專利名稱：：用于診斷nsclc的gitr抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于人的癌癥和相關(guān)惡性腫瘤的治療、診斷和篩選方法的纟且合物和方法。背景盡管在醫(yī)學(xué)研究中取得了眾多的進步，但癌癥在美國仍然是第二大死亡原因。在工業(yè)化國家，大致5個人中有一個將死于癌癥。臨床護理的傳統(tǒng)模式，例如手術(shù)切除、放療和化療，具有相當高的失敗率，尤其是對于實體瘤。失敗的發(fā)生是因為初始的腫瘤是無應(yīng)答性的，或因為由于在原始位置上的再生長和/或轉(zhuǎn)移而引起的復(fù)發(fā)。肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，并且是男性中的第二大癌癥死亡原因。參見,AmericanCancerSociety,Cancerfactsandfigures,1996，Atlanta。在1997年i會斷了大約178，100例肺癌新病例，占癌癥診斷的13%。在1997年發(fā)生了據(jù)估計的160，400例由于肺癌而造成的死亡，占所有癌癥死亡的29%，這使肺癌比乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌的總和更為致命。Jemal，A.等人(2004)CancerStatistics2004，CA:ACancerJournalforClinicians53:5—26。肺癌的一年存活率已從1973年的32%增加至1993年的41%,這主要歸因于手術(shù)技術(shù)的提高。所有階段一起的5年存活率只有14%。對于當疾病仍然限定在局部時檢測出的病例，存活率為48%,但只有15%的肺癌能如此早地被發(fā)現(xiàn)。在肺癌的各種形式中，非小細胞肺癌(NSCLC)占每年所有新肺癌病例的大約80%。小細胞肺癌是肺癌中最惡性和生長最快的形式。原發(fā)性腫瘤通常對化療具有應(yīng)答性，但接下來是廣泛的轉(zhuǎn)移。診斷時的平均存活時間為大約l年，5年存活率為5%。對于診斷為NSCLC的患者，手術(shù)切除提供了有意義的存活的唯一機會。有5種類型的非小細胞肺癌鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、腺鱗癌和未分化癌。腺鱗癌始于在顯微鏡觀察下時看起來扁平的細胞。未分化的癌細胞看上去與正常細胞不一樣且不可控制地增殖。鱗狀細胞癌是最常見的肺癌類型。其從襯在氣道里的細胞發(fā)生而來。腺癌從產(chǎn)生粘液(痰)的腺細胞或分泌細胞發(fā)生而來。如此命名大細胞肺癌是因為在顯微鏡下觀察這些細胞時其看起來巨大且為圓形。非小細胞肺癌的特征還在于四個臨床階段。I期是是非常局部化的癌癥，在淋巴結(jié)中無癌癥。II期癌癥已擴散至在受影響的肺的上部的淋巴結(jié)。III期癌癥已擴散至癌癥開始的部位的附近。其可以是胸壁，肺的遮蓋物(胸膜)、胸的中部(縱隔)或其他淋巴結(jié)。IV期癌癥已擴散至身體的另外部位。正在開發(fā)幾種抗體療法以治療肺癌。西妥昔單抗和吉非替尼(gifUinib)經(jīng)美國食品與藥品管理局批準用于這些癌癥。西妥昔單抗與化療的組合已為NSCLC患者提供了一些益處但仍需要進一步的試驗。Kelly,K.等人(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:644。因此，仍需要NSCLC的有效治療方法。本發(fā)明滿足了這一需要，并且還提供了相關(guān)的優(yōu)點。本發(fā)明的公開內(nèi)容本發(fā)明提供了方法，其用于幫助細胞狀況的診斷，用于鑒定和/或區(qū)分正常細胞和贅生性細胞，以及用于鑒定在受試者中可逆轉(zhuǎn)瘤形成和/或改善與贅生性細胞存在相關(guān)的癥狀的潛在治療劑。因此，本發(fā)明的實施方案旨在通過篩選表1中鑒定的差異表達的基因的存在來診斷細胞狀況的方法。在一個方面，所述基因的差異表達是上皮來源的細胞的贅生性狀態(tài)例如非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌的指示?？赏ㄟ^任何合適的方法來檢測表達，包括例如，通過檢測從所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量或者通過轉(zhuǎn)錄自所述基因的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的cDNA的量或者由所述基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的量?？赏ㄟ^抽樣原則(samplebasis)對樣品施行這些方法，或可修改這些方法以進行高通量分析。此外，可就轉(zhuǎn)錄物或所表達的基因產(chǎn)物的存在和量來檢索和分析數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包含一定量的(quantitative)從細胞樣品分離的完整或部分的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明的另一個方面是篩選，以鑒定逆轉(zhuǎn)或治療瘤形成和腫瘤的治療劑，其中所述細胞和/或腫瘤的特征在于表1中鑒定的多肽或蛋白質(zhì)的差異表達。所述方法包括將先前鑒定為具有該基因型的細胞與有效量的潛在試劑接觸，并檢定贅生性狀況的逆轉(zhuǎn)。還提供了編碼表1中所示的蛋白質(zhì)、其片段或多肽(此處也稱為基因表達產(chǎn)物)的多核苷酸，包含這些多核苷酸的基因遞送載體，和包含這些多核普酸的宿主細胞。所述蛋白質(zhì)、多肽或其片段也可用于產(chǎn)生特異性地識別和結(jié)合這些分子的抗體。所述抗體可以是多克隆的或單克隆的。這些抗體可用于分離從編碼所述多肽的基因表達出的蛋白質(zhì)或多肽，以及用于檢測贅生性細胞或腫瘤。本發(fā)明還提供了分離的宿主細胞和重組宿主細胞，其包含編碼表1中所鑒定的肽和/或其片段的多核苷酸。所述細胞可以是原核的或真核的，并且僅作為例子，可以是細菌、酵母、動物、哺乳動物、人的細胞和其特定亞型例如干細胞、抗原呈遞細胞(APC)如樹突狀細胞(DC)或T細胞中的任何一種或多種。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*網(wǎng)址=ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/1ist.cgi本發(fā)明還提供了用于監(jiān)控受試者中的癌癥的方法，其通過在不同是否已增加或減少，有此來監(jiān)控受試者中的癌癥。此處還提供了用于診斷方法或藥物篩選的試劑盒。所述試劑盒包含至少一種檢測基因表達的試劑(例如，探針、引物或抗體)和使用說明書。序列表概述如此處所用的，術(shù)語"GITR基因"至少是指連續(xù)多核苷酸序列的ORF,其編碼具有此處所示的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。LocusLink(見上)報導(dǎo)了，由該基因編碼的蛋白質(zhì)是TNF受體超家族的成員。已報導(dǎo)該受體在T-細胞激活時具有增加的表達，并且其被認為在由CD25(+)CD4(+)調(diào)控性T細胞所維持的顯性免疫自身耐受性(dominantimmunologicalself-tolerance)中起著至關(guān)重要的作用。小鼠的基因敲除研究也表明，該受體的作用在于調(diào)控CD3驅(qū)動的T-細胞激活和程序性細胞死亡。已報導(dǎo)了該基因的三種經(jīng)可選擇地剪接的轉(zhuǎn)錄物變體，其編碼不同的同種型。SEQIDNO:1是GITR多核苷酸序列的一個實例，其他序列在本領(lǐng)域是已知的，其實例包括但不限于表l中所示的序列和編碼此處定義的GITR基因表達產(chǎn)物的序列。生物學(xué)上等同的序列也包括在該定義的范圍之內(nèi)，所述序列例如是編碼SEQIDNO:2的多肽的序列和與示例性序列如SEQIDNO:1具有至少90%或可選擇地至少95%序列同源性的序列，這可通過在缺省參數(shù)下進行的同一性百分比序列分析來確定。通過在高嚴緊條件下與負鏈雜交的能力而鑒定的生物學(xué)上等同的基因或多核苷酸也在本定義范圍內(nèi)?？梢韵Ｍ褂梅侨嘶颍涠嗪塑账嵝蛄性诒绢I(lǐng)域中是已知的。參見例如，UniGeneClusterHs.212680。多核苷酸片段在本領(lǐng)域中也是已知的，其包括但不限于GenBank登錄號BI911657.1;AI499936.1;AI214481.1;和AI923712.1。這些多核苷酸作為探針或引物是特別有用的。如此處所用的，術(shù)語"GITR基因表達產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或多肽，'包括SEQIDNO:2的氨基酸序列以及從上面鑒定的GITR基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的氨基酸序列，而不考慮基因表達系統(tǒng)，例如細菌或其他原核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞如猿、?；蛉思毎Ｔ撔g(shù)語包括從組織樣品中分離出的、分離的、天然發(fā)生的多肽，以及重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽。該術(shù)語也包括具有與SEQIDNO:2至少90%或可選擇地至少95%同源的氨基酸序列并且具有此處描述的生物學(xué)活性的多肽。同源氨基酸序列的實例包括，但不限于，具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽或者已通過保守性氨基酸置換進行修飾的其他GITR基因表達產(chǎn)物。用于實施本發(fā)明的模式在整個本公開內(nèi)容中，通過鑒別性引證(identifyingcitation)參考了多種出版物、專利和公開的專利說明書。在本公開內(nèi)容中引用這些出版物、專利和7>開的專利^兌明書的《地描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的狀態(tài)定義除非另外指出，本發(fā)明的實施將采用免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)和重組DM的常規(guī)技術(shù)，所述技術(shù)在本領(lǐng)域的技能范圍之內(nèi)。參見，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第2版(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人，編者，(1987));叢書METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor,編者(1995))，Harlow和Lane，編者(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUALandANIMALCEIXCULTURE(R.I.Freshney，，編者(1987))。如此處所用的，某些術(shù)語具有下面定義的含義。如在本說明書和權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文另外清楚地規(guī)定。例如，術(shù)語"acell"包括多個細胞，包括其混合物。所有數(shù)字標稱，例如，pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括范圍，都是按0.1的增量(+)或(-)變化的近似值。要理解，盡管并未總是明確地提及，但所有數(shù)字標稱前面均冠以術(shù)語"大約"。也要理解，盡管并未總是明確地提及，但此處描述的試劑只是示例性的，并且這些試劑的等同物在本領(lǐng)域中是已知的。術(shù)語"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互換使用，并且是指任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合物形式。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)和可行使任何已知或未知的功能。下列是多核苷酸的非限制性實例基因或基因片段(例如，探針、引物、EST或SAGE標簽)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分枝的多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可在聚合物裝配之前或之后對核苷酸結(jié)構(gòu)進行修飾?？捎梅呛塑账峤M分中斷核苷酸的序列。在聚合后，可通過例如與標記組分相綴合來進一步修飾多核苷酸。該術(shù)語也指雙鏈和單鏈分子。除非另外具體說明或要求，為多核苷酸的本發(fā)明的任何實施方案包括雙鏈形式和已知或預(yù)測組成雙鏈形式的兩個互補單鏈形式中的每一個單鏈形式。多核苷酸由4種核苷酸堿基的特定序列組成，所述4種核苷酸堿基是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T);當多核苷酸是RM時尿嘧啶(U)代替鳥嘌呤。因此，術(shù)語"多核苷酸序列"是多核苷酸分子的字母排列表示?？蓪⒃撟帜概帕斜硎据斎朐诰哂兄醒胩幚韱挝坏挠嬎銠C中的數(shù)據(jù)庫中，并用于生物信息學(xué)應(yīng)用例如功能基因組和同源性搜索。"基因"是指包含至少一個能夠在被轉(zhuǎn)錄和翻譯后編碼特定多肽或蛋白質(zhì)的開放閱讀框架(0RF)的多核苷酸。此處描述的多核苷酸序列中的任一序列可用于鑒定與它們所關(guān)聯(lián)的基因的更大片段或全長編碼序列。分離更大的片段序列的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。"基因產(chǎn)物，，或可選擇地"基因表達產(chǎn)物"是指當基因被轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生的氨基酸(例如，肽或多肽)。術(shù)語"多肽"可與術(shù)語"蛋白質(zhì)"互換使用，其在最廣的意義上是指兩個或更多個亞單位氨基酸、氨基酸類似物或肽模擬物(peptidomimetic)的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另一個實施方案中，所述亞單位可通過其他鍵例如酯鍵、醚鍵等連接。如此處所用的，術(shù)語"氨基酸"是指天然和/或非天然或者合成的氨基酸，(包括甘氨酸以及D和L旋光異構(gòu)體)、氨基酸類似物和肽模擬物。如果肽鏈短，則通常將三個或更多個氨基酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈長，則通常將所述肽稱為多肽或蛋白質(zhì)。"在轉(zhuǎn)錄控制之下"是在本領(lǐng)域中充分理解的術(shù)語，其表示多核苷酸序列(通常為DNA序列)的轉(zhuǎn)錄依賴于其有效地連接至促成轉(zhuǎn)錄啟始或促進轉(zhuǎn)錄的元件。"有效連接的"是指其中所述元件處于允許它們發(fā)揮功能的排列中的并置。如此處所用的，術(shù)語"包含"或"包括"旨在表示，所述組合物和方法包括所陳述的要素，但不排除其他要素。"基本上由......組成"，當用于定義組合物和方法時，將表示不包括對于該組合具有任何實質(zhì)性意義的其他要素。因此，基本上由此處定義的要素組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的痕量污染物以及藥學(xué)上可接受的栽體例如磷酸緩沖鹽溶液、防腐劑等。"由……組成"將表示不包括除微量元素外的其他成分和用于施用本發(fā)明組合物的重要方法步驟。由這些過渡式術(shù)語(transitionterm)中的每一個術(shù)語所定義的實施方案在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語"分離的"是指與細胞和其他方面的組分相分開，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段通常天然地與其結(jié)合。在本發(fā)明的一個方面，分離的多核苷酸與3'和5'連續(xù)核苷酸分開，所述分離的多核苷酸在其天生或天然環(huán)境例如在染色體上通常與所述3'和5'連續(xù)核普酸相連接。正如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，非天然發(fā)生的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要"分離"從而將其與其天然發(fā)生的對應(yīng)物(counterpart)區(qū)分開。