用 Varian Mercury AMX300 型儀器測(cè)定。MS 用 VG ZAB-HS 或VG-7070型以及Esquire 3000 plus-01005測(cè)定。所有溶劑在使用前均經(jīng)過(guò)重新蒸餾， 所使用的無(wú)水溶劑均是按標(biāo)準(zhǔn)方法干燥處理獲得。除另有說(shuō)明外，所有反應(yīng)均是在氬氣保 護(hù)下進(jìn)行并用TLC跟蹤，后處理時(shí)均經(jīng)飽和食鹽水洗和無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)程。產(chǎn)品的純化 除另有說(shuō)明外均使用硅膠的柱色譜法，所使用的硅膠為200-300目，GF254為青島海洋化工 廠或煙臺(tái)緣博硅膠公司生產(chǎn)。制備實(shí)施實(shí)例8-氧取代二氫巴馬汀的制備巴馬汀(5g，13. 2mmol，可市購(gòu)得到)溶于20%氫氧化鉀溶液(IOOmL)，在80°C攪 拌6小時(shí)，冷卻后加入二氯甲烷萃取。有機(jī)相依次用2N稀鹽酸、水、飽和食鹽水洗，然后干燥 濃縮，殘留物在二氯甲烷、甲醇中重結(jié)晶，得到黃色針狀晶體8-氧取代二氫巴馬汀(2.4g， 產(chǎn)率48% )。8-氧取代二氫巴馬汀，C21H21NO5,麗367 ；黃色針狀晶體，易溶于氯仿和丙酮。
1H NMR (300MHz, CDCl3)，δ 7. 31 (1Η, d, J = 7. 8Ηζ, Η-12)，7· 24 (1Η, d, J = 7. 8Ηζ, H-11) ,7. 20(lH，s，H-l)，6. 73 (1Η，s，Η_4)，6. 71 (1Η，s，Η—13)，4. 27(2H，t，J = 6. 3Ηζ，Η_6)， 4. 00 (3Η, s, OMe)，3. 94 (3Η, s, OMe)，3. 90 (3Η, s, OMe)，3. 89 (3H, s, OMe)，2. 93 (2H, t, J = 6. 3Hz, H-5)。8-氧取代二氫小檗堿的制備小檗堿(5g，13. 4mmol，可市購(gòu)得到)溶于20%氫氧化鉀溶液(IOOmL)，在80°C攪拌6小時(shí)，冷卻后加入二氯甲烷進(jìn)行萃取。有機(jī)相依次用2N稀鹽酸、水、飽和食鹽水洗，然 后干燥濃縮，殘留物在二氯甲烷、甲醇中重結(jié)晶，得到黃色針狀晶體8-氧取代二氫小檗堿 (2. 3g，產(chǎn)率 49% )。8-氧取代二氫小檗堿，C20H17NO5,麗351 ；黃色針狀晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR (300MHz, CDCl3)，δ 7. 32 (1Η, d, J = 8. IHz，H—12)，7· 27 (1H, d, J = 8. IHz， H-ll),7. 21 (1H, s，H-l)，6. 72 (1H, s，H_4)，6. 70 (1H, s，H_13)，6. 00 (2H, s，-OCH2O-)，4. 29 (2H, t, J = 6. 3Hz, H-6)，4· 00 (3H, s, OMe)，3. 94 (3H, s, OMe)，2. 89 (2H, t, J = 6. 3Hz, H-5)。8-氯巴馬汀的制備8-氧取代二氫巴馬汀(5g，13. 6mmol)置于氯化氧磷(IOmL)中回流2小時(shí)，冷卻后 過(guò)濾，濾餅用氯仿和乙醚洗滌，減壓干燥后得到桔紅色粉末狀固體8-氯巴馬汀(4. 3g，產(chǎn)率 75%)。此化合物無(wú)需純化，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。8-氯小檗堿的制備8-氧取代二氫小檗堿(5g，14. 2mmol)置于氯化氧磷(IOmL)中回流2小時(shí)，冷卻后 過(guò)濾，濾餅用氯仿和乙醚洗滌，減壓干燥后得到桔紅色粉末狀固體8-氯小檗堿(4. 5g，產(chǎn)率 78%)。此化合物無(wú)需純化，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。8-氯巴馬汀和8-氯小檗堿的制備參見文獻(xiàn)J. Pharm. Sci.，1979，68，705?；衔?的制備8-氯巴馬汀(lg，2. 38mmol)溶于30mL無(wú)水乙醚中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加甲基格式 試劑(3mL，3mol/mL)，反應(yīng)混合物攪拌回流30分鐘后加入2N稀鹽酸，用二氯甲烷萃取。有 機(jī)層用氨水堿化后干燥、濃縮，經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮=30 1，體積比)純化，得到黃色 粉末狀晶體化合物1 (350mg，產(chǎn)率36% )。