專利名稱：檢測Asial型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測口蹄疫病毒的試劑盒及其制備方法，特別是用于檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒和制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫是一種重大動(dòng)物疫病，世界各國對該病的檢驗(yàn)檢疫、預(yù)防控制都十分重視。目前檢測、診斷口蹄疫的主要方法是檢測發(fā)病或帶毒動(dòng)物體內(nèi)的口蹄疫病毒及其抗體水平，如分離病毒方法。分離病毒是對口蹄疫的最可靠的診斷，但較長的周期會(huì)延誤對該烈性傳染病的最佳控制時(shí)間；此類實(shí)驗(yàn)方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因此，研制直接檢測口蹄疫病毒抗原的快速、便捷、適合現(xiàn)場使用的檢測試劑盒不僅有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，而且對我國口蹄疫的防控具有重要意義。
我國于2005年突發(fā)大面積的Asia1型口蹄疫，疫情波及十幾個(gè)省市，給我國的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。此次暴發(fā)不僅持續(xù)時(shí)間長，而且疫情復(fù)雜。此次暴發(fā)警示我們要及早開發(fā)研究便捷、快速、敏感、特異的快速診斷試劑以及研制快速診斷試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，以及這種檢測盒的制備方法。
本發(fā)明的試劑盒中包括a.可與待測樣品結(jié)合的固體支持物，b.包被于可與待測樣品結(jié)合的固體支持物上的Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體，c.作為二抗的用Asia1型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的多克隆抗體，d.用酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG，e.標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，f.標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，g.血清稀釋液，h.底物稀釋液，i.30％H2O2，j.無色底物，
k.終止液。
或者本發(fā)明的檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒包括a.可與待測樣品結(jié)合的固體支持物，b.包被于可與待測樣品結(jié)合的固體支持物上的Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體，c.作為二抗的用Asia1型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的并用酶標(biāo)記的多克隆抗體，d.標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，e.標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，f.血清稀釋液，g.底物稀釋液，h.3％H2O2，i.無色底物，j.終止液。
另外，也可在檢測盒中再配備25×濃縮PBST洗液和移液槽，以方便使用。
本發(fā)明的檢測盒中的固體支持物為最少四孔的酶標(biāo)板，所用的無色底物為鄰苯二胺，所用的終止液是2摩爾的硫酸，所用的酶為辣根過氧化物酶。本發(fā)明的檢測盒使用中所用的洗滌液為磷酸緩沖液，可由用戶自行配制。
本發(fā)明的檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒的制備方法是首先制備Asia1型口蹄疫病毒的單抗和多抗單抗制備過程以Asia1型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asia1型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1。將VP1插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，再用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株。將前述菌體超聲破碎后除雜蛋白，用層析法得到純化表達(dá)的融合蛋白，將融合蛋白與等體積佐劑充分混勻，給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，其中第一次免疫用的佐劑為完全弗氏佐劑，第二次免疫所用佐劑為不完全弗氏佐劑，第三次免疫不用佐劑，免疫后的3～4天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞進(jìn)行分散處理，然后按體積比1∶30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比5～10∶1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比1∶2加入濃度為50％的聚乙二醇PEG4000，再靜置1～2分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的25～35倍的HAT培養(yǎng)液，再將融合細(xì)胞按100μl/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100μl用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，得到抗Asia1型口蹄疫病毒抗體陽性、滴度高的雜交瘤細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株，再用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述所得到的雜交瘤細(xì)胞株，大量生產(chǎn)單克隆抗體。