此外，"濃縮的"、"分開的"或"稀釋的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段可與其天然發(fā)生的對應(yīng)物區(qū)分開，其中每體積的分子濃度或數(shù)目比其天然發(fā)生的情況高("濃縮的")或低("分開的")。與天然發(fā)生的對應(yīng)物的差異在于其一級序列或例如在于其糖基化模式的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要以其分離的形式存在，因為其可通過其一級序列或可選擇地通過另一個特征例如糖基化模式與其天然發(fā)生的對應(yīng)物區(qū)分開。因此，提供了非天然發(fā)生的多核苷酸，作為與分離的天然發(fā)生的多核苷酸相區(qū)別開的實施方案。提供了在細菌細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，作為與從其中天然地產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的真核細胞中分離出的天然發(fā)生的蛋白質(zhì)相區(qū)別開的實施方案。如此處所用的，"基因遞送"、"基因轉(zhuǎn)移"等是這樣的術(shù)語，其指將外源多核苷酸(有時稱為"轉(zhuǎn)基因")導(dǎo)入宿主細胞中，而不管釆用何種用于導(dǎo)入的方法。這些方法包括多種熟知的技術(shù)例如載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(通過例如病毒感染/轉(zhuǎn)染或者各種其他基于蛋白質(zhì)或基于脂質(zhì)的基因遞送復(fù)合物)以及有助于"棵露的"多核苷酸的遞送的技術(shù)(例如電穿孔、"基因槍"遞送和各種用于導(dǎo)入多核苷酸的其他技術(shù))。導(dǎo)入的多核苷酸可以穩(wěn)定地或短暫地保持在宿主細胞中。穩(wěn)定的保持通常要求，所導(dǎo)入的多核苷酸包含可與宿主細胞相容的復(fù)制起點，或者整合入宿主細胞的復(fù)制子例如染色體外復(fù)制子(例如質(zhì)粒)或者細胞核或線粒體染色體中。在本領(lǐng)域已知許多載體能夠介導(dǎo)基因至哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)移。"基因遞送載體"定義為可攜帶所插入的多核苷酸進入宿主細胞中的任何分子。基因遞送載體的實例是脂質(zhì)體，生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；重組酵母細胞，金屬顆粒；以及細菌或病毒，例如桿狀病毒，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，噬菌體，粘粒，質(zhì)粒，真菌載體和通常用于本領(lǐng)域的其他重組載體，所述重組載體已被描述在多種真核和原核宿主中進行表達，并可用于基因療法以及用于簡單的蛋白質(zhì)表達。"病毒載體"定義為重組產(chǎn)生的病毒或病毒顆粒，其包含以體內(nèi)、離體或體外的方式被遞送入宿主細胞的多核苷酸。病毒載體的實例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、甲病毒載體等。曱病毒載體，例如基于塞姆利基森林病毒的栽體和基于新培斯病毒的載體，也已^f皮開發(fā)用于基因療法和免疫療法。參見，Schlesinger和Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439;和Ying等人(1999)Nat.Med.5(7):823-827。在其中基因轉(zhuǎn)移由逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方面，載體構(gòu)建體是指包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或其部分和治療基因的多核苷酸。如此處所用的，"逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移"或"逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，，具有相同的意思，并且是指這樣的方法，即通過該方法，依靠病毒進入細胞并將其基因組整合入宿主基因組中而將基因或核酸序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移入宿主細胞中。病毒可通過其正常的感染機制進入宿主細胞，或被改造以使其可結(jié)合不同的宿主細胞表面受體或配體以進入所述細胞。如此處所用的，"逆轉(zhuǎn)錄病毒載體"是指能夠通過病毒或病毒樣進入機制將外源核酸導(dǎo)入細胞的病毒顆粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒以RNA的形式攜帶其遺傳信息；然而，一旦這種病毒感染細胞，所述RNA就被逆轉(zhuǎn)錄成DNA形式，該DNA整合入被感染的細胞的基因組DNA中。所述經(jīng)整合的DNA形式稱為原病毒。在其中基因轉(zhuǎn)移由DM病毒載體例如腺病毒(Ad)或腺伴隨病毒(AAV)介導(dǎo)的方面，載體構(gòu)建體是指包含病毒基因組或其部分和轉(zhuǎn)基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是經(jīng)相對充分地表征的、同源的一組病毒，包括超過50種的血清型。參見例如WO95/27071。Ad容易生長并且不要求整合入宿主細胞基因組中。還已構(gòu)建了來源于重組Ad的載體，特別是減少野生型病毒的重組和增殖的潛能的那些載體。參見例如，WO95/00655和WO95/11984。野生型AAV以高傳染性和特異性整合入宿主細胞的基因組中。參見，Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470;Lebkowski等人(198S)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。包含啟動子和可將多核苷酸有效連接至其中的克隆位點的載體在本領(lǐng)域中是熟知的。這樣的載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，并且可從諸如Stratagene(LaJolla，CA)和PromegaBiotech(Madison,WI)的來源商購獲得。為了優(yōu)化表達和/或體外轉(zhuǎn)錄，可能必需除去、添加或改變克隆的5'和/或3'非翻譯部分以消除額外的、潛在的、不合適達的其他序列?？蛇x擇地，可在緊接起始密碼子的5'插入共有核糖體結(jié)合位點以增強表達?；蜻f送載體還包括幾種非病毒載體，包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物、重組酵母細胞和被耙向的病毒蛋白-DM復(fù)合物。還包含靶向性抗體或其片段的脂質(zhì)體可用于本發(fā)明的方法。為了增加向細胞的遞送，可將本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)綴合至結(jié)合細胞表面抗原例如TCR、CD3或CD4的抗體或其結(jié)合性片段。"探針，，，當在多核苷酸操作的情況下使用時，是指寡核苷酸，其以試劑形式提供從而通過與靶雜交來檢測可能存在于目的樣品中的靶。通常，探針可包含標記或手段，通過該手段可在雜交反應(yīng)之前或之后附著標記。合適的標記包括，但不限于，放射性同位素、熒光色素、化學(xué)發(fā)光化合物、染料和蛋白(包括酶)。"引物，，是通常具有游離的3'-0H基團的短多核苷酸，其通過與靶雜交而結(jié)合可能存在于目的樣品中的靶或"模板"，然后，促進與靶互補的多核苷酸的聚合。"聚合酶鏈式反應(yīng)"("PCR")是這樣的反應(yīng)，在該反應(yīng)中，使用由"上游"和"下游"引物組成的"引物對"或"引物組"以及聚合作用的催化劑例如DM聚合酶(通常為熱穩(wěn)定的聚合酶)來制備靶多核普酸的復(fù)制拷貝。用于PCR的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且在例如"PCR:APRACTICALAPPROACH"(M.MacPherson等人，IRLPressatOxfordUniversityPress(1991))中進行了教導(dǎo)。產(chǎn)生多核苷酸的復(fù)制拷貝的所有過程，例如，PCR或基因克隆，在此處統(tǒng)稱為"復(fù)制"。也可將引物用作雜交反應(yīng)例如Southern或Northern印跡分析中的探針。Sambrook等人，見上。表述"數(shù)據(jù)庫"是指代表了序列集合的一組存儲的數(shù)據(jù)，所述序列集合反過來代表了生物學(xué)參考材料的集合。術(shù)語"cDNA"是指互補DNA，其是用酶例如逆轉(zhuǎn)錄酶制備成cDNA的存在于細胞或生物體中的mRNA分子。"cDNA文庫"是存在于細胞或生物體中的所有mRM分子的集合，用逆轉(zhuǎn)錄酶這種酶將所有mRNA都轉(zhuǎn)變成cDNA分子，然后插入"載體"(在加入外源DNA后可繼續(xù)復(fù)制的其他DNA分子)中。用于文庫的示例性載體包括噬菌體，即感染細菌的病毒，例如A噬菌體。然后可就特定cDNA(從而mRM)來探測文庫。如此處所用的，"表達"是指通過其將多核普酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程和/或通過其隨后將轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。如果所述多核苷酸來源于基因組DM,那么表達可包括在真核細胞中mRNA的剪接。當用于基因時，"差異表達的"，是指從所述基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的mRM或者由所述基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的差異產(chǎn)生。與正?；?qū)φ占毎谋磉_水平相比，差異表達的基因可以過表達或低表達。然而，如此處所用的，過表達是比在正?；蚪】祵?yīng)細胞或組織中檢測到的表達高至少1.25倍，或可選擇地，至少1.5倍，或可選擇地，至少2倍的表達。術(shù)語"差異表達的"還指在細胞或組織中的核苷酸序列，其在所述細胞或組織中表達而在對照細胞中沉默，或者其在所述細胞或組織中不表達而在對照細胞中表達。如此處所用的，"固相支持物"或"固體支持物"(可互換使用)不限于特定類型的支持物。相反地，許多支持物是可獲得的并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。固相支持物包括硅膠、樹脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料小珠、氧化鋁凝膠、微陣列和芯片。如此處所用的，"固體支持物"還包括合成的抗原呈遞基質(zhì)、細胞和脂質(zhì)體?？苫谙胍慕K端用途和各種方案的適宜性來選擇合適的固相支持物。例如，對于肽合成，固相支持物可以是樹脂例如聚苯乙烯(例:i口,獲自BachemInc.，PeninsulaLaboratories的PAM—樹月旨，等等)、P0LYHIPE⑧樹脂(獲自Aminotech，Canada)、聚酰胺樹脂(獲自PeninsulaLaboratories)、接枝有聚乙二醇的聚苯乙烯樹脂(TentaGe1⑧、RappPolymere，Tubingen,Germany)或聚二甲基丙蹄酰胺樹脂(獲自Milligen/Biosearch，California)。還可將多核苷酸附著至固相支持物以用于高通量篩選測定法。例如PCTW097/10365公開了高密度寡核苷酸芯片的構(gòu)建。也可參見，美國專利5,405,783、5，412，087和5，445，934。4吏用這些方法，可在也稱為芯片陣列的衍生化玻璃表面上合成探針。將光保護的核苷亞磷酰胺偶聯(lián)至玻璃表面，通過使用光刻掩模進行的光解而選擇性地去保護，然后將其與第二種受保護的核苷亞磷酰胺反應(yīng)。重復(fù)該偶聯(lián)/去保護過程直至完成想要的探針。"雜交"是指這樣的反應(yīng)，在該反應(yīng)中一個或多個多核苷酸反應(yīng)，從而形成通過核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵而穩(wěn)定化的復(fù)合物。所述氬鍵可按照Watson-Crick堿基酉己對、Hoogstein結(jié)合或以任何其他序列特異性方式產(chǎn)生。所述復(fù)合物可包含形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成多鏈復(fù)合物的三條或更多條鏈，單條自雜交鏈，或這些的任何組合。雜交反應(yīng)可構(gòu)成更復(fù)雜的過程例如PCR反應(yīng)的起始或由核酶進行的多核苷酸的酶促切割中的一個步驟?？稍诓煌?嚴緊度"條件下進行雜交反應(yīng)。一般地，在大約40。C下在10xSSC中或在具有相同的離子強度/溫度的溶液中進行低嚴緊度雜交反應(yīng)。通常，在大約50'C下在6xSSC中進行中等嚴緊度雜交反應(yīng)，和在大約60'C下在1xSSC中進行高嚴緊度雜交反應(yīng)。當雜交在兩條單鏈多核苷酸之間以反向平行構(gòu)型發(fā)生時，所述反應(yīng)稱為"退火，，，這些多核苷酸被描述為"互補的"。如果可在第一多核苷酸的鏈中的一條鏈與第二多核苷酸的鏈中的一條鏈之間發(fā)生雜交，那么雙鏈多核苷酸對于另一多核苷酸可以是"互補的"或"同源的"。"互補性"或"同源性"(一個多核苷酸與另一個多核苷酸互補的程度)是可根據(jù)在相對鏈中的預(yù)期按照普遍接受的堿基配對法則相互之間形成氫鍵的堿基的比例來定量的。多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或者多肽或多肽區(qū)域)與另一序列具有一定百分比(例如，80%、85%、90%或95%)的"序列同一性"是表示，當進行比對時，在比較兩個序列中相同堿基(或氨基酸)的百分比。可使用本領(lǐng)域中已知的軟件程序，例如在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人，編者，1987)補遺30，7.7.18節(jié)，表7.7.1中所描述的那些，來進行比對和確定同源性或序列同一性百分比。優(yōu)選地，使用缺省參數(shù)進行比對。優(yōu)選的比對程序是使用缺省參數(shù)的BLAST。特別地，優(yōu)選的程序是BLASTN和BLASTP，使用下列缺省參數(shù)遺傳密碼-標準；過濾器(filter)=無；鏈=兩條；截止值(cutoff)=60;預(yù)期值-10;矩陣(Matrix)=BL0SUM62;種類(Descriptions)=50個序列排序依據(jù)(sortby)=高得分；數(shù)據(jù)庫=非冗余的)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR?？稍谙麓?J因特網(wǎng)地址中找到這些程序的詳細內(nèi)容www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。過度增生是受控制的細胞增殖的形式，其涉及組織或器官中的細胞數(shù)目的增加，而無結(jié)構(gòu)或功能的顯著改變。組織轉(zhuǎn)化(metaplasia)是一種受控制的細胞生長形式，其中一種類型的完全分化的細胞替代另一種類型的分化的細胞。組織轉(zhuǎn)化可在上皮或結(jié)締組織細胞中發(fā)生。非典型組織轉(zhuǎn)化涉及有些無序地組織轉(zhuǎn)化的上皮。如此處所用的，術(shù)語"贅生性細胞"、"瘤形成"、"腫瘤"、"腫瘤細胞"、"癌癥"和"癌細胞"(可互換使用)是指這樣的細胞，所述細胞展現(xiàn)出相對自主的生長，從而它們展現(xiàn)出特征在于細胞增殖的控制明顯喪失的異常生長表型(即，失去調(diào)控的細胞分裂)。贅生性細胞可以是惡性的或良性的。轉(zhuǎn)移性的細胞或組織是表示，所述細胞可侵入和破壞相鄰的身體結(jié)構(gòu)。"抑制"肺瘤生長表示當與無治療干預(yù)的生長相比時被減弱的生長狀態(tài)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法來評估腫瘤細胞生長，所述方法包括，但不限于，測量腫瘤大小、使用3H-胸苷整合測定法來確定肺瘤細胞是否正在增殖或計數(shù)腫瘤細胞。"抑制"腫瘤細胞生長是指下列狀態(tài)的任何狀態(tài)或所有狀態(tài)減慢、延遲或停止腫瘤生長以及腫瘤收縮。術(shù)語"抗原，，在本領(lǐng)域已得到明確的理解，其包括具有免疫原性的物質(zhì)。如此處所用的，該術(shù)語還包括引起免疫學(xué)的無應(yīng)答性或無反應(yīng)性的物質(zhì)。"