專利名稱：Cd146及其抗體診斷和治療自身免疫病等炎癥性疾病的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫診斷和生物治療領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及CD146分子及其抗體在診斷和治療炎癥性疾病的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及的CD146單克隆抗體AA98及其功能形式的功能在于能夠阻斷自身免疫性細(xì)胞及炎癥性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移及穿越到組織部位，進(jìn)而阻斷自身免疫性細(xì)胞及炎癥細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及相關(guān)組織的殺傷，從而延緩并阻斷自身免疫性疾病及炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)是一種累及大腦和脊髓的自身免疫性疾病，也是一種炎癥性疾病，可引起神經(jīng)脫髓鞘和軸突損傷。目前認(rèn)為，活化的淋巴細(xì)胞越過(guò)血腦屏障是MS炎性損傷的早期重要步驟?；罨难仔约?xì)胞穿過(guò)功能失常的血腦屏障，浸 潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起脫髓鞘和其它炎性損傷。正常情況下，血腦屏障對(duì)炎性細(xì)胞的通透性低，極少或很少有炎性細(xì)胞進(jìn)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但在多發(fā)性硬化癥中，血腦屏障功能失調(diào)，其通透性在炎性因子的刺激下大大增加，導(dǎo)致炎性細(xì)胞輕易進(jìn)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起炎性損傷。因此，血腦屏障的通透性在這一過(guò)程中扮演著重要的角色。大量研究報(bào)道，粘附分子對(duì)血腦屏障的通透性起著重要的調(diào)節(jié)作用，如ICAM-1、整聯(lián)蛋白(integrin)等等。已有的研究報(bào)道，α 4 β I整聯(lián)蛋白是一種淋巴細(xì)胞表面膜分子，其配體VCAM-I在大腦和脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移，阻斷α4β I整聯(lián)蛋白與VCAM-I的相互作用可以減輕MS的炎性損傷。那他珠單抗(Natalizumab)(抗_α4β I整聯(lián)蛋白)是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療MS的單克隆抗體。它通過(guò)阻斷白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附從而減少白細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)而延緩MS的發(fā)展。目前，阻斷炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移已經(jīng)成為治療MS及其它炎癥性疾病的新方法。目前臨床上治療MS主要是糖皮質(zhì)激素類藥物，這類藥物有明顯的抗炎效果和免疫抑制功能，然而其廣泛的副作用限制了它的使用，如腎上腺功能抑制，心血管功能失調(diào)等。另外使用較為普遍的是生物類制劑，諸如多種單克隆抗體的使用。除了那他珠單抗(抗_α4β1整聯(lián)蛋白)外，目前已在臨床上使用或進(jìn)入臨床試驗(yàn)的單克隆抗體還有利妥昔單抗(Rituximab)(抗-0)20),阿侖單抗(Alemtuzumab)(抗-0)52),達(dá)克珠單抗(Daclizumab)(抗-IL2R)，這些均是針對(duì)免疫細(xì)胞本身的抗體，這些抗體直接導(dǎo)致的副作用主要是免疫細(xì)胞的功能缺陷，進(jìn)而引起其他免疫相關(guān)的疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次提出CD146是包括自身免疫疾病等炎癥性疾病的新靶標(biāo)，抗CD146抗體是治療這類疾病的新型靶向藥物。與糖皮質(zhì)激素類藥物相比，抗CD146抗體的副作用小，不會(huì)引起全身范圍的免疫功能的損傷。CD146及其抗體在包括自身免疫疾病等炎癥性疾病診斷和治療中的應(yīng)用是基于以下重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)(I)可溶性CD146在多發(fā)性硬化癥病人的腦脊液中顯著增加。(2)細(xì)胞粘附分子CD146在人和小鼠的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)，能被TNF-α和IFN-Y等炎性因子誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；(3)⑶146在許多炎癥疾病的血管內(nèi)皮上過(guò)度表達(dá)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織的新生血管、動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)膜層新生血管和炎癥性腸病的新生血管上都可以檢測(cè)到⑶146的過(guò)度表達(dá)；(4)血管內(nèi)皮細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)的CD146與發(fā)病機(jī)制相關(guān)，在介導(dǎo)淋巴細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮屏障起著重要的作用；(5)在MS的小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmuneencephalomyelitis, EAE)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)抗⑶146抗體AA98顯著減緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠的發(fā)病和癥狀。