或者采用另一種方法制備，這種制備方法的前步驟與前述方法基本相同，但在后期大量生產(chǎn)單克隆抗體時(shí)是采用小鼠體內(nèi)誘生法，即先用Asia1型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asia1型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1，再將VP1插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，再用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，將菌體超聲破碎后除雜蛋白，用層析法得到純化表達(dá)的重組蛋白，將重組蛋白與等體積佐劑充分混勻，給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，其中第一次免疫用的佐劑為完全弗氏佐劑，第二次免疫所用佐劑為不完全弗氏佐劑，第三次免疫不用佐劑，免疫后的3～4天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞進(jìn)行分散處理，然后按體積比1∶30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，將所得到的雜交瘤細(xì)胞注入經(jīng)降植烷處理的雌性小鼠腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成分，取其上清液用硫酸銨沉淀和凝膠層析法純化，得到抗Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體。
由前述方法所得抗Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體可采用硫酸銨沉淀和凝膠層析法進(jìn)行純化。
多抗制備過程選取體重為500g以上健康、營養(yǎng)良好的豚鼠為免疫對象進(jìn)行免疫，主要免疫程序分為兩部分來實(shí)現(xiàn)，(1)基礎(chǔ)免疫，即首先進(jìn)行用10-6病毒懸液在豚鼠蹠部皮內(nèi)穿刺3-4針，皮下注射0.1ml；第二次用10-4病毒液穿刺3-4針，皮下注射0.1ml，第三次用10-2病毒液穿刺3針，皮下注射0.2ml，每次間隔1周，直至豚鼠發(fā)病痊愈后再進(jìn)行高免。(2)高免，用10-1病毒液免疫豚鼠，發(fā)病后取其蹠部上皮組織，稱重研磨后用pH7.4 0.04mol/L的磷酸緩沖液制成1∶10(重量體積比)懸液，4℃過夜浸毒，3500rpm離心15min，取上清為免疫原。將此抗原與不完全弗氏佐劑1∶1體積進(jìn)行乳化，用該抗原對經(jīng)基礎(chǔ)免疫的豚鼠進(jìn)行高免2-3次，每次間隔10天，于后肢股內(nèi)側(cè)肌內(nèi)接種，劑量分別為0.6、0.8和1.2ml/次。在最后一次免疫15天時(shí)，心臟采血分離血清，56℃水浴滅活30min，冷卻后加硫柳汞防腐待用。
然后按下述程序制備ELISA檢測盒a.在可與待測樣品結(jié)合的固體支持物的每孔加100μl(滴度為1∶100)包被抗體；b.將5mg辣根過氧化物酶溶解于0.5ml的1.25％的戊二醛中，加入100mol/L磷酸鈉緩沖液，使體系的pH為6.8，置室溫18小時(shí)；c.選用直徑為100μm，排阻極限為20 000-50 000的分離介質(zhì)，按介質(zhì)說明制備5ml的分離柱，用0.15mol/L NaCl溶液過10個(gè)柱床體積后，經(jīng)處理的辣根過氧化物酶中加入20μl甘油和1％二甲苯藍(lán)20μl，上柱分離，用0.15mol/LNaCl洗脫，收集棕色部分；d.用超濾或透析濃縮樣品至10mg/mL；e.在每升0.15毫摩爾的氯化鈉水溶液中加入5毫克的Asia1型口蹄疫病毒免疫豚鼠，再將得到的并用酶標(biāo)記的多克隆抗體0.1ml加于酶溶液中，將體系的pH值調(diào)整到9.0～9.6，再在4℃放置24小時(shí)，再在其中加入濃度為0.2mol/L，pH7.0的乙醇胺0.1ml；f.用分子篩桿分離純化的酶標(biāo)記抗體，并封裝于塑料瓶或玻璃瓶內(nèi)；g.用塑料瓶或玻璃瓶分別封裝30％的過氧化氫水溶液和2摩爾的硫酸，用黑色紙或塑料袋包裝鄰苯二胺。
本發(fā)明的檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒可以迅速及時(shí)的檢測出動(dòng)物是否患有Asia1型口蹄疫疾病，其檢測過程及制備過程簡單，采用本發(fā)明的檢測盒可以快速確定疫情，本發(fā)明為我國口蹄疫的防控提供重要的技術(shù)支撐。
具體實(shí)施例方式