先天的"或"天然的"或"野生型"抗原是包含表位且已從天然生物來源中分離的多肽、蛋白質(zhì)或片段。其還可特異性地結(jié)合抗原受體。如此處所用的，"抗體"包括整個抗體或其任何抗原結(jié)合片段或單鏈。因此，術(shù)語"抗體"包括包含這樣的分子的任何蛋白質(zhì)或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分。這些的實例包括，但不限于，重鏈或輕鏈或其配體結(jié)合部分的互補性決定區(qū)(CDR)、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、構(gòu)架區(qū)(FR)或其任何部分、或者結(jié)合蛋白的至少一個部分，上述內(nèi)容的任一種可整合入本發(fā)明的抗體中?？贵w可以是多克隆的或單克隆的，并且可從任何合適的生物來源例如鼠類、大鼠、綿羊和犬中分離。在下文中說明了其他來源。術(shù)語"抗體"還希望包括其消化片段、特定的部分、衍生物和變體，其中包括抗體模擬物或包括模擬抗體或其特定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體和其片段。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"所包括的結(jié)合片段的實例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；F(ab02片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；由VH和CH結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature341:544-546);和分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法通過合成的連接體將它們連接起來，所述連接體使得它們能夠被制成為單個的蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)進行配對從而形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883。單鏈抗體也被希望包括在術(shù)語"抗體的片段"中。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來獲得上述抗體片段中的任一種，并以與對于完整抗體相同的方法就結(jié)合特異性和中和活性來篩選所述片段。術(shù)語"表位"是指能夠特異性地結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面群例如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于對前者但非對后者的結(jié)合在變性溶劑存在的情況下喪失。術(shù)語"抗體衍生物"希望包括這樣的分子，即所述分子結(jié)合上面定義的表位的分子，并且為本發(fā)明的天然單克隆抗體的修飾物或衍生物。衍生物包括，但不限于，例如雙特異性、多特異性、異種特異性、三特異性、四特異性、多特異性的抗體、雙抗體、嵌合抗體、重組抗體和人源化抗體。術(shù)語"雙特異性分子"希望包括具有兩種不同的結(jié)合特異性的任何試劑，例如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物。術(shù)語"多特異性分子"或"異種特異性分子"希望包括具有多于兩種不同的結(jié)合特異性的任何試劑，例如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物。術(shù)語"異種抗體"是指連接在一起的兩種或更多種抗體，其抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab)、衍生物，或抗原結(jié)合區(qū)，其中的至少兩種具有不同的特異性。如此處所用的，術(shù)語"人抗體"希望包括具有來源于人種系的免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機誘變或定點誘變或者通過體內(nèi)體細胞突變而導(dǎo)入的突變)。然而，此處所用的術(shù)語"人抗體"不希望包括這樣的抗體，即在該抗體中，來源于另一種哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已被移植至人的構(gòu)架序列上。因此，如此處所用的，術(shù)語"人抗體"是指這樣的抗體，即在所述抗體中蛋白質(zhì)的基本上每一個部分(例如，CDR、構(gòu)架、ChCH結(jié)構(gòu)域(例如，CH1、CH2、CH3)、鉸鏈、(Vl、vj)在人中基本上是非免疫原性的，其中只有少數(shù)序列改變或變化。類似地，抗體所指定的靈長類動物(猴、狒狒、黑猩猩等)、嚙齒動物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、侖鼠等)和其他哺乳動物指定了這樣的種、亞屬、屬、亞科、科特異性抗體。此外，嵌合抗體包括上述抗體的任何組合。相對于未修飾的抗體，這些改變或變化任選地和優(yōu)選地保持或減少了在人或其他物種中的免疫原性。因此，人抗體與嵌合抗體或人源化抗體不同。要指出的是，可通過能夠表達功能性重排的人免疫球蛋白(例如，重外，當人抗體是單鏈抗體時，其可包含未在天然的人抗體中發(fā)現(xiàn)的連接體肽。例如，F(xiàn)v可包含連接體肽，例如2個或大約8個甘氨酸或其他氨基酸殘基，其連接重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)。這樣的連接體肽被認為是人來源的。如此處所用的，如果使用人免疫球蛋白序列，例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫，而從一系統(tǒng)中獲得人抗體，那么所述人抗體"來源于"特定的種系序列。照此，可通過將人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較來鑒定"來源于，，人種系免疫球蛋白序列的人抗體。編碼的氨基酸序列具有至少90%的同一性，并且包含當與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠類種系序列)相比時將所述人抗體鑒定為人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體可在氨基酸序列方面與由種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列具有至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99°/。的同一性。一般地，來源于特定人種系序列的人抗體將展現(xiàn)出與由人種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列相比不超過IO個氨基酸的差異。在某些情況下，人抗體可展現(xiàn)出與由種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列相比不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。如此處所用的，術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物，，是指具有單種分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物展現(xiàn)出對于特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。"人單克隆抗體"是指展現(xiàn)出單一結(jié)合特異性、具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。術(shù)語"重組人抗體，，，如此處所用的，包括通過重組方法制備、表達、形成或分離的所有人抗體，例如從動物(例如，小鼠)(其對于人免疫球蛋白基因來說是轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)染色體的(transchromosomal))或由其制備的雜交瘤分離的抗體，從經(jīng)轉(zhuǎn)化從而表達抗體的宿主細胞例如從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，從重組的、組合的人抗體文庫中分離的抗體，以及通過牽涉將人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法而制備、表達、形成或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，這樣的重組人抗體可接受體外誘變(或者，當使用對于人Ig序列來說轉(zhuǎn)基因的動物時，體內(nèi)體細胞誘變)，從而所述重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，即所述序列雖然來源于人種系VH和VL序列并與之相關(guān)，伹在體內(nèi)可能并不是天然地存在于人抗體種系庫中。如此處所用的，"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如，IgM或IgGl)。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的非人動物"是指具有包含一個或多個人重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(整合入或非整合入動物的天然基因組DNA中)的基因組并且能夠表達完全人抗體的非人動物。例如，轉(zhuǎn)基因大鼠可具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，這樣所述大鼠產(chǎn)生人抗INF-ot抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可整合入大鼠的染色體DNA中，或者人重鏈轉(zhuǎn)基因可以以染色體外的方式保持。轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體的動物能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生對于aV的人單克隆抗體的多種同種型(例如，IgG、IgA和/或IgE)。"組合物"還希望包括活性劑和另一種載體的組合，所述載體例如為惰性(例如，可檢測的試劑或標記)或活性的化合物或組合物，例如佐劑、稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂溶劑、防腐劑、佐劑等。載體還包括藥物賦形劑和添加劑，蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物(例如，糖，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生的糖例如糖醇、酪糖酸、酯化的糖等；和多糖或糖聚合物)，所述物質(zhì)可單獨地或組合地存在，包含1-99.99%(按重量或體積計)的單獨或組合的這些物質(zhì)。示例性的蛋白質(zhì)賦形劑包括血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。還可在緩沖容量中起作用的代表性氨基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物賦形劑也希望在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其實例包括但不限于單糖例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。術(shù)語"載體，，還包括緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑；一般地，緩沖劑是從有機酸或堿制備的鹽。代表性的緩沖劑包括有機酸鹽例如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或酞酸的鹽；Tris，鹽酸氨丁三醇(tromethaminehydrochloride)，或磷酸鹽緩沖劑。其他栽體包括聚合物賦形劑/添加劑例如聚乙烯吡咯烷酮、菲克(聚合糖)、葡聚糖結(jié)合劑(例如，環(huán)糊精，例如2-羥丙基-.正交(quadrature).-環(huán)糊精)、聚乙二醇、調(diào)味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如，聚山梨酯例如"TWEEN20"和"TWEEN80")、脂質(zhì)(例如，磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如，膽固醇)和螯合劑(例如，EDTA)。如此處所用的，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"包括標準的藥物載體中的任一種，例如磷酸緩沖鹽溶液、水和乳濁液如油/水或水/油型乳濁液，以及各種類型的濕潤劑。組合物還可包含穩(wěn)定劑和防腐劑以及任何上面指出的載體，附加條件是它們對于體內(nèi)使用來說是可接受的。載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實例，參見MartinREMINGTON'SPHARM.SCI.第15版(MackPubl.Co.,Easton(1975)和Wi11iams&Williams,(1995))，和在"PHYSICIA『SDESKREFERENCE",第52版，MedicalEconomics,Montvale,N.J.(1998)中。"有效量"是足以實現(xiàn)有益的或所希望的結(jié)果的量?？梢栽谝淮位蚨啻问┯?、應(yīng)用或劑量中施用有效量。本發(fā)明提供了特異性地識別和結(jié)合在由表1中鑒定的基因所表達的多肽或蛋白質(zhì)上的表位的抗體或其變體、衍生物或片段。在一個方面，分離所述抗體。在另一個方面，它們與合適的載體相組合。所述抗體可以是多克隆的或單克隆的，并且可從任何物種，鼠類、大鼠、猿分離，或者重組產(chǎn)生和分離。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生這些單克隆抗體的雜交瘤細胞系，所述單克隆抗體單獨地或與載體相組合地在培養(yǎng)物中。本發(fā)明還提供了包含抗體、其變體、衍生物或片段(包括但不限于免疫球蛋白鏈和CDR)的多肽。本發(fā)明進一步提供了抗獨特型抗體。抗獨特型抗體包括包含這樣的分子的任何蛋白質(zhì)或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限于重鏈或輕鏈或者其配體結(jié)合區(qū)的至少一個互補性決定區(qū)、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、構(gòu)架區(qū)或者其任何部分，其可整合入本發(fā)明的抗體中。本發(fā)明的抗獨特型抗體可包括或來源于任何哺乳動物，例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、嚙齒動物、靈長類動物等。本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的抗體的分離的多核苷酸，其單獨地或與載體、媒介物、藥學(xué)上可接受的媒介物、稀釋劑和宿主細胞相組合。本發(fā)明在一個方面進一步提供了分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼至少一種本發(fā)明的抗體或抗獨特型抗體的多核苷酸，與之互補，或與之雜交，包含其至少一個特定的序列、結(jié)構(gòu)域、部分或變體。本發(fā)明進一步提供了包含所述核苷酸的重組栽體，包含所述核酸和/或重組栽體的宿主細胞，以及制備和/或使用這些核酸、載體和/或宿主細胞的方法。用于分離、復(fù)制和表達多核苷酸的方法在本領(lǐng)域中是已知的且在下文中進行描述。上述的一種或多種抗體還可與栽體、藥學(xué)上可接受的載體或適合在診斷或治療方法中使用抗體或相關(guān)組合物的醫(yī)學(xué)裝置相組合。"所述載體可以是液相載體或固相載體例如小珠、凝膠或諸如脂質(zhì)體的載體分子。所述組合物任選地還可包含至少一種其他化合物、蛋白質(zhì)或組合物。"載體"的其他實例包括治療活性劑例如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab'片段)。例如，本發(fā)明的抗體、其變體、衍生物或片段可功能性地連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合或其他方式)至一個或多個其他分子實體，例如另一種抗體(例如，以產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原。