化合物1，C23H27NO4,麗381 ；黃色粉末晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR(300MHz, CDCl3), δ 7. 10 (1Η，s，H_l)，6· 69 和 6· 58 (2Η，d，J = 7·5Ηζ，Η_11， 12)，6. 47 (1Η, s, H-4)，5. 63 (1H, s, H-13)，3. 90 (3H, s, OMe)，3. 85 (3H, s, OMe)，3. 73 (3H, s, OMe)，3. 69 (3H, s, OMe)，3. 23 (2H, m, H—6)，2. 79 (2H, m, H—5)，1. 52 (6H, s, CH3)?；衔?的制備8-氯小檗堿(lg，2. 47mmol)溶于30mL無(wú)水乙醚中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加丙基格式 試劑(3mL，3mol/mL)，反應(yīng)混合物攪拌回流30分鐘后加入2N稀鹽酸，用二氯甲烷萃取。有 機(jī)層用氨水堿化后干燥、濃縮，經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮=40 1，體積比)純化，得到黃色 粉末狀晶體化合物2 (320mg,產(chǎn)率28% )。化合物2，C26H31NO4,麗421 ；黃色粉末晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR(300MHz, CDCl3), δ 7. 11 (1Η, s, H_l)，6· 69 (1H，d, J = 8. 1Hz, H—12)， 6. 56 (1H, s, H-4)，6. 52 (1H, d, J = 8. IHz, H—ll)，5. 93 (2H, s, -OCH2O-)，5. 28 (1H, s, H-13)，3. 83 (3H, s, OMe)，3. 82 (3H, s, OMe)，3. 27 (2H, t, J = 5. 7Hz, H-6)，2. 78 (2H, t, J = 5. 7Hz, H-5)，2. 20 (2H, m, CH2)，1. 78 (2H, m, CH2)，1. 50 (2H, m, CH2)，1. 28 (2H, m, CH2)，0. 86 (6H, t, J =7. 5Hz, CH3)?；衔?的制備8-氯小檗堿(lg，2. 47mmol)溶于30mL無(wú)水乙醚中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加乙基格式 試劑(3mL，3mol/mL)，反應(yīng)混合物攪拌回流30分鐘后加入2N稀鹽酸，用二氯甲烷萃取。有 機(jī)層用氨水堿化后干燥、濃縮，經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮=40 1，體積比)純化，得到黃色 粉末狀晶體化合物3 (330mg,產(chǎn)率31 % )?；衔?，C24H27NO4,麗393 ；黃色粉末晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR (300MHz，CDCl3)，δ 7. 12 (1H，s，H—1)，6. 70 (1H，d，J = 8·1Ηζ，Η_12)， 6. 56 (1Η, s, Η-4)，6· 54 (1H, d, J = 8. IHz, Η-11)，5· 93 (2Η, s, -OCH2O-)，5. 29 (1Η, s, H-13)， 3. 80 (6Η, s, OMe)，3. 26 (2Η, t, J = 5. 4Ηζ, Η_6)，2. 79 (2Η, t, J = 5. 4Ηζ, Η_5)，2. 23 (2Η, m, CH2)，1. 84 (2Η, m, CH2), 0. 88 (6Η, t, J = 7. 5Hz, CH3)。化合物4的制備8-氯小檗堿(lg，2. 47mmol)溶于30mL無(wú)水乙醚中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加甲基格式 試劑(3mL，3mol/mL)，反應(yīng)混合物攪拌回流30分鐘后加入2N稀鹽酸，用二氯甲烷萃取。有 機(jī)層用氨水堿化后干燥、濃縮，經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮=30 1，體積比)純化，得到黃色 粉末狀晶體化合物4(350mg，產(chǎn)率36% )?；衔?，C22H23NO4,麗365 ；黃色粉末晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H 匪R (300MHz ,CDCl3)，δ 7. 13 (1H，s，H-1)，6. 72and 6. 