一、單抗的制備(1)用RNeasy Mini Kit(Qiagen)試劑盒從Asia1型口蹄疫病毒(注該毒株保藏于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室)中提取的總mRNA為模板，用針對Asia1型VP1的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，獲得Asia1型口蹄疫病毒VP1基因。在本發(fā)明中所用的引物為上游引物5′-CCGGAATTCGCTTACCAGTGGATGCTCG-3′下游引物5-′CCCAAGCTTCGCTAGCTTGAGCAGGTC-3′采用通常方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建含有重組克隆載體的大腸桿菌菌株，用瓊脂糖平板(amp+)及藍(lán)白斑篩選陽性克隆，挑取白斑克隆進(jìn)行擴(kuò)增。用PCR、酶切以及序列分析鑒定陽性克隆，采用雙酶切從鑒定為陽性的克隆上切下目的基因，以分子生物學(xué)通常采用的方法回收酶切目的基因片段，將獲得的目的基因定向插入表達(dá)載體pPROEX HTb，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)構(gòu)建重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，采用細(xì)菌涂板(Kan+抗性)篩選陽性克隆。經(jīng)PCR、酶切和序列分析等方法鑒定為陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)。當(dāng)重組表達(dá)菌生長至對數(shù)中期A550＝0.5-1.0時(shí)，通常A550＝0.6時(shí)，用終濃度為1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)6小時(shí)后收獲表達(dá)菌，8000rpm離心10min收集沉淀，棄上清。按每克重加5ml20mM/L Tris緩沖液(pH8.0)懸浮菌體后，超聲破碎菌體，12000rpm離心15分鐘后留沉淀?xiàng)壣锨?，用包涵體洗滌緩沖液(1M Tris pH8.0，0.5M EDTApH8.0，3M NaCl，0.5％Triton X-100)充分洗滌后，12000rpm離心30min以去除雜蛋白，重復(fù)4-5次。用8M尿素緩沖液(0.5M NaCl，0.02M Tris，8M尿素，pH8.0)懸浮沉淀，用親和層析法(Ni-NTA His)純化表達(dá)的重組蛋白，獲得的重組蛋白用紫外分光光度計(jì)測定含量后-20℃凍存。
(2)制備免疫脾細(xì)胞取前述的純化Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)的重組抗原與等體積佐劑充分混勻，分別注入健康小鼠頸背部兩側(cè)、腹股溝部皮下；每只每次注射的病毒劑量為20～80μg抗原，間隔2～4周后，用同樣的方法再次重復(fù)注入至少1次；第一次免疫用的佐劑為完全弗氏佐劑、第二次免疫所用佐劑改為不完全弗氏佐劑、第三次免疫不用佐劑，佐劑與抗原的比例為1∶1(體積比)最后一次免疫后2周，測小鼠血清中的抗口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原的抗體滴度，將顯示有足夠抗體滴度的小鼠作為免疫脾細(xì)胞的來源。
測定抗體滴度的方法，可用放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定法等，本發(fā)明中采用通常的ELISA法。
(3)制備骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞通常使用從小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0細(xì)胞系。在進(jìn)行細(xì)胞融合前，將其在加有10％胎牛血清的DMEM(100u/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素)的常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4天，以便在融合時(shí)可以得到2×107或更多的融合細(xì)胞。本發(fā)明通常選用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞。
(4)細(xì)胞融合將20～80μg前述所得的純化Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原向已按步驟(2)的方式免疫接種的小鼠腹腔接種免疫，并且在免疫后的3～4天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞。分散脾細(xì)胞，然后按體積比1∶30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀。將上述(3)培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞瘤SP2/0離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀。用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比(5～10)∶1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比1∶2加入濃度為50％的聚乙二醇PEG4000，再靜置1～2分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的25～35倍的HAT培養(yǎng)液，所用的HAT溶液為次黃嘌呤10-6～10-3M，氨基喋呤10-8～10-7M，胸苷10-6～10-4M，懸浮融合細(xì)胞，最后補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液至沉淀物體積的140～160倍。再將融合細(xì)胞按100μl/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100μl用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞(約1～2×105個(gè)/孔)。將上述培養(yǎng)孔置于濃度為3～7％的CO2培養(yǎng)箱中，在溫度為35～38℃條件下培養(yǎng)10～14小時(shí)，從第3天開始，每隔2～3大用每孔半量HAT培養(yǎng)液換液體一次。
當(dāng)觀察培養(yǎng)孔中出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落時(shí)，先取培養(yǎng)上清液，然后再在每孔加半量HAT培養(yǎng)液。再用ELISA檢測抗Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原的抗體及滴度。當(dāng)檢測表明其與對照相比有明顯的升高時(shí)即視為合格。
將上述抗Asia1型口蹄疫病毒抗體陽性、滴度高的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株?？梢酝ㄟ^一種經(jīng)有限稀釋該雜交瘤細(xì)胞使每一孔中只含有一個(gè)單一雜交瘤細(xì)胞的方法，或一種從軟瓊脂培養(yǎng)基中分離集落的軟瓊脂方法，或一種采用顯微操作器，挑取單一雜交瘤細(xì)胞的方法，或一種采用細(xì)胞分選儀分離單一的雜交瘤細(xì)胞的“分選儀克隆”方法。
(5)制備單克隆抗體用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述(4)中得到的雜交瘤細(xì)胞株。大量生產(chǎn)單克隆抗體，可采用大轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法，或同系小鼠體內(nèi)誘生法。其中大轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法可通過培養(yǎng)上述(3)雜交瘤細(xì)胞純化得到抗口蹄疫病毒單克隆抗體。同系鼠(本發(fā)明用Balb/c小鼠)體內(nèi)誘生法可通過將上述(3)得到的產(chǎn)生抗口蹄疫病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞(5×105～106)注入經(jīng)降植烷處理的雌性小鼠(4～8周齡)腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成分，其上清液即含有抗Asia1型口蹄疫病毒單克隆抗體。如果需要進(jìn)一步純化，可采用硫酸銨沉淀和凝膠層析法純化。
將抗Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原的單克隆抗體分別與包被Asia1、O、A和C型口蹄疫病毒抗原進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果顯示具有高度的血清型特異性，不與其它血清型發(fā)生交叉反應(yīng)，可用以制備檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA檢測試劑盒。
二、多抗的制備選取體重為500g以上健康、營養(yǎng)良好的豚鼠為免疫對象進(jìn)行免疫，主要免疫程序分為兩部分來實(shí)現(xiàn)，(1)基礎(chǔ)免疫，即首先進(jìn)行用10-6病毒懸液在豚鼠蹠部皮內(nèi)穿刺3-4針，皮下注射0.1ml；第二次用10-4病毒液穿刺3-4針，皮下注射0.1ml，第三次用10-2病毒液穿刺3針，皮下注射02.ml，每次間隔1周，直至豚鼠發(fā)病痊愈后在進(jìn)行高免。(2)高免，用10-1病毒液免疫豚鼠，發(fā)病后取其蹠部上皮組織，稱重研磨后用pH7.4 0.04mol/L的磷酸緩沖液制成1∶10(重量體積比)懸液，4℃過夜浸毒，3500rpm離心15min，取上清為免疫原。將此抗原與不完全弗式佐劑1∶1體積進(jìn)行乳化，用該抗原對經(jīng)基礎(chǔ)免疫的豚鼠進(jìn)行高免2-3次，每次間隔10天，于后肢股內(nèi)側(cè)肌內(nèi)接種，劑量分別為0.6、0.8和1.2ml/次。在最后一次免疫達(dá)15天時(shí)，心臟采血分離血清，56℃水浴滅活30min，冷卻后加硫柳汞防腐待用。
三、檢測Asia1型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒的制備(1)用PBST(pH7.4；NaCl，8.0g；KCl，0.2g；MgCl2·6H2O，0.1g；KH2PO4，0.2g；Na2HPO4，1.14g；CaCl2·2H2O，0.1g；Tween-20 0.5ml，用蒸餾水定容1000ml)將保存的單抗稀釋成效價(jià)為1∶320，按每孔50μl劑量加入96孔ELISA檢測板，輕輕振蕩混勻后置于4℃過夜或37℃2小時(shí)。