因此，本發(fā)明包括許多種抗體綴合物、雙和多特異性分子和融合蛋白，無論其是否靶向與本發(fā)明的抗體相同的表位。載體的其他實例是可直接或間接地共價附著至本發(fā)明的抗體的有機分子(也稱為修飾劑)或激活劑。所述分子的附著可提高藥物動力學(xué)性質(zhì)(例如，增加的體內(nèi)血清半衰期)。有機分子的實例包括，但不限于，親水性聚合物基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。如此處所用的，術(shù)語"脂肪酸"包括一元羧酸和二元羧酸。"親水性聚合物基團"，作為此處使用的術(shù)語，是指在水中比在辛烷中更容易溶解的有機聚合物。適合用于修飾本發(fā)明的抗體的親水性聚合物可以是線性的或分枝的，其包括，例如，聚鏈垸二醇(例如，PEG、單曱氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如，葡聚糖、纖維素、寡糖、多糖等)、親水氨基酸的聚合物(例如，聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚鏈烷氧化物(例如，聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷有大約800至大約150，000道爾頓的分子量?？捎?至大約6個烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團取代親水性聚合物基團?？赏ㄟ^使用合適的方法來制備用脂肪酸或脂肪酸酯基團取代的親水性聚合物。例如，可將包含胺基團的聚合物偶聯(lián)至脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸根，和可將脂肪酸或脂肪酸酯上的激活的羧酸根(例如，用N，N-羰基二咪唑激活的)偶聯(lián)至聚合物上的羥基。適合用于修飾本發(fā)明的抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可被飽和，或可包含一個或多個不飽和單位。其實例包括，但不限于，正十二烷酸鹽(酉旨)、正十四烷酸鹽(酯)、正十八烷酸鹽(酯)、正二十烷酸鹽(酯)、正二十二烷酸鹽(酯)、正三十烷酸鹽(酯)、正四十烷酸鹽(酯)、順-A-9-十八烷酸鹽(酉旨)、全部順-A-5、8、11、14-花生四烯酸鹽(酯)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸。合適的脂肪酸酯包括包含線性或分枝的低級烷基的二羧酸的單酯。所述低級烷基可包含1至大約12個，優(yōu)選地1至大約6個碳原子。在另一個方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因的非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠(此處也稱為"HuMAb小鼠，，)，其表達完全人單克隆抗體，所述抗體中和至少一種與上面定義的本發(fā)明抗體相似的蛋白質(zhì)亞型。在特定的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因的非人動物是具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠，所述人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因編碼本發(fā)明的抗aV抗體的全部或部分。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因的非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠，能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生針對目的表位的人單克隆抗體的多種同種型。同種型轉(zhuǎn)換可通過例如傳統(tǒng)的或非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換來進行。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的細胞，其來源于或分離自上述表達人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠。然后通過融合至永生化細胞來使分離的B-細胞永生化，從而提供人抗體的源(例如，雜交瘤)。這些雜交瘤也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明進一步提供了至少一種抗體方法或組合物，其用于在細胞、組織、器官、動物或患者中，和/或在本領(lǐng)域已知的和/或此處描述的相關(guān)狀況之前、之后或期間，診斷上皮來源的癌癥例如非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或結(jié)腸癌。它們也用于預(yù)后或監(jiān)控疾病進展。還提供了組合物，所述組合物包含至少一種本發(fā)明的抗體、其變體、衍生物或片段，它們適合以對于調(diào)節(jié)或改善與上皮來源的癌癥例如非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌相關(guān)的癥狀或者治療至少一種這樣的癌癥來說有效的量進行施用。所述組合物包括，例如藥物和診斷組合物/試劑盒，其包含藥學(xué)上可接受的栽體和至少一種本發(fā)明的抗體、其變體、衍生物或片段。如上面所指出的，所述組合物還可以包含其他抗體或治療劑，它們相組合地提供了經(jīng)特別制定以提供最大治療益處的多重療法。可選擇地，本發(fā)明的組合物可與其他治療劑和細胞毒性劑共施用，無論是否與它們相連接或在同一按劑量給藥中施用。它們可與這樣的在單一組合物中或以分開的方式)，或者可在施用這樣的試劑之前或之后施用。這樣的試劑可包括皮質(zhì)類固醇、非類固醇免疫抑制劑、抗瘧藥和非類固醇抗炎藥物?？蓪⑺鼋M合物與可選擇的療法例如施用皮質(zhì)類固醇、非類固醇免疫抑制劑、抗癡藥和非類固醇抗炎藥物相組合?？稍隗w外或體內(nèi)實施本發(fā)明的方法。當在體外實施時，所述方法需要將細胞與一種或多種抗體和/或相關(guān)的包含上述抗體的治療性組合物、衍生物等接觸(例如，向細胞施用或遞送)。物。因此，此處進一步提供了包含本發(fā)明的抗體的制劑。所述制劑還可在水性稀釋劑中包含一種或多種防腐劑或穩(wěn)定劑例如苯酚、間曱酚、對甲酚、鄰曱酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、三氯叔丁醇、氯化鎂(例如，六水合物)、對羥基苯曱酸烷基酯(曱酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯銨、千索氯銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞或其混合物。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可使用任何合適的濃度或混合物，例如0.001-5%,或在其中的任何范圍或值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9,或在其中的任何范圍或值。非限定性實例包括，無防腐劑、0.1-2%的間曱酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0,9、1.0%)、0.1-3%的苯甲醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001-0.5°/。的疏柳汞(例如,0.005、0.01)、0.001-2.0%的苯酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005-1.0%的對羥基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9和1.0%)。如上面所指出的，本發(fā)明提供了制品，其包括包裝材料和至少一個小瓶，該小瓶裝有任選地在水性稀釋劑中配制的至少本發(fā)明抗體和所指定的緩沖劑和/或防腐劑的溶液，其中所述包裝材料包含標示這樣的溶液可保持l、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小時或更長時間的標簽。本發(fā)明進一步包括制品，其包括包裝材料、裝有至少一種凍干的本發(fā)明抗體的第一小瓶和裝有所指定的緩沖劑或防腐劑的水性稀釋劑的第二小瓶，其中所述包裝材料包含指導(dǎo)患者在水性稀釋劑中重構(gòu)抗體以形成可保持24小時或更長時間的溶液的標簽。所述的抗體范圍包括在重構(gòu)后，如果在濕的/干的系統(tǒng)中，產(chǎn)生大約1.Opg/ml至大約1000mg/ml的濃度的量，盡管更低和更高的濃度是可操作的，并且依賴于所想用的遞送載體，例如，溶液制劑將隨透皮貼劑方法、肺部方法、經(jīng)粘膜方法或者滲透或微量泵方法而不同?？赏ㄟ^包括在水性稀釋劑中混合至少一種本發(fā)明抗體和防腐劑的方法來制備本發(fā)明的制劑，所述防腐劑選自苯酚、間曱酚、對甲酚、鄰甲酚、氯曱酚、苯曱醇、對羥基苯甲酸烷基酯(曱酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯銨、節(jié)索氯銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞或其混合物。使用常規(guī)的溶解和混合方法在水性稀釋劑中混合所述抗體和防腐劑。例如，以足以提供所需濃度的抗體和防腐劑的量，將在經(jīng)緩沖的溶液中的測量量的至少一種抗體與在經(jīng)緩沖的溶液中的所需防腐劑相組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到該方法的變化，例如組分加入的順序、是否使用其他添加劑、制備制劑時的溫度和pH，都是對于所采用的施用濃度和方法可以進行優(yōu)化的因素。述雙瓶包括用裝有水性稀釋劑的第二小瓶進行重構(gòu)的一瓶凍干的抗體。要求重構(gòu)的單個溶液瓶或雙瓶可重復(fù)使用多次，并且可滿足患者治療的單個或多個循環(huán)，從而提供了比目前可獲得的治療方案更方便的治療方案。包括這些單瓶系統(tǒng)的經(jīng)認可的裝置包括用于遞送溶液的筆式注射器，例如BDPens,BDAutojectore,H簡ject.RTM.'NovoPen.RTM.，B-D.RTM.Pen，AutoPen.RTM.，和OptiPen.RTM.，GenotropinPen.RTM.，GenotronormPen.RTM.，H畫troPen.RTM.,Reco-Pen.皿，RoferonPen.RTM.，Biojector.RTM.，iject.RTM.，J-tipNeedle-FreeInjector.RTM.，Intraject.RTM.,Medi-Ject.RTM.，例如，由BectonDickensen(FranklinLakes,N.J.，可在bectondickenson.com上獲得)、Disetronic(Burgdorf，Switzerland,可在disetronic.com上獲得；Bioject，Portland,Oregon(可在bioject.com上獲得)；NationalMedicalProducts,WestonMedical(Peterborough,UK,可在weston-medica1.com上獲得)，Medi-JectCorp(Minneapolis,Minn.,可在mediject.com上獲得)制造或開發(fā)的?？贵w本發(fā)明的抗體是單克隆抗體，盡管在某些方面，可使用多克隆抗體。它們還可以是功能性片段、抗體衍生物或抗體變體。它們可以是嵌合的、人源化的或完全是人的抗體?？贵w的功能性片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab2、Fab'2和單鏈可變區(qū)?？稍诩毎囵B(yǎng)物、噬菌體或各種動物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、侖鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩、猿等中產(chǎn)生抗體。只要所述片段或衍生物保持本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性或中和能力，就可使用其?？赏ㄟ^混合物的結(jié)合進行比較，就結(jié)合的特異性來測試抗體。如果抗體對合適的抗原的結(jié)合超過對不相關(guān)的抗原或抗原混合物的結(jié)合至少2、5、7和優(yōu)選地10倍時，那么可認為其是特異性的。用于確定特異性的特異性測定法例如ELISA在本領(lǐng)域中是已知的。所述抗體的特征還在于其特異性地識別和結(jié)合目的表位的能力?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的并且在文獻中詳細描述的常規(guī)雜交瘤技術(shù)來產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體。例如，通過將合適的永生細胞系(例如，骨髓瘤細胞，例如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SS1、Sp2SA5、11397、MLA144、ACTIV、M0LT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA144、NAMAIWA、NE漏2A、CHO、PerC.6、YB2/0)或諸如此類，或者異源骨髓瘤(heteromyelomas)、其融合產(chǎn)物或來源于其的任何細胞或融合細胞，或者本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何其他合適的細胞系(參見，例如，www.atcc.org，www.1ifetech.com.等)，與抗體產(chǎn)生性細胞融合來生產(chǎn)雜交瘤，所述抗體產(chǎn)生性細胞為例如，但不限于，分離的或克隆的脾細胞、外周血細胞、淋巴細胞、扁桃體細胞或其他免疫細胞或包含B細胞的細胞，或者任何其他細胞，所述其他細胞以作為內(nèi)源或異源核酸的方式表達重鏈或輕鏈恒定區(qū)或可變區(qū)或構(gòu)架區(qū)或CDR序列，所述核酸作為重組或內(nèi)源的病毒、細菌、藻類、原核生物、兩棲動物、昆蟲、爬行動物、魚、哺乳動物、嚙齒動物、馬、羊、山羊、綿羊、靈長類動物、真核生物的基因組DNA、cDNA、rDNA、線粒體DM或RM、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRM(單鏈、雙鏈或三鏈的，雜合的)等或其任何組合?？贵w產(chǎn)生性細胞還可人或動物已用目的抗原免疫。任何其他合適的宿主細胞還可用于表達異源或內(nèi)源的編碼本發(fā)明的抗體、其特定片段或變體的核酸?？赏ㄟ^使用選擇性培養(yǎng)條件或其他合適的已知方法來分離融合的細胞(雜交瘤)或重組細胞，和通過有限稀釋或細胞分選或者其他已知的方法來進行克隆?？梢允褂糜糜诋a(chǎn)生或分離具有所需的特異性的抗體的其他合適方法，包括但不限于，通過使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法從肽或蛋白質(zhì)文庫(例如，但不限于，噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA等展示文庫；例如，可從各種商業(yè)賣家例如CambridgeAntibodyTechnologies(Cambridgeshire,UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg，Del.)、Biovation(Aberdeen,Scotland,UK)、Biolnvent(Lund,Sweden)獲得)中選擇重組抗體的方法。參見美國專利號4,704,692、5,723,323、5,763,192、5,814,476、5,817,483、5，824，514、5，976，862。備選的方法依賴于本領(lǐng)域內(nèi)已知的和/或此處描述的能夠產(chǎn)生人抗體庫的轉(zhuǎn)基因動物(例如，SCID小鼠，Nguyen等人(1977)Microbiol.Immunol.41:901-907(1997);Sandhu等人，(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118;Eren等人(1998)Immunol.93:154-161)的免疫。