機(jī)理研究表明，CD146抗體能夠阻止炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少神經(jīng)軸突損傷點(diǎn)和損傷面積；(6)CD146抗體同樣能夠治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis, RA),減緩疾病進(jìn)展,減輕關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)損傷。CD146在調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移方面起著重要的作用。我們自主研制的抗CD146功能性單抗AA98在體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)遷移測(cè)定中能較好地抑制活化淋巴細(xì)胞穿越腦血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的單層細(xì)胞層。因此，我們認(rèn)為血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上 CD146可能作為一種靶標(biāo)，其抗體AA98可以阻斷炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而進(jìn)一步阻斷炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致脫髓鞘性損傷。抗CD146抗體可應(yīng)用于MS的診斷和治療。相似的，CD146也可以作為其他炎癥性疾病診斷和治療的新靶標(biāo)，抗CD146抗體可以阻斷炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，以及阻斷炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到局部組織引起炎癥損傷。該種抗體的特異性較好，不會(huì)引起全身范圍的免疫功能性的損傷。因此，本發(fā)明一方面涉及CD146在制備用于診斷和/或治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明再一方面涉及抗CD146的抗體或該抗體的功能形式在制備用于診斷和/或治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，炎癥性疾病可以是自身免疫疾病。在本發(fā)明中，炎癥性疾病可包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性腹膜炎、動(dòng)脈粥樣硬化。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，診斷和/或治療炎癥性疾病是多發(fā)性硬化癥。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，診斷和/或治療炎癥性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，診斷和/或治療炎癥性疾病是急性腹膜炎。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，診斷和/或治療炎癥性疾病是動(dòng)脈粥樣硬化。在本發(fā)明中，抗CD146的抗體或該抗體的功能形式可包括抗CD146的單克隆抗體、基因工程抗體和人源化抗體。在本發(fā)明中，抗CD146的抗體或該抗體的功能形式是抗CD146的抗體的功能耦合物，其中與抗體結(jié)合的物質(zhì)可以是藥物、毒素、放射活性劑、酶、細(xì)胞因子或另一種抗體。在本發(fā)明中，抗⑶146的抗體優(yōu)選地是單克隆抗體AA98。本發(fā)明又一方面涉及CD146或抗CD146的抗體或該抗體的功能形式在制備診斷多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用，其特征在于檢測(cè)受試者腦脊液中可溶性CD146的水平。在本發(fā)明的這一方面，藥物可制備成試劑盒的形式。本發(fā)明又一方面涉及抗CD146的抗體或該抗體的功能形式在制備用于人體炎癥細(xì)胞和血管損傷定位以及導(dǎo)向治療的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述抗CD146的抗體或該抗體的功能形式包括抗CD146的單克隆抗體、基因工程抗體和人源化抗體。更優(yōu)選地，所述抗⑶146的抗體是單克隆抗體AA98。為了更全面地理解和應(yīng)用本發(fā)明，提供下列實(shí)施例。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖I.臨床標(biāo)本多發(fā)性硬化癥病人腦脊液中可溶性CD146顯著增加(病人VS正常0. 31 ±0. 206nM vs O. 04±0· 047ηΜ, ρ < O. 0001)。圖2.臨床標(biāo)本多發(fā)性硬化癥病人血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上⑶146分子過(guò)度表達(dá)，在正常人血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞低表達(dá)。