(2)用pH7.4的PBST洗滌(1)所述96孔ELISA檢測板4次，每次5min。
(3)向(2)述96孔ELISA檢測板加入含終濃度為1g/L牛血清白蛋白的PBST，37℃1小時(shí)。
(4)重復(fù)(2)，拍干液體，裝入96孔ELISA檢測板專用包裝袋，用封口機(jī)封口后4℃保存。
(5)用PBST(pH7.4)將酶標(biāo)豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗稀釋成事先已經(jīng)確定的濃度(1∶100)，或沒有標(biāo)記的豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗稀釋成事先已經(jīng)確定的濃度(1∶100)。
(6)25×PBST配制(pH7.4；NaCl，100.0g；KCl，5.0g；MgCl2·6H2O，2.5g；KH2PO4，5.0g；Na2HPO4，28.5g；CaCl2·2H2O，2.5g；Tween-20 12.5ml，用蒸餾水定容1000ml)(7)血清稀釋液制備用(1)所述0.01M PBS中加入5％脫脂奶粉(W/V)。
(8)底物稀釋液配制檸檬酸(含一分子水)5.11g，Na2HPO4，7.3g，溶解于900ml無離子水中，調(diào)整pH為5.0后定容至1000ml。
(9)試劑盒的組裝，試劑盒含96孔ELISA檢測板1塊，酶標(biāo)豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗(0.5ml/支)1支，沒有標(biāo)記的豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗(0.5ml/支)1支，酶標(biāo)兔抗豚鼠血清(0.5ml/支)1支，30％H2O2(5ml/支)1支，2M H2SO4(10ml/支)1支，酶底物1片，底物稀釋液一瓶50ml。內(nèi)包裝用泡沫盒(內(nèi)加干冰保證低溫運(yùn)輸)，外包裝用外帶標(biāo)簽的紙盒。附操作手冊一份。
或是此種組裝，即試劑盒含96孔ELISA檢測板1塊，酶標(biāo)豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗(0.5ml/支)1支，30％H2O2(5ml/支)1支，2M H2SO4(10ml/支)1支，酶底物1片，底物稀釋液一瓶50ml。內(nèi)包裝用泡沫盒(內(nèi)加干冰保證低溫運(yùn)輸)，外包裝用外帶標(biāo)簽的紙盒。附操作手冊一份。
本發(fā)明建議經(jīng)用分子篩柱分離純化標(biāo)記抗體采用1.5mlEppendorf管保存，每支裝0.5ml；用高密度聚乙烯塑料管封裝30％的過氧化氫水溶液1支(5ml/支)；用紙包裝1片鄰苯二胺；同樣用高密度聚乙烯塑料管封裝2摩爾的硫酸1支(10ml/支)?？紤]到本檢測盒使用中所需用的清洗液(即磷酸緩沖液)較多，在盒內(nèi)不再帶有清洗液，而由使用者自行配制。或者再在本發(fā)明的檢測試劑盒中增加25×濃縮洗液25ml/瓶，移液槽3個(gè)，以方便使用。
四、敏感性實(shí)驗(yàn)與特異性實(shí)驗(yàn)通過對已知樣品的檢測以確定該試劑盒的敏感性，通過對與其他血清型口蹄疫病毒以及相似病病原如水泡病病毒等的檢測以確定該試劑盒的特異性。
檢測時(shí)第1～3組加50μl Asia1型口蹄疫病毒抗原；第4組加50μl O型口蹄疫病毒抗原；第5組加50μl A型口蹄疫病毒抗原；第6組加C型口蹄疫病毒抗原；第7組加豬水泡病病毒抗原；第8組稀釋液對照；第9組為空白對照；第10組為Asia1型口蹄疫細(xì)胞毒滅活抗原陽性對照。其相應(yīng)的檢測結(jié)果見表1與表2。
表1不同包被濃度時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注釋表1中，第1組包被單抗的濃度分別為1∶5(A)、1∶10(B)、1∶20(C)和1∶40(D)；第2組包被濃度依次為1∶80(A)、1∶160(B)、1∶320(C)和1∶640(D)；第3組包被濃度為1∶128(A)、1∶256(B)、1∶512(C)和1∶1024(D)，4～10組的包被濃度與第一列的相同。
表2相同包被濃度時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注釋表2中A～D行包被單抗的濃度分別為1∶5、1∶10、1∶20和1∶40。檢測時(shí)第1列加50μl Asia1型口蹄疫病毒抗原；第2列加50μl O型口蹄疫病毒抗原；第3列加50μl A型口蹄疫病毒抗原；第4列加C型口蹄疫病毒抗原；第5列加豬水泡病病毒抗原；第6列稀釋液對照；第7列為空白對照；第8-9列的A和B孔為Asia1型口蹄疫細(xì)胞毒滅活抗原陽性對照，第8-9列的C和D孔為O型細(xì)胞毒滅活抗原。
結(jié)果提示陰陽性對照成立，針對Asia1單克隆抗體定型ELISA試劑盒具有高特異性不與口蹄疫病毒其他血清型抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的單抗針對Asia1型口蹄疫病毒，在1∶160滴度時(shí)具有高的特異性，與口蹄疫病毒其他血清型不發(fā)生交叉反應(yīng)；當(dāng)?shù)味仍龈吆蠹锤哂?∶512時(shí)與O型有交叉反應(yīng)，但不是很強(qiáng)；而與口蹄疫病毒A型和C型以及豬水泡病病毒沒有交叉反應(yīng)，陰陽性對照都成立，這說明本發(fā)明的ELISA試劑盒具有很高的特異性。