這樣的技術(shù)，包括，但不限于，核糖體展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94:4937-4942;Hanes等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95:14130-14135);單細胞抗體產(chǎn)生技術(shù)(例如，選擇的淋巴細胞抗體方法(selectedlymphocyteantibodymethod)("SLAM")(美國專利號5,627,052，Wen等人(1987)J.Immunol.17:887-892;Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:7843-7848);凝膠樣t滴(gelmicrodroplet)和流式細胞術(shù)(Powell等人(1990)Biotechnol.8:333-337;OneCellSystems,(Cambridge,Mass).;Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182:155-163;Kenny等人(1995)Bio/Technol.13:787-790);B細胞選擇(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports19:125-134(1994))。還可通過遞送編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸至合適的宿主，從而例如提供轉(zhuǎn)基因動物或哺乳動物例如山羊、牛、馬、綿羊等(它們在其乳汁中產(chǎn)生這些抗體)來制備本發(fā)明的抗體變體。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于例如美國專利號5，827，690、5,849,992、4，873，316、5，849，992、5，994，616、5，565，362和5,304，489中。術(shù)語"抗體變體"包括對抗體或片段的線性多肽序列的翻譯后修飾。例如，美國專利號6，602，684Bl描述了用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖基化形式的抗體的方法和所產(chǎn)生的糖蛋白，所述抗體包括完整的抗體分子、抗體片段或包含等同于免疫球蛋白的Fc區(qū)的區(qū)域的融合蛋白，具有增強的Fc介導(dǎo)的細胞毒性。還可通過遞送本發(fā)明的多核苷酸以提供轉(zhuǎn)基因植物和培養(yǎng)的植物細胞(例如，但不限于，煙草、玉米和浮萍)來制備抗體變體，所述產(chǎn)生這些抗體、特定部分或變體。例如，Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118和其中所引用的參考資料，描述了例如使用誘導(dǎo)型啟動子表達大量重組蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草葉的產(chǎn)生。已使用轉(zhuǎn)基因玉米在商業(yè)生產(chǎn)水平上表乳動物蛋白質(zhì)，所述哺乳動物蛋白質(zhì)具有與在其他重組系統(tǒng)中產(chǎn)生的或從天然來源純化的那些哺乳動物蛋白質(zhì)相同的生物學(xué)活性。參見，例如，Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464:127-147和其中所引用的參考資料。還已從轉(zhuǎn)基因植物種子大量地生產(chǎn)抗體變體，包括抗體片段，例如單鏈抗體(scFv's),所述轉(zhuǎn)基因植物種子包括煙草種子和馬鈴薯塊莖。參見，例如，Conrad等人(1998)PlantMol.Biol.38:101-109和其中所引用的參考資料。因此，還可按照已知的方法，使用轉(zhuǎn)基因植物來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。抗體衍生物可通過如下方式產(chǎn)生加入外源序列以修飾免疫原性或者減少、增強或修飾結(jié)合、親和力、結(jié)合率(on-rate)、離解率(off-rate)、抗體親抗原性(avidity)、特異性、半衰期或任何其他合適的特征。通常保留部分或所有非人或人CDR序列，而用人或其他氨基酸代替可變區(qū)和恒定區(qū)的非人序列。一般地，CDR殘基直接地且絕大部分參與影響抗原結(jié)合。可使用任何已知的方法進行本發(fā)明的抗體的人源化或工程改造，所述方法為例如但不限于美國專利號5，723,323、5，976，862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5，723，323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5，585,089、5，225，539和4，816，567中描述的方法。用于制備部分至完全人抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且可使用任何這樣的技術(shù)。根據(jù)一個實施方案，可在已進行改造從而表達人重鏈和輕鏈抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備完全人抗體序列。已制備了這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠的多個品系，它們可產(chǎn)生不同類別的抗體?？扇诤蟻碜援a(chǎn)生所需抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的B細胞以制備用于連續(xù)地產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞系。(參見，例如，Russel，N.D.等人(2000)InfectionandImmunityApril2000:1820-1826;Gallo,M.L.等人(2000)EuropeanJ.ofImmun.30:534-540;Green，L.L.(1999)J.ofImmun.Methods231:11-23;Yang,X-D等人(1999A)J.ofLeukocyteBiology66:401-410;Yang,X-D(1999B)CancerResearch59(6):1236-1243;Jakobovits，A.(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews31:33-42;Green,L和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188(3):483-495;Jakobovits，A.(1998)Exp.Opin.Invest.Drugs7(4):607-614;Tsuda，H.等人(1997)Genomics42:413-421;Sherman-Gold,R.(1997)GeneticEngineeringNews17(14);MendezM.等人(1997)NatureGenetics15:146-156;Jakobovits,A.(1996)WEIR'SHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY,THEINTEGRATED薩匿SYSTEM第IV巻，194.1-194.7;Jakobovits,A.(1995)CurrentOpinioninBiotechnology6:561-566;Mendez，M.等人(1995)Genomics26:294-307;Jakobovits,A.(1994)CurrentBiology4(8):761-763;Arbones，M.等人(1994)Immunity1(4):247-260;Jakobovits,A.(1993)Nature362(6417):255-258;Jakobovits,A.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(6):2551-2555;Kucherlapati等人，美國專利號6，075，181)。還可通過雜交瘤來產(chǎn)生人單克隆抗體，所述雜交瘤包括融合至永生化細胞的從轉(zhuǎn)基因非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細胞，所述轉(zhuǎn)基因非人動物具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。還可修飾本發(fā)明的抗體以產(chǎn)生嵌合抗體。嵌合抗體是其中抗體的重鏈和輕鏈的多種結(jié)構(gòu)域由來自多于一個物種的DM編碼的那些抗體。參見，例如，美國專利號4，816，567。術(shù)語"抗體衍生物"還包括"雙抗體"，其為具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，其中片段在同一個多肽鏈(VH中包含連接至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。(參見例如，EP404，097;WO93/11161;和Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。通過〗吏用太短而不允許在同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域進行配對的連接體，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。(參見，例如，屬于Chen等人的美國專利號6,632,926，其公開了抗體變體，所述抗體變體具有一個或多個插入親本抗體的高變區(qū)中的氨基酸，并且其對于靶抗原的結(jié)合親和力比親本抗體對于該抗原的結(jié)合親和力強至少兩倍)。術(shù)語"抗體衍生物"進一步包括"線性抗體"。產(chǎn)生其的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于Zapata等人(1995)ProteinEng.8(10):1057-1062中。簡而言之，這些抗體包含形成成對的抗原結(jié)合區(qū)域的成對的串聯(lián)Fd區(qū)段(Vh-ChI-VH-CH1)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的?？赏ㄟ^已知的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的抗體，所述方法包括但不限于，A蛋白純化、疏酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。也可使用高效液相色i普("HPLC")進行純化。本發(fā)明的抗體包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成方法的產(chǎn)物和如上所述通過重組技術(shù)從真核生物宿主或備選地從原核細胞產(chǎn)生的產(chǎn)物，所述真核生物宿主包括，例如，酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。在本發(fā)明的一些方面，可檢測地或治療性地標記抗體是有用的。用于將抗體綴合至這些試劑的方法在本領(lǐng)域中是已知的。只是為了說明目的，可以用可檢測的部分例如放射性原子、生色團、熒光團等來標記抗體。這些經(jīng)標記的抗體可用于在體內(nèi)或在分離的受試樣品中的診斷技術(shù)。還可將抗體綴合至例如藥物學(xué)試劑，例如化療藥物或毒素。可將其他連接至細胞因子、配體、另一種抗體。用于偶聯(lián)至抗體以獲得抗腫瘤效果的合適的試劑包括細胞因子，例如白細胞介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子(TNF);用于光動力療法的光敏劑，包括酞胥四磺酸鋁(III)、血卟啉和酞菁；放射性核素，例如碘-131(1311)、釔-90(9。Y)、鉍-212(212Bi)、鉍-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、錸-186(186Re)和錸-188(188Re);抗生素，例如多柔比星、阿霉素、柔紅霉素、氨甲蝶呤、道諾霉素、新制癌菌素和卡鉑；細菌毒素、植物毒素和其他毒素，例如白喉毒素、假單胞菌外毒素A、葡萄球菌腸毒素A、相思豆毒蛋白-A毒素、篦麻毒蛋白A(去糖基化的篦麻毒蛋白A和天然篦麻毒蛋白A)、TGF-a毒素、來自中國眼鏡蛇(najanajaatra)的細胞毒素和多花白樹毒蛋白(植物毒素)；來自植物、細菌和真菌的核糖體失活蛋白，例如局限曲菌素(由局限曲霉(Jwerp7/";res"/c"5")產(chǎn)生的核糖體失活蛋白)、肥皂草毒蛋白(來自肥皂草(^/o/7ar/a的核糖體失活蛋白)和RM酶；酪氨酸激酶抑制劑；ly207702(二氟4匕噪吟斗亥脊)；包含抗囊齊J(anticysticagents)(例:ft口，反義寡核苷酸、編碼毒素的質(zhì)粒、氨曱蝶呤等)的脂質(zhì)體；和其他抗體或抗體片段，例如F(ab)。關(guān)于包含共價地連接至有機分子的抗體的制劑，可使用合適的方法例如通過與一種或多種修飾劑反應(yīng)來制備它們。這些試劑的實例包括修飾性和活化性的基團。此處所用的術(shù)語"修飾劑"是指包含活化基團的合適的有機基團(例如，親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。前面提供了這些基團的特定實例。"活化基團"是可在合適的條件下與第二化學(xué)基團反應(yīng)從而在修飾劑與第二化學(xué)基團之間形成共價鍵的化學(xué)部分或官能團。這些活性性基團的實例是親電子基團例如甲苯磺酸鹽、曱磺酸、卣代(氯代、溴代、氟代、碘代)、N-羥基琥珀酰亞胺基酯(NHS)等?？膳c巰基反應(yīng)的活化基團包括，例如，馬來酰亞胺、碘乙酰基、丙烯?；?、吡啶基二硫化物、5-巰基-2-硝基苯甲酸硫醇(5-thio卜2-nitrobe畫icacidthiol,TNB-thiol)等?？蓪⒊霉倌軋F偶聯(lián)至包含胺或酰肼的分子，并可將疊氮基與三價磷基團反應(yīng)形成氨基磷酸酯或磷酰亞胺鍵。用于將活化基團引入分子中的合適的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如，Hermanson，G.T.，BIOCONJUGATETECHNIQUES,AcademicPress:SanDiego,Calif.(1996))?？蓪⒒罨鶊F直接或通過連接體部分與有機基團(例如，親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)結(jié)合，所述連接體部分例如為二價d-Cu基團，其中一個或多個碳原子可被雜原子例如氧、氮和硫替代。合適的連接體部分包括，例如，四乙二醇?？赏ㄟ^下列方式來產(chǎn)生包含連接體部分的修飾劑例如，在1-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)存在的情況下將單-Boc-烷基二胺(例如，單-Boc-乙二胺、單-Boc-二氨基己烷)與脂肪酸反應(yīng)從而在游離胺和脂肪酸羧酸之間形成酰胺鍵。可通過用三氟乙酸(TFA)處理來從產(chǎn)物上除去Boc保護基團以暴露伯胺，該伯胺可如所描述的那樣地偶聯(lián)至另一個羧酸，或者可與馬來酸酐反應(yīng)，并將所得的產(chǎn)物環(huán)化，從而產(chǎn)生脂肪酸的活化的馬來酰亞氨基4汁生物。修飾的抗體。例如，可通過使用胺反應(yīng)性修飾劑例如PEG的NHS酯，以非位點特異性方式將有機部分結(jié)合至抗體。也可通過還原抗體或抗原結(jié)合片段的二硫鍵(例如，鏈內(nèi)二硫鍵)來制備經(jīng)修飾的人抗體或抗原結(jié)合片段。然后，可將經(jīng)還原的抗體或抗原結(jié)合片段與巰基反應(yīng)性修飾劑反應(yīng)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗體。可使用合適的方法例如反向蛋白水解(reverseproteolysis)來制備包含有機部分的經(jīng)修飾的人抗體和抗原結(jié)合片段，所述有機部分連接至本發(fā)明的抗體的特定位點。通常參見，Hermanson，G.T.，BI0C0NJUGATETECHNIQUES,AcademicPress:SanDiego，Calif.(1996)。多核苷酸和多肽通過使用表1(和下文的序列表)中提供的序列信息并經(jīng)采用商購可獲得的自動4匕肽合成4義(例如由PerkinElmer/AppliedBiosystems，Inc.,430A或431A型，F(xiàn)osterCity,CA，USA生產(chǎn)的合成儀)所進行的化學(xué)合成可獲得多核苷酸、多肽和其片段?？沙恋砗铣傻牡鞍踪|(zhì)或多肽，并通過例如高效液相色譜(HPLC)進一步進行純化。