62 (2H，d，J = 7. 5Hz，H-ll， 12)，6. 56 (1H, s, H-4)，5. 93 (2Η, s, -OCH2O-)，5. 66 (1H, s, H-13)，3. 90 (3H, s, OMe)，3. 85 (3H, s, OMe)，3. 23 (2H, m, H-6)，2. 79 (2H, m, H-5)，1. 52 (6H, s, CH3)?；衔?的制備丙二腈(0.6g，9. lmmol)溶于20mL無(wú)水四氫呋喃中，接著加入氫化鈉(0. 2g， 8. 3mmol)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下快速加入8-氯巴馬汀(1. 5g，3. 56mmol)，反應(yīng)混合物攪拌30分鐘 后加入乙醚稀釋，用二氯甲烷、水萃取。有機(jī)層干燥、濃縮，在甲醇中重結(jié)晶得到橘黃色粉末 化合物5(1. lg，產(chǎn)率63% )?；衔?，C24H21N3O4，漏:415 ；橘黃色粉末，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR (300MHz, CDCl3)，δ 7. 38 (1Η, d, J = 8. 4Hz, H-12)，7. 25 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-ll)，7. 11 (1H, s, H-1) ,6. 98 (1H, s, H-4) ,6. 74 (1H, s, H-13)，4. 44 (2H，t, J = 6.0Hz， H-5) 3. 99 (3H, s, OMe)，3. 97 (3H, s, OMe)，3. 84 (3H, s, OMe)，3. 79 (3H, s, OMe)，2. 97 (2H, t, J =6. OHz，H-6)?；衔?的制備丙二酸二乙酯(1.2mL，8. 3mmol)溶于20mL無(wú)水四氫呋喃中，接著加入氫化鈉 (0. 2g，8. 3mmol)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下快速加入8-氯巴馬汀(1. 5g，3. 56mmol)，反應(yīng)混合物攪拌 30分鐘后加入乙醚稀釋，用二氯甲烷、水萃取。有機(jī)層干燥、濃縮，在甲醇中重結(jié)晶得到暗紅 色粉末化合物6(1.05g，產(chǎn)率72% )?；衔?，C28H31NO8,漏:509 ；暗紅色粉末，易溶于氯仿和丙酮。1H 匪R (300MHz，CDCl3)，δ 7. 67 (1H，s，H—1)，7. 58 (2H，s，H—11 禾口 12)，7. 20 (1H，s, H-4), 6. 78 (1H, s, H-13)，4· 68 (2H, t, J = 6. OHz，H-5) 4. 08 (4H, m, CH2)，3. 94 (3H, s, OMe)，3. 85 (3H，s，OMe)，3. 78 (3H，s，OMe)，3. 72 (3H，s，OMe)，2. 94 (2H，t，J = 6. OHz，H-6)， 1. 09 (6H, t, J = 6. 9Hz, CH3)。化合物7的制備丙二腈(0.6g，9. lmmol)溶于20mL無(wú)水四氫呋喃中，接著加入氫化鈉(0. 2g， 8. 3mmol)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下快速加入8-氯小檗堿(1. 5g，3. 7mmol)，反應(yīng)混合物攪拌30分鐘 后加入乙醚稀釋，用二氯甲烷、水萃取。有機(jī)層干燥、濃縮，在甲醇中重結(jié)晶得到橘黃色粉末 化合物7(1. lg，產(chǎn)率63% )?；衔?，C23H17N3O4，麗399 ；橘黃色粉末，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR (300MHz, CDCl3)，δ 7. 38 (1Η, d, J = 8. 4Hz, Η-12)，7· 25 (1Η, d, J = 8. 4Hz, Η-11)，7· 11 (1Η, s, Η-1)，6· 98 (1Η, s, Η_4)，6· 74 (1Η，s, Η-13)，6· 00 (2Η, s, -OCH2O-)， 4. 44 (2Η, t, J = 6. OHz, Η_6) 3· 99 (3Η, s, OMe), 3. 97 (3Η, s, OMe), 2. 97 (2Η, t, J = 6. OHz, Η-5)?；衔?的制備丙二酸二乙酯(1.2mL，8. 3mmol)溶于20mL無(wú)水四氫呋喃中，接著加入氫化鈉 (0. 2g，8. 3mmol)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下快速加入8-氯小檗堿(1. 5g，3. 7mmol)，反應(yīng)混合物攪拌 30分鐘后加入乙醚稀釋，用二氯甲烷、水萃取。