五、本發(fā)明的試劑盒使用方法如下(1)在檢測盒包被有抗體的檢測孔中加入50μl待檢樣品，如病畜的水泡液，輕微振蕩混勻后37℃作用1小時(shí)。
(2)洗滌用PBST洗滌四次，每次5分鐘。
(3)加入50μl二抗，37℃作用1小時(shí)。
(4)洗滌用PBST洗滌四次，每次5分鐘。
(5)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG，37℃作用1小時(shí)。
(6)洗滌用PBST洗滌四次，每次5分鐘。
(7)顯色加50μl酶底物OPD，37℃顯色15分鐘，用2M H2SO4終止反應(yīng)。
(8)于490nm讀取吸收值(A值)。
(9)最少需要4孔作為對照，即強(qiáng)陽性、弱陽性、陰性以及空白對照。
(10)結(jié)果解釋檢測結(jié)果與陰性及空白對照相比較有明顯的差異即可判定為陽性。
權(quán)利要求
1.一種檢測Asial型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，其特征在于試劑盒中包括a.可與待測樣品結(jié)合的固體支持物，b.包被于可與待測樣品結(jié)合的固體支持物上的Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體，c.作為二抗的用Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的多克隆抗體，d.用酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG，e.30％H2O2，f.無色底物，g.終止液。
2.一種檢測Asial型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，其特征在于試劑盒中包括a.可與待測樣品結(jié)合的固體支持物，b.包被于可與待測樣品結(jié)合的固體支持物上的Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體，c.作為二抗的用Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的并用酶標(biāo)記的多克隆抗體，d.30％H2O2，e.無色底物，g.終止液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測Asial型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，其特征在于其中的固體支持物為最少四孔的酶標(biāo)板，所用的無色底物為鄰苯二胺，所用的終止液是2摩爾的硫酸，所用的酶為辣根過氧化物酶，所用的洗滌液為磷酸緩沖液。
4.權(quán)利要求3所述的任一檢測Asial型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒的制備方法，首先制備Asial型口蹄疫病毒的單抗和多抗，其特征是a.在酶標(biāo)板的每孔加入50μl滴度為1∶320包被抗體；b.將5mg辣根過氧化物酶溶解于0.5ml的1.25％的戊二醛中，加入100mol/L磷酸鈉緩沖液，使體系的pH為6.8，置室溫18小時(shí)；c.選用直徑為100μm，排阻極限為20,000-50,000的分離介質(zhì)，按介質(zhì)說明制備5ml的分離柱，用0.15mol/LNaCl溶液過10個(gè)柱床體積后，經(jīng)處理的辣根過氧化物酶中加入20μl甘油和1％二甲苯藍(lán)20μl，上柱分離，用0.15mol/LNaCl洗脫，收集棕色部分；d.用超濾或透析濃縮樣品至10mg/ml；e.在每升0.15毫摩爾的氯化鈉水溶液中加入5毫克的Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠，再將得到的并用酶標(biāo)記的多克隆抗體0.1ml加于酶溶液中，將體系的pH值調(diào)整到9.0～9.6，再在4℃放置24小時(shí)，再在其中加入pH 7.0濃度為0.2mol/L的乙醇胺0.1ml；f.用分子篩柱分離純化的酶標(biāo)記抗體，并封裝于塑料瓶或玻璃瓶內(nèi)；g.用塑料瓶或玻璃瓶分別封裝3％的過氧化氫水溶液和2摩爾的硫酸，用紙或塑料包裝鄰苯二胺。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于檢測Asial型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，它包括可與待測樣品結(jié)合的固體支持物、包被于可與待測樣品結(jié)合的固體支持物上的Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體、作為二抗的用Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的多克隆抗體，及用酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG、標(biāo)準(zhǔn)血清、無色底物、和終止液；本發(fā)明還公開了這種試劑盒的制備方法。
文檔編號G01N33/569GK101082626SQ20071012617
公開日2007年12月5日 申請日期2007年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日
發(fā)明者邵軍軍, 林彤, ?；菔|, 周廣青, 獨(dú)軍政, 叢國正, 李克生, 杜惠芬, 謝慶閣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所