因此，本發(fā)明還提供了用于化學(xué)合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過提供蛋白質(zhì)的序列和試劑例如氨基酸和酶，并以正確的方向和線性次序?qū)被徇B接在一起來合成蛋白質(zhì)。備選地，可通過此處描述的熟知的重組方法，使用此處描述的宿主細胞和載體系統(tǒng)來獲得蛋白質(zhì)和多肽。宿主細胞可以是原核的或真核的。上文描述了宿主細胞系統(tǒng)。診斷方法如上面所指出的，本發(fā)明提供了用于幫助診斷細胞狀態(tài)的多種方法，所述細胞狀態(tài)的特征在于以例如惡性腫瘤、過度增生或組織轉(zhuǎn)化的形式存在的異常細胞生長。所述方法對于幫助診斷上皮來源的癌癥例如非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌是特別有用的。可通過注意細胞的生長是否不受通常的正常生長的限制控制來確定細胞的贅生性狀態(tài)。為了本發(fā)明的目的，所述術(shù)語還包括基因型改變，所述基因型改變發(fā)生在檢測以腫瘤形式進行的該生長之前，并且是這些表型改變的原因。與細胞的贅生性狀態(tài)相關(guān)的表型改變(成組的與體內(nèi)致瘤能力相關(guān)的體外特征)包括更圓的細胞形態(tài)、較松散的基質(zhì)附著、接觸抑制的喪失、貼壁依賴性的喪失、蛋白酶例如纖溶酶原激活劑的釋放、增加的糖轉(zhuǎn)運、減少的血清需要、胎兒抗原的表達等。(參見，Luria等人(1978)GENERALVIROLOGY,第3版，436-446(JohnWiley&Sons,NewYork))。因此，一個實施方案是診斷細胞的狀況的方法，其通過篩選從樣品分離的差異表達的多核苷酸或多肽的存在來進行診斷，所述樣品包含或被懷疑包含表達所述基因的細胞，其中所述基因的差異表達是細胞的贅生性狀態(tài)的標志。如下所示，與對應(yīng)的正常或健康的細胞或組織相比，所述基因更多地在癌癥或腫瘤細胞中表達，其中所述細胞是肺、卵巢或前列腺中的一種或多種細胞?？赏ㄟ^任何合適的方法來進行檢測，包括例如檢測從所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量或從由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA的量或由所述基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的量。通過反向翻譯(reversetranslating)表1中鑒定的肽和使用編碼所述肽的多核苷酸來提供用于這些方法中各個方法的探針。可通過抽樣原則對樣品施行這些方法，或可修改這些方法以進行高通量分析。此外，可就轉(zhuǎn)錄物或所表達的基因產(chǎn)物的存在和量來檢索和分析數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包含一定量的(quantitative)從細胞樣品分離的完整或部分的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)序列。在一個方面，所述數(shù)據(jù)庫包含至少一個表1中所示的序列和/或編碼其的多核苷酸。僅用于舉例說明的目的，通過記錄測試系統(tǒng)中在從目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的水平上所述基因的表達量(如果有，例如，改變的)來測定基因表達。在分開的實施方案中，由目的基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的水平的提高指示了細胞的贅生性狀態(tài)的存在。所迷方法可用于幫助肺癌、卵巢癌或前列腺癌的診斷。因此，通過在腫瘤生長前檢測該基因型，人們可預(yù)測對癌癥的易患性(predisposition)和/或提供早期i貪斷和治療。用于本發(fā)明的細胞或組織樣品包括體液、固體組織樣品、從其來源的組織培養(yǎng)物或細胞和其后代，以及從這些來源中的任一種制備的切片或涂片，或可包含具有此處描述的基因的細胞的任何其他樣品。在一個實施方案中，所述樣品包括從受試者的組織例如可能包含轉(zhuǎn)移灶的肺或組織制備的細胞。在用于mRNA水平的改變的測定中，首先按照本領(lǐng)域的標準方法提取在前述樣品中所包含的核酸。例如，可使用各種水解酶或化學(xué)溶液按照Sambrook等人(1989)(見上)中所示的方法來分離或者按照由廠商提供的隨附說明書用核酸結(jié)合樹脂來提取mRNA。然后，按照本領(lǐng)域眾所周知的方法或基于此處例舉的方法，通過雜交(例如，Northern印跡分析)和/或擴增程序來檢測在所提取的核酸樣品中包含的基因的mRNAo具有至少10個核苷酸并展示出對至少一種編碼表1中所鑒定的肽本領(lǐng)域中已知，對于特異性雜交不必使用"完全匹配的"探針。通過少量堿基的置換、缺失或插入而獲得的探針序列的小改變不影響雜交特異性。一般地，可耐受多至20%的堿基對錯配(當被最佳比對時)。優(yōu)選地，用于檢測mRNA的探針與在編碼表1中鑒定的肽的基因或多核苷酸中所包含的相似大小的同源區(qū)域具有至少大約80%的同一性。在一個方面，在同源區(qū)域進行比對后，所述探針與相應(yīng)的多核苷酸序列具有85%的同一性，或備選地，其展示90%的同一性。這些探針可用于i文射分沖斤法(例:i口，Southern和Northern印跡分對斤)以檢測、預(yù)后、診斷或監(jiān)控由目的多核苷酸的差異表達所造成的各種贅生性狀態(tài)。片段的總大小以及互補片段的大小將依賴于特定核酸區(qū)段的所希望的用途或應(yīng)用。來源于已知序列的更小的片段通?？捎糜陔s交實施方案，其中互補區(qū)域的長度可根據(jù)希望檢測的互補序列而變化，例如在大約10和大約100個核苷酸或甚至全長之間變化。在一個方面，使用在長度大于大約IO個核苷酸的片段范圍內(nèi)具有互補序列的核苷酸探針以增加雜交物的穩(wěn)定性和選擇性，從而提高獲得的特定雜交分子的特異性。備選地，當需要時，可設(shè)計具有長度超過大約25個或可選擇地超過大約50個核苷酸或甚至更長的基因互補片段的核酸分子?？衫缤ㄟ^下列方式來容易地制備這樣的片段使用化學(xué)方法直接合成所述片段，應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)，例如在美國專利號4,603,102中描述的采用兩個引發(fā)寡核苷酸的PCRTM技術(shù)，或?qū)⑺x擇的序列導(dǎo)入重組載體中以進行重組生產(chǎn)。在一個方面，探針長度為大約50至大約75個核苷酸，或可選擇地大約50至大約100個核苷酸。可根據(jù)全長基因的序列來設(shè)計這些探針。在某些實施方案中，使用此處描述的核酸序列與合適的手段例如標記的組合以檢測雜交從而檢測互補序列是非常有利的。許多種合適的指示劑手段在本領(lǐng)域中是已知的，包括熒光的、放射性的、酶促的或其他配體，例如抗生物素蛋白/生物素，其能夠產(chǎn)生可檢測的信號。人們可使用熒光標記或酶標簽例如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶以代替放射性試劑或其他在環(huán)境方面所不希望的試劑。在酶標簽的情況下，已知這樣的比色指示劑底物，其可用于提供對于人眼或在分光光度測量法上可見的手段，以鑒定與包含互補核酸的樣品的特異性雜交?？稍诓煌?嚴緊度"條件下進行雜交反應(yīng)。相關(guān)的條件包括溫育的溫度、離子強度、時間，反應(yīng)混合物中其他溶質(zhì)例如甲酰胺的存在，和洗滌程序。較高的嚴緊度條件是這樣的條件，即例如較高的溫度和較低的鈉離子濃度，其要求雜交組分之間較高的最小互補性來形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。增加雜交反應(yīng)的嚴緊度的條件是眾所周知的，并且在本領(lǐng)域中是公開的。參見，例如Sambrook等人(1989),見上。本發(fā)明的核苷酸探針也可用作引物和檢測在某些身體組織中差異表達的基因或基因轉(zhuǎn)錄物。此外，可用于檢測前述差異表達的mRNA的引物與在先前鑒定的編碼表1中鑒定的肽的序列中所包含的相似大小的同源區(qū)域具有至少大約80%的同一性。為了本發(fā)明的目的，"擴增"是指使用能夠以適當?shù)谋Ｕ娑葟?fù)制靶序列的引物依賴性聚合酶的任何方法。可用天然的或重組的DNA聚合酶例如T7DNA聚合酶、大腸桿菌DM聚合酶的Klenow片段和逆轉(zhuǎn)錄酶進行擴增。已知的擴增方法是PCR,MacPherson等人，PCR:APRACTICALAPPROACH,(IRIvPressatOxfordUniversityPress(1991))。然而，用于各應(yīng)用反應(yīng)的PCR條件是根據(jù)經(jīng)驗確定的。許多參數(shù)影響反應(yīng)的成功。其中有退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+ATP濃度、pH以及引物、模板和脫氧核糖核苷酸的相對濃度。擴增后，可通過瓊脂糖凝膠電泳，然后用溴化乙錠和紫外線照明進行顯現(xiàn)，來檢測所得的DNA片段。可通過證明擴增出的DNA片段具有預(yù)測的大小、展示預(yù)期的限制性消化模式和/或與正確克隆的DM序列雜交，來驗證差異表達的目的基因的特異性擴增。還可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法將探針附著至固體支持物以用于高通量篩選測定法。PCTW097/10365和美國專利號5,405,783、5，412，087和5，445，934，例如/>開了可包含一個或多個此處/>開的序列的高密度寡核苷酸芯片的構(gòu)建。使用美國專利號5,405,783、5，412，087和5，445，934中/>開的方法，在4汙生化玻璃表面上合成本發(fā)明的探針。將光保護的核苷亞磷酰胺偶聯(lián)至玻璃表面，通過使用光刻掩模進行的光解而選擇性地去保護，然后將其與第二種受保護的核苷亞磷酰胺反應(yīng)。重復(fù)該偶聯(lián)/去保護過程直至完成想要的探針。還可通過將核酸樣品暴露于經(jīng)探針修飾的芯片來測定基因的表達水平。例如，優(yōu)選地在擴增步驟期間用熒光標簽標記提取的核酸。在合適的嚴緊度水平上進行經(jīng)標記的樣品的雜交。使用檢測裝置例如共聚焦顯微鏡來定量測量探針-核酸雜交的程度。參見，美國專利號5，578，832和5，631，734。獲得的測量結(jié)果與基因表達水平正相關(guān)。探針和高密度寡核苷酸探針陣列也提供了用于監(jiān)控目的基因的表達的有效手段。它們也可用于篩選上調(diào)或下調(diào)目的基因表達的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于監(jiān)控在對于確定的刺激例如細胞或受試者暴露于藥物而作出應(yīng)答時目的基因的表達，所述目的基因特異性地與本發(fā)明的探針雜交。在一個實施方案中，通過檢測一個或多個連接至樣品核酸的標記來檢測雜交的核酸?？赏ㄟ^許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法中的任一種方法來整合標記。然而，在一個方面，在樣品核酸的制備中，在擴增步驟期間同時整合標記。因此，例如，使用經(jīng)標記的引物或經(jīng)標記的核苷酸的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)將會提供經(jīng)標記的擴增產(chǎn)物。在分開的實施方案中，如上所述，使用經(jīng)標記的核苷酸(例如，經(jīng)焚光素標記的UTP和/或CTP)的轉(zhuǎn)錄擴增將標記整合入轉(zhuǎn)錄出的核酸中。備選地，可將標記直接加至原始核酸樣品(例如，mRNA、polyA、mRNA、cDM等)中或在擴增完成后加至擴增產(chǎn)物中。將標記連接至核酸的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且包括例如切口平移法或末端標記法(例如，使用經(jīng)標記的RNA)，其通過磷酸化(kinasing)所述核酸，然后將連接樣品核酸的核酸連接體附著(連接)至標記(例如，熒光團)。適合用于本發(fā)明的可檢測標記包括可通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段進行檢測的任何組合物。在本發(fā)明中有用的標記包括生物素(其用經(jīng)標記的抗生物素蛋白綴合物進行染色)、磁珠(例如，Dynabeads)、熒光染料(例如，熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射標記物(例如，3H、1251、35S、"C或"P)、酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和在ELISA中通常使用的其他酶)和比色標記物例如膠體金或有色玻璃珠或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)。教導(dǎo)這些標記的用途的專利包括美國專利號3，817,837、3,850,752、3,939,350、3，996，345、4，277，437、4，275，149和4，366，241。用于檢測這些標記的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。因此，例如，可使用照相膠片或閃爍計數(shù)器來檢測放射性標記，可通過使用光檢測器檢測發(fā)射出的光來檢測熒光標記。通常通過向酶提供底物并檢測經(jīng)酶對底物的作用而產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測酶標記，和通過簡單地顯現(xiàn)有色標記來檢測比色標記。如在W097/10365中更詳細地描述的，可在雜交之前或之后向乾(樣品)核酸中加入標記。這些是在雜交前被直接地附著至或整合入耙(樣品)核酸的可檢測的標記。相反地，在雜交后，將"間接標記"連接至雜交雙鏈體。通常，將間接標記附著至已在雜交之前被附著至乾核酸的結(jié)合部分。因此，例如，可在雜交之前對靶核酸進行生物素化。在雜交后，綴合有抗生物素蛋白的熒光團將結(jié)合帶有生物素的雜交雙鏈體，從而提供了容易檢測的標記。關(guān)于對核酸進行標記和檢測經(jīng)標記的雜交的核酸的方法的詳細綜述，參見，LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY,第24巻HybridizationwithNucleicAcidProbes,P.Tijssen，ed.Elsevier,N.Y.(1993)。還可在與高密度探針陣列雜交之前，使用本領(lǐng)域中已知的方法，例如WO97/10365中公開的方法，來修飾核酸樣品，以減少樣品的復(fù)雜度，從而降低背景信號和提高測量的靈敏度。通常使用計算機軟件程序分析來自芯片測定法的結(jié)果。參見，例如，EP0717113A2和W095/20681。將雜交數(shù)據(jù)讀入程序，該程序計算被耙向的基因即表l中鑒定的基因的表達水平。將該數(shù)據(jù)與現(xiàn)有的患病和健康個體的基因表達水平的數(shù)據(jù)集比較。所獲得的數(shù)據(jù)和成組的疾病個體的數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)表明在受試患者中發(fā)生疾病?？捎糜跈z測贅生性肺組織的數(shù)據(jù)庫也在本申請的范圍之內(nèi)，其包含一個或多個編碼表1中所列的肽或其部分的多核苷酸的序列，以及所述肽的序列。這些多核苷酸序列貯存在數(shù)字存儲介質(zhì)中，從而匯編出了鑒定肺癌細胞的基因的標準化描述的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。通過首先選擇懷疑具有贅生性表型或基因型的細胞，然后從該細胞分離多核苷酸，該數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可用于分析兩個細胞之間的基因表達。然后對分離的多核苷酸進行測序。如上所述，使用同源性檢索技術(shù)將來自樣品的序列與數(shù)據(jù)庫中存在的序列進行比較。在一個方面，在受試序列和表l中鑒定的至少一個序列或者編碼其的多核苷酸或其互補序列之間選擇大于90%,或可選擇地選擇大于95°/。，或可選擇地選擇大于或等于97%的序列同一性，是已從上面定義的肺癌、前列腺癌或卵巢癌細胞中分離出所述多核苷酸的陽性指示。備選地，可將樣品和數(shù)據(jù)庫比較。簡而言之，使用本領(lǐng)域中已知的并例如在Sambrook等人(1989)(見上)中描述的方法從細胞或組織樣品中分離多種RNA。任選地，可將基因轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)變成cDNA。將基因轉(zhuǎn)錄物的抽樣接受序列特異性分析和定量。將這些基因轉(zhuǎn)錄物序列豐度與包括患病和健康個體的常規(guī)數(shù)據(jù)集的參照數(shù)據(jù)庫序列豐度比較。