有機(jī)層干燥、濃縮，在甲醇中重結(jié)晶得到暗紅 色粉末化合物8(1.05g，產(chǎn)率72% )?；衔?，C27H27NO8,漏:493 ；暗紅色粉末，易溶于氯仿和丙酮。1H 匪R (300MHz，CDCl3)，δ 7. 67 (1H，s，H—1)，7. 58 (2H，s，H—11 禾口 12)，7. 20 (1H， s, H-4) ,6. 78 (1H, s, H-13)，6· 00 (2H, s, -OCH2O-)，4. 68 (2H, t, J = 6. OHz, H-5) 4. 08 (4H, m, CH2)，3. 94 (3H, s, OMe)，3. 78 (3H, s, OMe)，2. 94 (2H, t, J = 6. OHz, H-6)，1. 09 (6H, t, J = 6. 9Hz, CH3)?；衔?的制備8-氯小檗堿(lg，2. 47mmol)溶于30mL無(wú)水苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加無(wú)水甲胺 (0. 2mL)，反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?. 5小時(shí)后加入2N稀鹽酸，用二氯甲烷萃取。有機(jī)相用氨水 堿化后干燥、濃縮，在甲醇中重結(jié)晶得到黃色粉末狀晶體化合物9 (430mg，產(chǎn)率41% )。化合物9，C21H20N2O4,麗364 ；亮黃色粉末晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR (300MHz, CDCl3)，δ 7. 58 (1Η, d, J = 8. IHz, Η-12) ,7. 45 (1Η, d, J = 8. IHz, Η-11) ,7. 31 (1Η, s, Η-1) ,7. 10 (1Η，s, Η_4)，6· 91 (1Η, s, Η-13) ,6. 10 (2Η, s, -OCH2O-)， 4. 54 (2Η, t, J = 7. 5Ηζ, Η_6)，4. 30 (3Η, s, OMe)，4. 18 (3Η, s, OMe) ,3. 51 (3Η, s, NCH3)， 3. 15 (2Η, t, J = 7. 5Hz, H-5)?；衔?0的制備8-氯小檗堿(lg，2.47mm0l)溶于30mL無(wú)水苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加無(wú)水苯胺 (0. 2mL)，反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?. 5小時(shí)后加入2N稀鹽酸，用二氯甲烷萃取。有機(jī)相用氨水 堿化后干燥、濃縮，在甲醇中重結(jié)晶得到黃色粉末狀晶體化合物10(475mg，產(chǎn)率43% )?；衔?0，C26H22N2O4，擺:426 ；黃色粉末晶體，易溶于氯仿和丙酮。1H NMR (300MHz, CDCl3)，δ 7. 55 (1Η, d, J = 8. IHz, Η-12) ,7. 42 (1Η, d, J = 8. IHz, Η-11)，7. 37 (1Η, s, Η-1)，7. 28-7. 07 (5Η, m,苯環(huán)上 H)，7. 02 (1H, s, H-4) ,6. 91 (1H, s, H-13)，6. 08 (2H, s, -OCH2O-)，4. 44 (2H, t, J = 7. 2Hz, Η_6)，4· 22 (3Η, s, OMe), 4. 10 (3Η, s, OMe)， 2. 93 (2H, t, J = 7. 2Hz, H_5)。以上二氫小檗堿衍生物的制備例作參考，其它的二氫小檗堿衍生物也可以參照上 述方法制得。試驗(yàn)實(shí)施例試驗(yàn)實(shí)施例1 應(yīng)用L6肌肉細(xì)胞葡萄糖攝取模型，在體外初步評(píng)價(jià)本發(fā)明部分化合物對(duì)葡萄糖 吸收的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)在24孔板中完全分化的L6肌肉細(xì)胞用磷酸緩沖液洗一次后，在含有0. 2%牛 血清白蛋白(BSA)的高糖DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Media)培養(yǎng)基中饑餓2小 時(shí)，用含有5 μ M本發(fā)明的二氫小檗堿衍生物，0. 2% BSA的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育2. 5 小時(shí)。用含有5 μ M 二氫小檗堿衍生物的HBS(HEPES buffered saline)溶液洗2次后，在 5 μ M 二氫小檗堿衍生物的HBS溶液中繼續(xù)孵育0. 