(⑶31為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子)。圖3.⑶146的表達(dá)，其中，A :正常小鼠脊髓組織血管上⑶146低表達(dá)，而B(niǎo) :小鼠多 發(fā)性硬化癥脊髓組織血管上皮⑶146高表達(dá)。圖4.⑶146的表達(dá)，其中，A-B :正常的大鼠關(guān)節(jié)組織血管上⑶146較少，而C-F :大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織的新生血管上高表達(dá)⑶146。圖5.臨床標(biāo)本免疫組化顯示,其中，A :正常人頸動(dòng)脈的內(nèi)膜上⑶146低表達(dá)(抗體ΑΑ4)，B :動(dòng)脈粥樣硬化頸動(dòng)脈的內(nèi)膜上⑶146高表達(dá)。圖6.臨床標(biāo)本免疫組化顯示，⑶146 (抗體-ΛΑ4)在動(dòng)脈粥樣硬化頸動(dòng)脈外膜區(qū)的
新生血管上高表達(dá)。圖7.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α能夠明顯增加白細(xì)胞的遷移，抗⑶146抗體AA98 (50 μ g/ml)顯著抑制人外周血白細(xì)胞(包括⑶3+，⑶4+，⑶8+，⑶19+等)穿越血腦內(nèi)
皮屏障。圖8.抗⑶146抗體AA98顯著減輕多發(fā)性硬化癥模型小鼠的A，平均臨床評(píng)分和C，嚴(yán)重程度，減緩發(fā)病時(shí)間但不影響B(tài)，疾病的發(fā)病率。圖9.抗 CD146 抗體 AA98 顯著抑制炎癥細(xì)胞(包括 CD45+，CD4+，CD8+，CD19+，F(xiàn)4/80+及Gr-Γ細(xì)胞)在多發(fā)性硬化癥模型小鼠脊髓組織中的浸潤(rùn)，其中A :免疫組化；B :統(tǒng)計(jì)結(jié)
果O圖10.抗⑶146抗體AA98顯著減少多發(fā)性硬化癥小鼠脊髓髓鞘神經(jīng)軸突的損傷，其中A :免疫組化；B :統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一可溶性CD146在多發(fā)性硬化癥病人的腦脊液中顯著增加粘附分子在炎性因子的刺激下可以從內(nèi)皮細(xì)胞上脫落下來(lái)，為了檢測(cè)腦脊液中可溶性CD146水平與多發(fā)性硬化癥的關(guān)系，我們用ELISA的方法發(fā)現(xiàn)檢測(cè)了多發(fā)性硬化癥病人與正常人腦脊液中可溶性CD146，我們發(fā)現(xiàn)可溶性CD146在多發(fā)性硬化癥病人腦脊液中顯著增加。主要材料活動(dòng)期多發(fā)性硬化癥病人的腦脊液(26例)，正常人腦脊液(22例)，本說(shuō)明書(shū)中使用的抗體AA98、AA4、AAl等可根據(jù)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9107586. 2、中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00810057260. 7的描述獲得。主要試劑0. 02M PB (pH 7. 25)，抗CD146抗體AAl，生物素標(biāo)記的抗CD 146抗體AA98，鏈親和素-HRP，TMB 底物(200ng/ml TMB,O. 03% H2O2, ρΗ4· 5)主要方法I)將抗體 AAl 以 O. 02Μ PB (pH 7. 25)稀釋至 I μ g/ml，50 μ I/孔加入 96 孔板，4°C
包被過(guò)夜。2)每孔加入200 μ I 2% BSA室溫封閉2h。3)每孔加入病人或正常人腦脊液樣品50 μ I/孔，室溫孵育2h。PBST洗5次，洗去非特異性結(jié)合。4)檢測(cè)抗體生物素標(biāo)記的AA98以2 % BSA/PB稀釋至O. 5 μ g/ml，50ml/孔室溫孵育2h。 5)洗去抗體，加入合適濃度的鏈親和素-HR，50 μ I/孔，室溫孵育lh。6)洗去抗體，用 TMB 底物(200ng/ml TMB,O. 03% H202, ρΗ4· 5)顯色，硫酸終止，450nm讀數(shù)。結(jié)果顯示(圖I):多發(fā)性硬化癥病人腦脊液中的可溶性⑶146顯著高于正常人腦脊液水平(O. 31 ±0. 206nM vs O. 04±0· 047ηΜ, ρ < O. 0001)，腦脊液中可溶性 CD 146 高于
O.134ηΜ可認(rèn)為是異常的。實(shí)施例ニ ⑶146在炎癥性疾病新生血管上過(guò)度表達(dá)在慢性炎癥疾病中，血管新生是ー個(gè)重要的病理過(guò)程，大量的粘附分子均涉及到血管新生這ー過(guò)程。⑶146是ー個(gè)重要的血管生成相關(guān)的粘附分子，我們?cè)诙喾N炎癥性疾病組織中均觀察到⑶146的高表達(dá)。主要材料多發(fā)性硬化癥模型小鼠的脊髄組織，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)炎組織。臨床標(biāo)本來(lái)自于正常人及多發(fā)性硬化癥病人腦組織，人的動(dòng)脈粥樣硬化癥剝脫內(nèi)膜組織主要試劑0CT，4%多聚甲醛，ニ甲苯，無(wú)水こ醇，無(wú)水甲醇，過(guò)氧化氫，PBS，抗⑶146抗體(兔抗⑶146，小鼠抗⑶146單克隆抗體AA4)主要方法(I)冰凍切片制作用OCT直接包埋多發(fā)性硬化癥小鼠的脊髄組織、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)炎組織及人的動(dòng)脈粥樣硬化癥剝脫內(nèi)膜組織，凍于-80°C冰箱；