患者具有與患者的數(shù)據(jù)集最緊密關(guān)聯(lián)的疾病，包括此處鑒定的轉(zhuǎn)錄物的過表達。還可通過檢查蛋白質(zhì)產(chǎn)物來確定目的基因的差異表達。在本領(lǐng)域中可獲得用于蛋白質(zhì)分析的各種技術(shù)。其包括但不限于放射免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫放射測定法)、"夾心"免疫測定法、免疫放射測定法、原位測定法(使用例如，膠體金、酶或放射性同位素標記)、Western印跡分析、免疫沉淀測定法、免疫熒光測定法和PAGE-SDS。測定蛋白質(zhì)水平的一個手段包括(a)提供包含多肽的生物樣品；和(b)測量在對目的基因的表達產(chǎn)物具有反應(yīng)性的抗體和樣品中的組分之間發(fā)生的任何免疫特異性結(jié)合的量，其中免疫特異性結(jié)合的量表明所表達的蛋白質(zhì)的水平。對于這些免疫測定法，需要特異性地識別和結(jié)合這些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體。這些抗體可從商業(yè)賣家購得，或使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法來產(chǎn)生和篩選。參見，Harlow和Lane(1988)(見上)，和Sambrook等人(1989)(見上)。備選地，可使用已知的方法來制備和分離特異性地識別和結(jié)合目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多克隆或單克隆抗體。在診斷特征在于基因的差異表達的惡性腫瘤、過度增生或組織轉(zhuǎn)化中，人們通常進行受試者與合適的對照的比較分析。優(yōu)選地，診斷檢測包括來源于受試者的對照樣品(在下文中稱為"陽性對照")，所述受試者展現(xiàn)出目的基因表達中的預(yù)期變化和目的惡性腫瘤或組織轉(zhuǎn)化的臨床特征。備選地，診斷還包括來源于受試者的對照樣品(下文中稱為"陰性對照")，所述受試者缺乏贅生性狀態(tài)的臨床特征并且其的所述基因的表達水平在正常范圍之內(nèi)。相關(guān)于所鑒定的改變而言，受試者和陽性對照之間的正相關(guān)表明存在對所述疾病的易患性。受試者和陰性對照之間缺乏相關(guān)性確證了該診斷。在優(yōu)選實施方案中，該方法用于基于目的基因的差異表達來診斷上皮來源的癌癥，例如，肺癌、卵巢癌或前列腺癌。篩選測定法本發(fā)明還提供了篩選，其用于鑒定用于逆轉(zhuǎn)細胞的贅生性狀況或選擇性地抑制上述細胞的生長或增殖的先導(dǎo)化合物(lead)、藥物、治療性生物制劑和方法。在一個方面，所述篩選鑒定了可用于治療特征在于目的基因的差異表達的惡性腫瘤、過度增生或組織轉(zhuǎn)化的先導(dǎo)化合物或生物試劑。因此，為了在體外實施所述方法，首先提供合適的細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。所述細胞可以是培養(yǎng)的細胞或經(jīng)遺傳修飾的細胞，所述細胞差異表達與贅生性細胞相關(guān)的目的基因。備選地，所述細胞可來自組織活檢。將所述細胞在一定的條件(溫度、生長或培養(yǎng)介質(zhì)和氣體(C02))下培養(yǎng)并進行適當?shù)臅r間以獲得無密度依賴性限制的指數(shù)增殖。還希望保持另外的分開的細胞培養(yǎng)物；其是不接受受試試劑從而用作對照的細胞培養(yǎng)物。正如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的，可改變該方法以進行高通量分析，并且可在微量滴定板中培養(yǎng)合適的細胞，和可通過記錄基因型的變化、表型的變化和/或細胞死亡來同時測定幾種試劑。當試劑是除了DNA或RNA核酸分子外的組合物時，合適的條件包括直接加入至細胞培養(yǎng)物中或加入至培養(yǎng)基中以進行添加。正如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，必須加入可通過經(jīng)驗確定的"有效"量。所述篩選包括將所述試劑與特征在于目的基因的差異表達的受試細胞接觸，然后就目的基因的表達水平檢測所述細胞。在一些方面，可能需要測定在檢測前目的基因的表達水平。這提供了用于比較在對細胞培養(yǎng)物施用所述試劑后的表達的基線。在另一個實施方案中，受試細胞是來自差異表達目的基因的已建立的細胞系的培養(yǎng)細胞。如果基因表達回復(fù)(減少或增加)至在處于正?；蚍琴樕誀顟B(tài)的細胞中存在的水平，或者細胞選擇性地死亡或展示減少的生長速率，則該試劑是可能的治療劑。在另一個方面，受試細胞或組織樣品分離自待被治療的受試者，并篩選一種或多種潛在的試劑以確定對于該個體患者來說最佳的治療劑和/或療程。為了本發(fā)明的目的，"試劑"包括，但不限于，生物或化學(xué)的化合物例如簡單或復(fù)雜的有機或無機分子、肽、蛋白質(zhì)或寡核苷酸。可合成化合物的巨大陣列，所述化合物例如為寡聚物，例如寡肽和寡核苷酸，以及基于各種核心結(jié)構(gòu)的合成有機化合物；這些化合物也包括在術(shù)語"試劑，，中。此外，各種天然來源可提供用于篩選的化合物，例如植物或動物提取物等。盡管并不總是明確地指出，但應(yīng)當理解，可單獨地或與另一種試劑相組合地使用所述試劑，所述另一種試劑具有與由本發(fā)明篩選法鑒定的試劑相同或不同的生物學(xué)活性。還希望將所述試劑和方法與其他療法相組合。如此處所用的，術(shù)語"逆轉(zhuǎn)細胞的贅生性狀態(tài)，，旨在包括凋亡、壞死或阻止細胞分裂的任何其他手段、減少的腫瘤發(fā)生能力、藥物抗性的喪失、成熟、分化或此處描述的贅生性表型的逆轉(zhuǎn)。如上面所指出的，用該方法合適地處理具有導(dǎo)致贅生性狀態(tài)的目的基因的差異表達的肺細胞。可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來鑒定這些細胞，所述方法允許鑒定所述基因的差異表達。當所述試劑是核酸時，可通過本領(lǐng)域中已知的方法將其加至細胞培養(yǎng)物中，所述方法包括，但不限于，磷酸鈣沉淀、顯微注射或電穿孔。備選地或另外地，可將核酸整合入表達或插入載體中以整合入細胞中。包含啟動子和可將多核苷酸有效連接入其內(nèi)的克隆位點的載體在本領(lǐng)域中是熟知的，并且在下面進行簡要描述。使用本領(lǐng)域中熟知的方法將多核苷酸插入載體基因組中。例如，可在合適的條件下將插入物和載體DM與限制性內(nèi)切酶接觸以在每個分子上產(chǎn)生互補末端，其可相互配對，并通過連接酶而連接起來。備這些合成的連接體包含相應(yīng)于載體DNA中的特定限制性位點的核酸序列。此外，可連接包含終止密碼子的寡核苷酸和合適的限制性位點以插入栽體中，所述栽體包含，例如，一些或所有下列部分選擇標記基因，例如用于在哺乳動物細胞中選擇穩(wěn)定或暫時的轉(zhuǎn)染子的新霉素基因；來自人CMV的即時早期基因的增強子/啟動子序列，用于高水平轉(zhuǎn)錄；來自SV4G的轉(zhuǎn)錄終止信號和RNA加工信號，用于mRNA的穩(wěn)定性；SV40多瘤復(fù)制起點和ColEl,用于正確的附加型復(fù)制；多用途多克隆位點；以及T7和SP6RNA啟動子，用于有義和反義RM的體外轉(zhuǎn)錄。其他手段在本領(lǐng)域中是熟知的并是可獲得的?？赏ㄟ^細胞分裂減少、細胞分化或測定基因過表達的減少來確定是否已實現(xiàn)本方法的目的，即逆轉(zhuǎn)細胞的贅生性狀態(tài)?？赏ㄟ^組織學(xué)方法或通過監(jiān)測某些細胞表面標記的存在或丟失來監(jiān)控細胞分化，所述細胞表面標記可能與未分化的表型(例如目的基因的表達)相關(guān)。還要求保護試劑盒，其包含進行此處描述的篩選和體外方法所必需的試劑和說明書。當受試者是動物例如大鼠或小鼠時，所述方法提供了方便的動物模型系統(tǒng)，所述動物模型系統(tǒng)可在治療劑的臨床測試前使用，或可選擇地用于先導(dǎo)化合物優(yōu)化(leadoptimization)。在該系統(tǒng)中，如果基因表達回復(fù)至正常水平，或者如果與包含目的基因的差異表達的細胞的存在相關(guān)或相關(guān)聯(lián)的癥狀各自與未處理的具有病理細胞的動物相比得到改善，那么候選試劑是潛在的藥物。具有細胞或動物(其是健康或未受處理的)的分開的陰性對照組也是有用的，其提供了比較的基礎(chǔ)。治療方法由本發(fā)明提供的治療劑包括，但不限于，小分子、多核苷酸、肽、抗體、抗原呈遞細胞，和包括特異性地識別和裂解表達目的基因的細胞的免疫效應(yīng)細胞。通過篩選一種或多種抗腫瘤細胞的試劑可確定使用試劑是否將會有益地治療受試者或患者，所述腫瘤細胞是通過使用本領(lǐng)域中已知的方法從受試者或患者中分離的細胞。在下文中提供了其他方法。在一個實施方案中，以對于治療上皮來源的癌癥例如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌來說有效的量施用所述治療劑。本發(fā)明的治療劑也可用于防止從癌變前或非惡性狀態(tài)進展至贅生性或惡性狀態(tài)。各種遞送系統(tǒng)是已知的，并且可用于施用本發(fā)明的治療劑，例如包嚢在脂質(zhì)體、微粒、微膠嚢中，由重組細胞表達，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見例如，Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)，將治療性核酸構(gòu)建成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其他載體的一部分，等等。遞送的方法包括但不限于動脈內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和口服途徑。在特定的實施方案中，可以希望將本發(fā)明的藥物組合物局部地施用至需要治療的區(qū)域；這可通過例如(但非限定性的)在手術(shù)期間通過注射或借助于導(dǎo)管進行局部輸注來實現(xiàn)?？蓪⒃诖颂庤b定為對于其所希望的目的來說有效的試劑施用給受試者或個體，所述受試者或個體易于發(fā)生與目的基因的差異表達相關(guān)的疾病或處于這樣的風險中。當將所述試劑施用給受試者例如小鼠、大鼠或人患者時，可將所述試劑加至藥學(xué)上可接受的載體并全身性或局部地施用給受試者。在一個方面，為確定可得到有益治療的患者，從所述患者身上取出腫瘤樣品并就目的基因的差異表達對細胞進行測定。治療量可通過經(jīng)驗確定，并且將隨被治療的病理學(xué)狀態(tài)、被治療的受試者和試劑的功效和毒性而變化。當遞送至動物時，所述方法可用于進一步驗證試劑的功效。作為動物模型的例子，成組的棵鼠(Balb/cNCRnu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各自用大約105至大約109個此處定義的過度增生的癌或靶細胞進行皮下接種。當形成腫瘤時，通過例如在腫瘤周圍的皮下注射來施用該試劑。每周兩次，使用游標卡尺在二維上進行腫瘤測量以確定腫瘤大小的減少。適當時，也可使用其他動物模型。在整個療程中，可以在一劑中、連續(xù)地或間歇地進行體內(nèi)施用。用于確定最有效的施用手段和劑量的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，并且將隨用于治療的組合物、治療的目的、被治療的靼細胞和被治療的受試者而變化?？捎弥委熱t(yī)生所選擇的劑量水平和模式進行單次或多次施用?？稍谙旅嬲业胶线m的劑型和施用所述試劑的方法。本發(fā)明的試劑和組合物可用于制備藥物，和通過按照常規(guī)方法例如將活性成分配制在藥物組合物中進行施用而用于治療人或其他動物。所述藥物組合物可通過口服、鼻內(nèi)、腸胃外途徑或通過吸入療法進行施用，并且可采用片劑、錠劑、顆粒劑、膠嚢劑、丸劑、安瓿劑、栓劑或氣霧劑形式。它們還可以采用活性成分在水性或非水性稀釋劑中的懸浮液、溶液和乳濁液，糖漿劑，粒劑或粉劑的形式。除了本發(fā)明的試劑外，藥物組合物還可包含其他藥學(xué)上活性的化合物或多種本發(fā)明的組合物。更特別地，可通過任何合適的途徑，包括口服、直腸、鼻、局部(包括經(jīng)皮、氣霧劑、頰和舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))和肺的途徑，來施用本發(fā)明的試劑(此處也稱為活性成分)以進行治療。還將會認識到，優(yōu)選的途徑可隨接受者的狀況和年齡以及被治療的疾病而變化。理想地，應(yīng)當施用試劑以在疾病的位點處獲得活性化合物的峰濃度。這可例如通過下列方式來實現(xiàn)靜脈內(nèi)注射試劑(任選地在鹽水中)，或口服施用試劑，例如作為包含活性成分的片劑、膠嚢劑或糖漿劑?？赏ㄟ^連續(xù)的輸注來保持試劑的所需血液水平，以在患病組織中提供治療量的活性成分。有效的組合(operativecombinations)被認為是提供了治療性組合，所述治療性組合所需要的各抗病毒試劑組分的總劑量與當單獨地使用各單個治療性化合物或藥物時所需要的劑量相比更低，從而減少了不良作用。盡管可以單獨地施用所述試劑，但優(yōu)選地以藥物制劑的形式提供其，所述藥物制劑包含至少一種上面定義的活性成分以及為此的一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和任選地其他治療劑。各載體在與制劑的其他組分相容的意義上必須是"可接受的"，并且對患者無害。制劑包括適合于口服、直腸、鼻、局部(包括經(jīng)皮、頰和舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))和肺施用的那些制劑。制劑可以以單位劑型方便地提供，和可通過藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。這些方法包括使活性成分與構(gòu)成一種或多種配合劑的載體相聯(lián)合的步驟。一般地，通過如下方式來制備所述制劑使活性成分均勻且緊密地與液體載體或細分的固體載體或兩者相聯(lián)合，然后如果需要，對產(chǎn)品塑形。適合于口服施用的本發(fā)明的制劑可以提供為分開的單位例如膠嚢劑、扁嚢劑或片劑，各自包含預(yù)定量的活性成分；粉劑或顆粒劑；在水性或非水性液體中的溶液或懸浮劑；或者水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑。還可以大丸劑、藥糖劑或糊劑的形式提供所述活性成分?？赏ㄟ^任選地與一種或多種配合劑一起壓制或模制來制備片劑?？赏ㄟ^在合適的機器中壓制活性成分來制備壓制片劑，所述活性成分以自由流動的形式例如粉末或顆粒的形式存在，并任選地與粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥丙基曱基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如，淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)的羧曱基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。可通過在合適的機器中對用惰性液體稀釋劑濕潤的粉狀化合物的混合物進行模制來制備模制的片劑。所述片劑任選地可進行包衣或劃痕，并且可用例如羥丙基甲基纖維素以不同的比例進行配制以提供所需的釋放特性，從而提供此處的活性成分的緩釋或控釋。任選地，可給片劑提供腸溶衣以在腸中而不是在胃中提供釋放。適合于在口中局部施用的制劑包括包含有在調(diào)味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的活性成分的錠劑；包含有在惰性基質(zhì)例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的活性成分的軟錠劑；和包含有在合適的液體載體中的活性成分的漱口劑。本發(fā)明的用于局部施用的藥物組合物可配制為軟骨劑、乳青劑、懸浮液、洗劑、粉劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油。備選地，制劑可包含浸漬有活性成分和任選地一種或多種賦形劑或稀釋劑的貼布或敷料例如繃帶或粘附性硬骨。如果想要，乳青基質(zhì)的水相可包含例如至少大約30%w/w的多元醇，即具有兩個或更多個羥基的醇，例如丙二醇、丁烷-1，3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及其混合物。如果希望，局部制劑可包含增強所述試劑通過皮膚或其他受影響區(qū)域的吸收或滲透的化合物。這些皮膚滲透增強劑的實例包括二甲亞砜和相關(guān)的類似物。本發(fā)明的乳劑的油相可以已知方式從已知的成分構(gòu)成。盡管該相可以只包含乳化劑，但如果希望其可包含至少一種乳化劑與脂肪或油或者與脂肪和油兩者的混合物。