5小時(shí)。向HBS溶液中加入[3Η]同位素 標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖(以HBS或KRP (Krebs Ringer phosphate)溶解為濃度ImM, 5 μ Cl/ mL臨時(shí)工作液)，使其終濃度為10(^11，同位素0.511(^/1^。在37°C孵育lOmin。迅速吸去 細(xì)胞孵育液，將細(xì)胞置于冰上，用冰冷PBS迅速洗3次。在42°C烘箱內(nèi)烘干。加入200μ1 0. 1 % TritonX-100，4°C溫和振蕩45min裂解細(xì)胞。取150 μ L裂解液，加入1. ImL閃爍液 閃爍計(jì)數(shù)。取10 μ 1裂解液稀釋10倍以Bradford法測(cè)蛋白濃度。最終結(jié)果以皮摩爾/分 鐘/毫克蛋白質(zhì)表示。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)化合物溶于DMSO中，濃度5 μ M時(shí)，如果計(jì)算所得的葡萄糖攝取量比DMSO空 白對(duì)照有提高，并且兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異，則說(shuō)明該化合物有促進(jìn)葡萄糖 吸收的效應(yīng)?；钚越Y(jié)果以化合物對(duì)葡萄糖攝取量與DMSO空白對(duì)照的比值來(lái)表示。測(cè)試結(jié)果表1顯示了在L6肌肉細(xì)胞葡萄糖攝取模型中葡萄糖濃度為5. OmM時(shí)，本發(fā)明的部 分化合物在濃度5 μ M時(shí)對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)效果，其中BBR為小檗堿。表1 \j---
葡萄糖攝取倍數(shù)
編號(hào)化合物(Compounds)(化合物對(duì)葡萄糖攝取量與 如表1所示，細(xì)胞水平上篩選的結(jié)果很明顯地顯示本發(fā)明的8，8_ 二取代-13， 13a-二氫小檗堿衍生物具有促進(jìn)葡萄糖吸收的活性。本發(fā)明人進(jìn)一步選擇了 8，8_ 二甲 基-13，13a-二氫小檗堿鹽酸鹽(化合物4)作代表進(jìn)行了下列的整體動(dòng)物的藥效學(xué)試驗(yàn)。 雖然下列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)僅用8，8-二甲基-13，13a-二氫小檗堿鹽酸鹽作代表，上列細(xì)胞水平 上篩選的結(jié)果明顯地指出其它的8，8-二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物也應(yīng)該有類似的 效果。試驗(yàn)實(shí)施例2:采用高效液相色譜法研究了化合物二氫小檗堿(DHBBR)、4、8、和9在pH = 3檸檬 酸_檸檬酸鈉條件下的穩(wěn)定性。液相系統(tǒng)分析條件Waters 2695液相系統(tǒng)；色譜柱XTerra MS C8,4. 6X 150mm,5 μ m ；緩沖鹽的制備0. 025mol/L的磷酸二氫鉀溶液[取磷酸二氫鉀3. 405g，加水IOOOmL, 用lmol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0士0. 1，即得；流動(dòng)相梯度洗脫，O到20min，流動(dòng) 相從緩沖鹽-乙腈(70 30，體積比)到緩沖鹽-乙腈(30 70，體積比)；流速LOmL/ min，檢測(cè)波長(zhǎng)375nm ；濃度0. 5mg/mL ；進(jìn)樣體積20uL，柱溫30度。先用乙腈分別溶解樣品二氫小檗堿(0冊(cè)8幻、4、8、和9，再加入少量？!13.0檸檬 酸_檸檬酸鈉緩沖液，避光放置6小時(shí)后，測(cè)定化合物的含量。 從上述化合物二氫小檗堿(DHBBR)、4、8、和9在pH = 3檸檬酸-檸檬酸鈉條件下 的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物在酸性條件下，結(jié)構(gòu) 更穩(wěn)定，不易氧化成小檗堿。試驗(yàn)實(shí)施例3:采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究了小檗堿、二氫小檗堿(DHBBR)和8，8_ 二甲基小 檗堿(化合物4)在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度。給藥方案大鼠靜脈給藥健康SD大鼠12只，雌雄各半，體重200 250g，隨機(jī)分成三組， 每組4只，給藥前禁食12h，自由飲水。