(2)石蠟切片制作用4%多聚甲醛固定新鮮組織24小時(shí)后，石蠟包埋，以下為石蠟切片的免疫組化過(guò)程I)取出片子，入ニ甲苯溶液37°C脫蠟兩次，毎次30分鐘；2)入無(wú)水こ醇X 2-95% -80% -70% -50% -30%和蒸餾水中水化，室溫每次5分鐘；3) O. 3%過(guò)氧化氫/甲醇溶液37°C避光處理30分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS洗三次；4)pH6. O檸檬酸修復(fù)液100°C水浴30分鐘抗原熱修復(fù)，自然冷卻；5) 5%的正常羊血清37°C封閉I小時(shí)；5)加入PBS稀釋的ー抗(兔抗⑶146多抗或AA4)，4°C孵育過(guò)夜；6)PBS洗三次；山羊杭-免-生物素或山羊-杭-小鼠-生物素ニ抗(I 1000)在37°C孵育I小時(shí)，PBS洗三次；7)親和素-HRP(1 1000)在 37°C孵育 45 分鐘；
7)用現(xiàn)配的DAB避光顯色2_7分鐘，再進(jìn)行蘇木素復(fù)染。8)逐級(jí)脫水50-70-80-90-100-100%こ醇-ニ甲苯，晾干，中性樹(shù)脂封片。9)顯微成像系統(tǒng)中拍片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-6所示，無(wú)論是臨床標(biāo)本(多發(fā)性硬化癥病人腦組織和人的動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)膜組織)，還是動(dòng)物模型(多發(fā)性硬化癥小鼠脊髄組織和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織)，我們都觀察到⑶146分子在炎癥部位的新生血管上過(guò)度表達(dá)。實(shí)施例三CD146抗體抑制炎性細(xì)胞穿越人血腦屏障炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)在炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著非常重要的作用，這些炎癥性細(xì)胞主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞等等。這些細(xì)胞在組織局部發(fā)揮著抗炎和致炎作用。組織的損傷主要是由于其致炎作用引起的。阻斷炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)對(duì)緩解組織的損傷有重要的作用。炎性細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)涉及大量粘附分子的調(diào)節(jié)。CD146 在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的高表達(dá)對(duì)炎性細(xì)胞的粘附和滾動(dòng)以及遷移起著非常重要的作用?？耿?46抗體AA98可以在很大程度上抑制⑶146對(duì)炎性細(xì)胞遷移的作用。/Vv/.用 Transwell 技術(shù)(Leukocyte transmigration through vascularendothelium. An in vitro method. Allavena P，Del Maschio A. Methods Mol Biol. 1999 ；96 :171-6)，我們檢測(cè)了 CD146抗體AA98在對(duì)炎性細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的作用。該技術(shù)簡(jiǎn)述如下將人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞鋪于96孔transwell孔上室內(nèi)，培養(yǎng)在5%血清的培養(yǎng)基中，孵育24小時(shí)，讓其形成緊密的單層細(xì)胞(人工血腦屏障)。之后，在下室加入10%血清的培養(yǎng)基。在上室加入人外周血淋巴細(xì)胞，每孔2 X IO4個(gè)，同時(shí)加入抗體(mlgG或AA98)，每孔50yg/ml。每組各3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10小時(shí)后，收集下室穿越的淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析各個(gè)淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目。另外，我們還觀察了細(xì)胞因子TNF-α (每孔50ng/ml)對(duì)淋巴細(xì)胞穿越血腦屏障的影響以及CD146抗體的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，TNF-α能夠增加血腦屏障的滲透性，促進(jìn)炎性細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞層(包括⑶3+，⑶4+，⑶8+Τ細(xì)胞及⑶19+Β細(xì)胞)，與mlgG對(duì)照組相比，⑶146抗體ΑΑ98能明顯降低炎性細(xì)胞對(duì)炎性部位的滲透，抑制率約為總白細(xì)胞35. 5%；CD3 :42. 9%；CD4 37. 5% ;CD8 :66. 3% ;CD19 :39. 9%。實(shí)施例四⑶146抗體治療小鼠多發(fā)性硬化癥多發(fā)性硬化癥的重要病理特征是大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)組織，通過(guò)阻斷炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)可延緩和減輕其癥狀。我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CD146抗體AA98能夠減緩癥狀，治療多發(fā)性硬化癥。