優(yōu)選地，將親水性乳化劑與用作穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑包含在一起。包含油和脂肪兩者也是優(yōu)選的?？傊哂谢虿痪哂蟹€(wěn)定劑的乳化劑組成了所謂的乳化蠟，所述蠟與油和/或脂肪組成了所謂的乳化軟青基質(zhì)，其形成了乳膏制劑的油分散相。適合于在本發(fā)明的制劑中使用的乳化劑和乳化穩(wěn)定劑包括Tween60、Span80、十八醇十六醇混合物(cetostearylalcohol)、十四醇、單硬脂酸甘油酯和月桂基石克酸鈉。合適于所述制劑的油或脂肪的選擇基于獲得想要的化妝品性質(zhì)，因為活性化合物在大多數(shù)可能用于藥物乳劑制劑的油中的溶解度非常低。因此，乳膏優(yōu)選地應(yīng)當是非油脂性的(non-greasy)、非染色性的(non-staining)和可洗滌的產(chǎn)品，其具有合適的稠度以避免從管或其他容器中滲漏?？墒褂弥辨溁蛑Щ?、一或二堿價的烷基酯例如二異己二酸酯、硬脂酸異十六醇酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己基酯或稱為CrodamolCAP的支化鏈酯的混合物，最后三種是優(yōu)選的酯。依賴于所需要的特性，可單獨地或組合地使用這些酯。備選地，可使用高熔點脂質(zhì)，例如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其他礦物油。適合于給眼睛局部施用的制劑還包括滴眼劑，其中所述活性成分溶解在或懸浮在合適的栽體(特別是用于所述試劑的水性溶劑)中?？梢砸跃哂泻线m的基質(zhì)(包含例如可可脂或水楊酸酯)的栓劑形式提供用于直腸施用的制劑?？梢砸猿怂鲈噭┩膺€包含本領(lǐng)域已知為合適的載體的塞劑、棉塞、乳骨、凝膠、糊劑、泡沫劑或噴霧劑制劑的形式提供適合用于陰道施用的制劑。適合用于鼻施用的制劑(其中所述載體是固體)包括具有例如大約20至大約500微米的顆粒大小的粗粉劑，其以這樣的方式進行施用，即其中采用鼻吸法，也就是通過從拿近鼻子的粉劑容器中經(jīng)鼻道快速吸入。其中載體是液體的并且適合于以例如鼻腔噴霧劑、滴鼻劑的形式施用或通過噴霧器以氣霧劑施用的制劑包括所述試劑的水溶液或油溶液。適合用于腸胃外施用的制劑包括，水性和非水性等滲無菌注射液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑和使制劑與所希望的接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增稠劑和脂質(zhì)體或被設(shè)計成將所述化合物靼向血液組分或一個或多個器官的其他微粒系統(tǒng)。所述制劑可以在單位劑量或多劑量的封閉的容器例如安瓿和小瓶中提供，并且可以在冷凍干燥的(凍干的)條件下貯存，在即將使用前只需要加入無菌液體載體例如注射用水?？蓮那懊嫠鲱愋偷臒o菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨時注射溶液和懸浮液。優(yōu)選的單位劑量制劑是包含試劑的日劑量或單位、日亞劑量(如此處上面所述的)或其合適的部分的制劑。轉(zhuǎn)基因動物在另一個方面，目的基因可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物模型。近年來，遺傳學(xué)家已成功地通過操作正在發(fā)育的胚胎的基因并將外源基因?qū)脒@些胚胎中而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動物例如小鼠。一旦將這些基因整合入接受者胚胎的基因組中，就可分析所得的胚胎或成年動物以確定所述基因的功能。產(chǎn)生突變體動物以了解已知基因在體內(nèi)的功能和建立人類疾病的動物模型。(參見例如，Chisaka等人(1992)355:516-520;Joyner等人(1992)，P0STIMPLANTATI0NDEVELOPMENTINTHEMOUSE(Chadwick和Marsh,編者，JohnWiley&Sons,UnitedKingdom)pp:277-297;Dorin等人(1992)Nature359:211-215)。美國專利號5，464，764和5，487，992描述了一種類型的轉(zhuǎn)基因動物，在所述轉(zhuǎn)基因動物中對目的基因進行足以破壞其功能的缺失或突變。(也可參見，美國專利號5，631，153和5，627，059)。這些通過利用同源重組的現(xiàn)象產(chǎn)生的"敲除，，動物可用于研究特定基因序列在體內(nèi)的功能。此處描述的多核苷酸序列可用于制備肺癌的動物模型。實驗方法實驗l:表達分析非小細胞肺癌總體上代表了巨大的未滿足的醫(yī)學(xué)需要。從無傳染性疾病的個體患者中獲得新鮮的未壞死的NSCLC腫瘤組織和相應(yīng)的正常組織。新鮮組織樣品是至少1.5克的組織，其從手術(shù)后在濕冰上運輸不超過24小時。在分析之前，由病理學(xué)家就百分比腫瘤含量、腫瘤階段和組織學(xué)類型對該組織進行評估。所有接受的組織是I、II或IIIa期原發(fā)性肺癌，其中手術(shù)是最初或初級處理。在收到組織后，用十字形手術(shù)刀將樣品(組織)切碎。用膠原酶和彈性蛋白酶處理切碎的組織直到獲得單細胞懸浮液。洗滌單細胞懸浮液數(shù)次，并裂解紅細胞。通過將細胞懸浮液暴露于連接至磁珠的抗CD64、CD45和CD14的抗體來除去白細胞。使用連接至石茲珠的抗BerEP4抗體來分離上皮細胞。使用連接至磁珠的抗CD31抗體來分離內(nèi)皮細胞。立即從上皮細胞和內(nèi)皮細胞樣品制備RNA。通過對于所述細胞類型來說的特異性標記的表達來總體上估計來自上皮和內(nèi)皮細胞的RM的性質(zhì)。細胞角蛋白18、馮維勒布蘭德因子、EF1、P1H12、hevin和細胞角蛋白8用作標記以用于確定所收集的RNA是否代表相對純的上皮細胞或內(nèi)皮細胞的細胞群體。在RNA的性質(zhì)評估后，4份鱗癌樣品、2份腺癌樣品和3份正常肺組織樣品在數(shù)量和性質(zhì)上足以進行SAGE分析。使用NatureBiotechnology(2002)20:508-512中公開的方法對9個RNA樣品進^f于LongSAGETM直至對于每個文庫大約50，000個標簽的深度。進行徹底的生物信息學(xué)分析以表征SAGE數(shù)據(jù)，基于在腫瘤類型間和在鱗癌和腺癌中mRNA的表達與正常肺細胞相比增加。對于潛在的抗體治療靶，焦點集中于在質(zhì)膜中表達的蛋白質(zhì)上。GITR，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)蛋白，已知由激活的T細胞和Treg細胞表達。GITR也稱為激活誘導(dǎo)型TNRF家族受體(AITR)和胂瘤壞死因子受體超家族成員18(TNFRSF-18)(Stephens,G.L.等人(2004)J.Immunol.173:5008-5020和Nocentini，G.等人(1997)P.N.A.S.94:6216-6221)。GITR配體結(jié)合GITR并通過TRAF2引發(fā)NF-kB激活。GITR-GITR配體相互作用在T細胞中破壞了TCR-CD3激活誘導(dǎo)的凋亡，并且可能參與了細胞存活。GITR配體也稱作AITRL、GITRL、TL6和hGIRTL。GITR是^U人為與4-1BB和CD27相似的228個氨基酸的跨膜蛋白。GITR蛋白具有19個氨基酸的信號序列、134個氨基酸的具有3個富含半胱氨酸的基元的細胞外區(qū)域、23個氨基酸的跨膜區(qū)段和52個氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GITR配體由內(nèi)皮細胞(包括HUVEC)、Bl淋巴細胞、成熟和未成熟的樹突狀細胞和巨噬細胞表達(Stephens,G.等人(2004)見上)。GITR參與T-淋巴細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用以及T-細胞受體介導(dǎo)的細胞死亡的調(diào)控。GITR通過TRAF2/NIK途徑介導(dǎo)NF-kB的激活。GITR結(jié)合TNF受體關(guān)聯(lián)因子-l(TNFreceptor-associatedfactor-l，TRAF1)、TRAF2和TRAF3，但不結(jié)合TRAF5和TRAF6(Nocentini,G.等人(1997)見上)。GITR在CD4+CD25+T細胞上表達，并且在與GITRL相互作用后下調(diào)T調(diào)節(jié)性抑制物活性。耙向腫瘤細胞上的GITR和耗盡CD4+CD25+T細胞可增強活性腫瘤特異性療法的功效(Kohm，A.P.等人(20(J4)J.Immunol.172:4686-4690，和Shimizu，J.等人(2002)NatureImmunol.3:135-142)。來自55個肺腫瘤和18個正常肺組織的大量組織RNA的RT-PCR表明，與正常組織相比，在76%的腫瘤中GITRRNA的水平增加^2倍。根據(jù)RT-PCR，GITR在多種正常組織包括乳腺、前列腺、腦、心、腎、肝、唾液腺、脾、胃、胸腺和子宮中具有非常最低限度的表達。來自多種腫瘤和相應(yīng)的正常組織的大量組織RM的RT-PCR表明，在50°/。的卵巢癌(n=40)、25%的黑素瘤(n=22)、50%的前列腺癌(n=24)、20%的結(jié)腸癌(n=26)和66%的乳腺癌(n=23)中GITRRNA的水平增力口>2倍。對經(jīng)福爾馬林固定并經(jīng)石蠟包埋的人非小細胞肺癌樣本進行免疫組織化學(xué)分析。所用的抗體是抗GITR(ResearchSystems,BA689)、抗RDC1(Lifescience，RDC1-LP1439)、抗CD31(DAKO，M0823)、抗ot-平滑肌肌動蛋白(DAKO,M0851)、抗上皮膜抗原(DAKO，M0804)和抗廣譜細胞角蛋白(DAKO,Z0622)的抗體?？偟卣f來，在肺的腺癌和鱗癌兩者的腫瘤細胞上存在強的GITR反應(yīng)性。在肺的腺癌和鱗癌兩者的腫瘤基質(zhì)內(nèi)的浸潤性細胞上也存在強反應(yīng)性。在肺的腺癌和鱗癌兩者的肺瘤細胞上存在強的RDC1反應(yīng)性。在與腫瘤脈管相關(guān)聯(lián)的內(nèi)皮細胞和周細胞/平滑肌細胞上存在中度的RDC1反應(yīng)性。通過熒光激活細胞計量術(shù)(FACS)，NCI-H358和NCI-H1436細胞系具有非常好的GITR的表達，NCI-H1299、NCI-H522、NCI-H23和NCI-H647具有好的GITR的表達。通過FACS，在激活的PBMC和激活的CD3+T細胞上的GITR的表達比在非小細胞肺癌細胞系上的表達低得多。實驗2:功能性生物測定在產(chǎn)生后，使用基于細胞的測定法來篩選抗體組，以通過使用本領(lǐng)域中已知的方法來鑒定中和所述靶蛋白的功能和逆轉(zhuǎn)惡性表型的抗體。為了舉例說明，這些方法描述于Stanton，C.A.等人(2004)Blood103(2):601-606和Malinda，K.M.等人(1999)Exp.CellRes.250:168-173(遷移測定法);美國專利申請2004/0253708A1的第段至第段(凋亡)；美國專利申請2004/0258685A1的第段至第段(抑制、抗增殖、阻斷和表位結(jié)合測定法)；Stanton，C.A.等人(2GQ4)(見上)(增殖和細胞毒性測定法)；Manches，0.等人(2003)Blood101(3):949-954(凋亡、吞噬和ADCC測定法)；和美國專利申請2004/0228859A1的第段(CDC測定法)。實驗3:體內(nèi)功效然后，使用同系基因型腫瘤模型或人腫瘤異種移植模型，就體內(nèi)功效進一步篩選具有例如在實驗2中描述的必需生物活性的抗體。這樣的測定法和模型對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。為了舉例說明，這些方法描述于TumorModelsinCancerResearch,Teicher，B.A.，編者，叢書CancerDrugDiscoveryandDevelopment,HumanaPress,2004;和Lev.A.等人(2004)PNAS101(24):9051-9056。盡管上述實驗和詳細描述是關(guān)于針對NSCLC的應(yīng)用進行描述的，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當明顯的是，本發(fā)明的方法和組合物與表1中鑒定的其他癌癥相關(guān)。因此，本發(fā)明也提供了用于診斷和預(yù)后這些惡性腫瘤的方法和組合物。要理解，雖然已結(jié)合上述實施方案描述了本發(fā)明，但是前面的描述和后面的實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點和改變對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說將會是明顯的。序列列表SEQIDNO:11atggcacagc:61gcgctcagcc121cttgggacgg*181tacccgggcg*241tgcggagacc301cagtcccagg"361tccgggggcc421actgtgttcc481gagccgcttg541acctcggccc601gtgccgccgt661cgatcggcagtgggtcagcggaacggacgcaggagtgctgcttgctgcacacgaaggccactggga^caaggt犯ctgacagcttggactaggagaaggggggcgcgtttccccaccggggcgctgctgcttccgagtgggacctgccggttttggcttcctgcaaacctcg"tcgtcctcgcacatctggcgccagaagcgcggctgggacgggccctgtggtcccgggtcgggttcacagactgcatgi:caccacccttcagtgtatcgtggacagactgctgtgtgcgctggccgtggcagctgaggatgccagttccgacctgtggggcggcctggcgcggccctggcgacgcgctggtgtccagccgtcccccaggactgtgcctc.gcacccagtttcccagggtcccgcc仁gcgrtagacccagctccgaggaagatgtgagctgctgtgcgcgcctcctgctgccgcgattgaattccacccagggggtacccgccggcacctcctcctggctgctggag9"cggggcgagSEQIDNO:2ARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVHscTFT:3G,:pwQpG朋旭RpTGFFTGpNMQGcc權(quán)利要求1.用于診斷或預(yù)后癌癥的方法，所述癌癥選自非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，所述方法包括檢測在受試者中于表1中所鑒定的基因或基因產(chǎn)物或者其片段的表達水平，其中基因或基因產(chǎn)物的過表達是受試者中所述癌癥的預(yù)測性的陽性診斷或預(yù)后。2.權(quán)利要求1的方法，其中通過免疫化學(xué)方法測定所述基因或基因產(chǎn)物或者其片段的表達水平。3.權(quán)利要求2的方法，其中使用抗體通過免疫化學(xué)方法測定所述基因或基因產(chǎn)物或者其片段的表達水平。4.權(quán)利要求1的方法，其中使用單克隆抗體、其變體或衍生物通其中對從受試者分離的合適的樣品進行檢5.權(quán)利要求1的方法，其中通過使用抗體測定所述基因或基因產(chǎn)物或者其片段的表達水平，所述抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、抗體變體、抗體衍生物、人源化抗體和抗體片段。6.權(quán)利要求1的方法，其中通過檢測多核苷酸的量來測定所述基因或基因產(chǎn)物的表達水平。7.權(quán)利要求1的方法，測。8.權(quán)利要求7的方法，組織活檢樣品或體液樣品。9.權(quán)利要求7的方法，血清的體液的樣品。10.權(quán)利要求6的方法，其中所述合適的樣品是保存的組織樣品。其中所述合適的樣品是選自尿液、血液和其中所述多核苦酸選自mRNA和cDNA。全文摘要本發(fā)明提供了用于檢測、診斷、預(yù)后和監(jiān)控癌癥的進展的方法和組合物以及用于所述方法的試劑盒，所述癌癥是例如NSCLC，上皮來源的癌癥，例如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，以及惡性腫瘤。還提供了用于篩選以鑒定與這些癌癥和惡性腫瘤相關(guān)的抗原的激動劑和拮抗劑的方法。文檔編號G01N33/53GK101133167SQ200680006891公開日2008年2月27日申請日期2006年1月19日優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日發(fā)明者B·泰歇,B·羅伯茨,S·尚卡拉申請人:根茨美公司