其中一組以20mg/kg的劑量經(jīng)大鼠尾靜脈注射給 予小檗堿，第二組以20mg/kg的劑量經(jīng)大鼠尾靜脈注射給予二氫小檗堿，第三組以20mg/kg 的劑量經(jīng)大鼠尾靜脈注射給予8，8- 二甲基二氫小檗堿(給藥容積均為10mL/kg)，于給藥 后0. 083,0. 167,0. 50，1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,6. 0,8,12和24h經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢取靜脈血 0. 3mL,置肝素化試管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，分離血漿，_20°C保存待測(cè)。大鼠灌胃給藥健康SD大鼠12只，雌雄各半，體重200 250g，隨機(jī)分成三組，每 組4只，給藥前禁食12h，自由飲水。其中一組以20mg/kg的劑量灌胃給予小檗堿，第二組 以20mg/kg的劑量灌胃給予二氫小檗堿，第三組以20mg/kg的劑量經(jīng)大鼠尾靜脈注射給予 8，8- 二甲基二氫小檗堿(給藥容積均為10mL/kg)，于給藥前和給藥后0. 25，0. 5，1. 0,2. 0， 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,8. 0，12和24h經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢取靜脈血0. 3mL,置肝素化試管中， 3000rpm離心lOmin，分離血漿，_20°C保存待測(cè)。結(jié)論按 AUC0_t(Area under the concentration,血藥濃度-時(shí)間曲線下面積。)計(jì)算， 大鼠灌胃給予小檗堿、二氫小檗堿和8，8_ 二甲基二氫小檗堿后，絕對(duì)生物利用度分別為0， 2. 65%和38.5%。因此，說(shuō)明8，8_ 二甲基二氫小檗堿的口服吸收效果大大強(qiáng)于小檗堿、二
氫小檗堿。
試驗(yàn)實(shí)施例4:評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物的體內(nèi)抗糖尿病和抗肥胖活性。實(shí)驗(yàn)步驟1.高脂食物誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖小鼠DIO模型采用正常的雄性C57BL/6J小鼠(6周齡)，經(jīng)高脂食物(Rodent diet with60 kcal% fat (Research diets, Inc))喂養(yǎng)8周形成明顯的胰島素抵抗癥狀，對(duì)葡萄糖耐受 能力明顯下降。取造模成功的小鼠用于化合物藥效學(xué)評(píng)價(jià)。用0.5%的甲基纖維素將化合 物4配成均勻的懸液，每天灌胃給藥(劑量為15mg/kg/day)。每天記錄體重增長(zhǎng)和進(jìn)食情 況。治療4周后，饑餓6小時(shí)，從尾靜脈取血測(cè)定基礎(chǔ)血糖值(0分鐘)，然后根據(jù)體重給予 腹腔注射葡萄糖2g/kg，分別在15、30、60、90和120分鐘測(cè)定血糖值，并計(jì)算其曲線下面積 AUC0待動(dòng)物狀態(tài)恢復(fù)后，饑餓6小時(shí)，根據(jù)體重腹腔注射胰島素0. 75U/kg，分別在15、30、 60、90分鐘測(cè)定血糖值，做胰島素耐量測(cè)試(ITT)曲線。治療結(jié)束后，取內(nèi)臟脂肪和肝臟組 織稱重，并測(cè)定其甘油三酯含量。2.糖尿病db/db小鼠模型db/db小鼠從Jackson Laboratory引進(jìn)，8周齡后血糖顯著升高，根據(jù)體重和血 糖值隨機(jī)分組，用于化合物藥效學(xué)評(píng)價(jià)。用0. 5%的甲基纖維素將化合物4和二氫小檗堿 (DHBBR)配成均勻的懸液，每天灌胃給藥(化合物4和二氫小檗堿的劑量均為50mg/kg/ day)。每周測(cè)餐后血糖和饑餓血糖(饑餓6小時(shí))各一次。治療4周后，動(dòng)物饑餓6小時(shí)， 從尾靜脈取血測(cè)定基礎(chǔ)血糖值(0分鐘)，然后根據(jù)體重給予腹腔注射葡萄糖1. 5g/kg，分別 在15、30、60、90和120分鐘測(cè)定血糖值，并計(jì)算其曲線下面積AUC。待動(dòng)物狀態(tài)恢復(fù)后，饑 餓6小時(shí)，根據(jù)體重腹腔注射胰島素lU/kg，分別在15、30、60、90、120分鐘測(cè)定血糖值，做 ITT曲線。治療結(jié)束后，取內(nèi)臟脂肪和肝臟組織稱重，并測(cè)定其甘油三酯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.化合物4對(duì)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖(DIO)小鼠的慢性治療療效治療4周后，通過(guò)腹腔注射給予2g/kg的葡萄糖，如圖1所示，治療組血糖升高較 肥胖對(duì)照組少且血糖恢復(fù)較快，兩者血糖在90分鐘時(shí)存在顯著差異。治療組血糖曲線下面 積也顯著小于對(duì)照組(*，P < 0. 05)。說(shuō)明經(jīng)化合物4治療肥胖小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力 明顯改善。胰島素耐量試驗(yàn)表明(圖2)，治療組給予胰島素后血糖較肥胖對(duì)照組下降的更 為顯著(*，P < 0. 05)，說(shuō)明化合物4能增強(qiáng)DIO小鼠的胰島素敏感性。經(jīng)化合物4治療后的小鼠，DIO其體重增加明顯小于對(duì)照組，呈負(fù)增長(zhǎng)。且皮下脂 肪在體重中的比例與對(duì)照組相比呈顯著性下降(如圖3所示)(*，P < 0. 05)。說(shuō)明本發(fā)明 的化合物具有抵抗小鼠由高脂食物誘導(dǎo)的體重增長(zhǎng)和脂肪堆積趨勢(shì)，具有潛在的治療肥胖 療效。如圖4A、4B和4C所示，經(jīng)化合物4慢性治療4周后的小鼠，其血漿中的胰島 素(HF-con vs HF-化合物 4，1. 66士0. 22ng/ml vs 0. 92士0. 05ng/ml)和甘油三酯 TG 含量(HF-con vs HF-化合物 4，0. 79士0. 04mmol/l vs 0. 59士0. 04mmol/l)都明顯下 降。另外肝臟中的甘油三酯含量(HF-con vs HF-化合物4，24. 85 士4.50 μ mol/g vs 15. 93士 1.45ymol/g)也明顯下降(*，P < 0. 05 ；#，P < 0.01)。說(shuō)明化合物4在改善胰 島素抵抗和降脂方面有較好的效果。
2.化合物4對(duì)糖尿病db/db小鼠的慢性治療療效經(jīng)化合物4治療后的糖尿病db/db小鼠，其餐后血糖(db/db-con vs db/db-化 合物 4，27. 8士 1. 8mM vs 17. 1 士 1. 6mM)和饑餓血糖(db/db-con vs db/db-化合物 4， 29. 5士 1. 4mM vs 19. 6士 1. 6mM)較溶劑對(duì)照組都呈現(xiàn)極顯著下降趨勢(shì)(*#，P<0. 001)(圖 5A和5B)，且能夠明顯改善糖尿病db/db小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力和胰島素敏感性。圖6 所示，治療組的糖耐量曲線下面積較對(duì)照組和同劑量二氫小檗堿(DHBBR)治療組都顯著下 降(*，P < 0. 05)，胰島素耐量(ITT)曲線顯示(圖 7，*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01 ；***，P < 0.001)給藥組的胰島素敏感性極顯著增強(qiáng)。經(jīng)化合物4慢性治療后，db/db小鼠基礎(chǔ)血漿內(nèi)甘油三酯TG含量(db/db-con vs db/db-化合物 4，1. 32士0. Immo 1/1 vs 0. 82士0. 07mmol/l)明顯下降(圖 8 所示，***，P <0. 001)，且比同劑量DHBBR治療組下降更明顯。說(shuō)明化合物4具有較好的降脂效果，且活 性比DHBBR更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論在高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖小鼠DIO模型上，化合物4具有明顯療效改善 糖耐量和胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素敏感性；減輕肥胖并緩解脂肪肝。在糖尿病db/db小鼠模 型上，化合物4具有明顯的降糖效果，改善糖耐量、增強(qiáng)胰島素敏感性，并顯著改善糖尿病 小鼠的高脂紊亂癥狀。
權(quán)利要求
如下通式(1)、(2)或(3)所示的8，8-二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受的鹽其中，R1、R2各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R1、R2連接成為-O-CH2-O-；R3為C1-C4烷基；R4、R5各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R4、R5連接成為-O-CH2-O-；其中，R1、R2各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R1、R2連接成為-O-CH2-O-；R3為CN或COOR6，R6為C1-C4烷基；R4、R5各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R4、R5連接成為-O-CH2-O-；其中，R1、R2各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R1、R2連接成為-O-CH2-O-；R3為C1-C4烷基、C1-C4酰氧基或芳香基；R4、R5各自獨(dú)立地為H、OH、C1-C4烷氧基或C1-C4酰氧基，或R4、R5連接成為-O-CH2-O-。F2009100496881C0000011.tif,F2009100496881C0000012.tif,F2009100496881C0000021.tif
2.如權(quán)利要求1所述的8，8-二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受的 鹽，其特征在于，在通式⑴中R1^R2各自獨(dú)立地為H或C1-C2烷氧基，或禮、R2連接成為-O-CH2-O-； R3為C1-C3燒基；R4> R5各自獨(dú)立地為C1-C2烷氧基； 在通式⑵中R1^R2各自獨(dú)立地為H或C1-C2烷氧基，或禮、R2連接成為-O-CH2-O-；R3 為 CN 或 COOR6, R6 為 C1-C2 烷基；R4> R5各自獨(dú)立地為C1-C2烷氧基；在通式⑶中R1^R2各自獨(dú)立地為H或C1-C2烷氧基，或禮、R2連接成為-O-CH2-O-；R3為C1-C2烷基或苯基；R4、R5各自獨(dú)立地為C1-C2烷氧基。
3.如權(quán)利要求1所述的8，8-二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受 的鹽，其特征在于，所述的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物選自以下所示的化合物 1 10中
4.一種用于治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于， 該組合物包含治療有效劑量的權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的8，8- 二取代-13，13a- 二氫 小檗堿衍生物或其生理上可接受的鹽。
5.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的8，8-二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物或其生理 上可接受的鹽在制備用于治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其并發(fā)癥的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的8，8-二取代-13，13a- 二氫小檗堿 衍生物選自以下所示的化合物1 10中
7. 一種治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其并發(fā)癥的方法，該治療方法包括向病人給 予治療有效量的權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的8，8- 二取代-13，13a- 二氫小檗堿衍生物 或其生理上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類具有如下通式所示結(jié)構(gòu)的8，8-二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物或其生理上可接受的鹽、其用途以及包括該衍生物的藥物組合物。所述8，8-二取代-13，13a-二氫小檗堿衍生物對(duì)肌肉細(xì)胞有促進(jìn)葡萄糖吸收的作用，整體動(dòng)物試驗(yàn)表明該類化合物具有改善糖耐量和胰島素抵抗、減輕肥胖、緩解脂肪肝等功效，且生物利用度高，增強(qiáng)了體內(nèi)的藥效，同時(shí)在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該類化合物可用于治療2型糖尿病、肥胖癥、脂肪肝或其并發(fā)癥。
文檔編號(hào)C07D455/03GK101870694SQ200910049688
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者吳芳, 李佳, 李靜雅, 程哲, 章涵堃, 胡立宏, 陳安豐 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所