實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建小鼠多發(fā)性硬化癥模型(Active induction of experimentalallergic encephalomyelitis. Stromnes IM, Goverman JM. Nat Protoc. 2006 ；I (4)1810-9.)。用抗原肽M0G35-55免疫C57BL/6J小鼠，在免疫后的第7天將小鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組用無(wú)關(guān)抗體mlgG和治療組用⑶146抗體AA98。每組10只小鼠，每只小鼠腹腔注射抗體200 μ g，隔日給藥，總計(jì)四次。隔日觀察小鼠的疾病發(fā)展情況，并對(duì)小鼠的發(fā)病情況進(jìn)行評(píng)分。具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0. 5分尾尖不能卷曲或卷曲無(wú)力I. O分尾部完全下垂2. O分尾部完全下垂，后肢ー只或兩只無(wú)力
3. O分尾部完全下垂，雙后肢癱瘓4. O分尾部完全下垂，雙后肢癱瘓，前肢無(wú)カ5. O分瀕臨死亡觀察至免疫后第25天結(jié)束。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用T-test檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)臨床評(píng)分，我們發(fā)現(xiàn)與mlgG對(duì)照組相比，抗體AA98明顯減輕了小鼠多發(fā)性硬化癥的癥狀與發(fā)展(圖8)。減緩發(fā)病時(shí)間但不影響其發(fā)病率。通過(guò)組化和神經(jīng)軸突特殊染色可以發(fā)現(xiàn)AA98處理組的脊髄組織有較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和較少的神經(jīng)軸突損傷。實(shí)施例五⑶146抗體抑制多發(fā)性硬化癥小鼠機(jī)制研究I—抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn) 為了觀察CD146抗體對(duì)多發(fā)性硬化癥小鼠脊髄組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)的影響，我們建立多發(fā)性硬化癥小鼠模型，分離小鼠的脊髄組織，制成冰凍切片或者石蠟切片，用于免
疫組化。多發(fā)性硬化癥小鼠的脊髄組織中浸潤(rùn)大量炎性細(xì)胞，包括T、B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等
坐寸ο實(shí)驗(yàn)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髄膜炎小鼠脊髓組織中觀察炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，主要是⑶45+細(xì)胞的浸潤(rùn)，包括⑶4+、⑶8+T細(xì)胞、⑶19+B細(xì)胞及Gr-Γ粒細(xì)胞及F4/80+的巨噬細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖9)，與mlgG處理組相比，AA98治療組的脊髄白質(zhì)區(qū)有較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(mlgG vsAA98, Mean土SD) (CD45 :47±17. 2 vs 202. 2±78. I ；CD4 :25±4. 5 vs134±19. 2 ;CD8 :27±8. 5 vs 98. 7± 19. I ;CD19 :29. 3±6. 7 vs 55. 3± 17. 3 ;Gr_l :15±7vs66. 3±24. 2 ；F4/80 :10. 7±6. 2 vs 41. 8±15. 8)。實(shí)施例六CD146抗體抑制多發(fā)性硬化癥小鼠機(jī)制研究II—減少脊髓神經(jīng)軸突的損傷多發(fā)性硬化癥小鼠另ー個(gè)重要的病理特征是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致神經(jīng)軸突的損傷，我們利用Luxol Fast Blue方法檢測(cè)多發(fā)性硬化癥小鼠神經(jīng)軸突的損傷情況。其原理是Luxol Fast Blue染料在こ醇溶液中，能夠內(nèi)與髓鞘磷脂結(jié)合。正常神經(jīng)軸突外包裹著完整的髓鞘，因此染色深，損失后髓鞘被破壞，著色淺。分離抗體治療后小鼠脊髄組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)后石蠟包埋，制成石蠟切片，Luxol Fast Blue染色，具體方法如下I)將切片ニ甲苯溶液37°C脫蠟兩次，毎次10分鐘；2)將切片置入100%こ醇5分鐘、95%こ醇溶液中5分鐘；3) O. I % Luxol Fast Blue 液中56。C 過(guò)夜；4) 95 %こ醇溶液5分鐘；5) 70 %こ醇溶液3分鐘；6)雙蒸水3分鐘；7) O. 05 %碳酸鋰溶液分化I分鐘，70 %こ醇溶液繼續(xù)分化30秒；8)雙蒸水3分鐘；9)鏡下觀察脊髄灰、白質(zhì)分界是否清晰，若分界不清晰，則需重復(fù)(6)、(7)兩步驟，直至分化清晰為止；10)70%こ醇溶液3分鐘；
11)95%こ醇溶液5分鐘；12)常規(guī)脫水透明、中性樹(shù)膠封片。顯微成像系統(tǒng)中拍片。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，與mlgG處理組相比，AA98治療組的小鼠脊髄神經(jīng)軸突損傷點(diǎn)很少(2±1 vs 8. 7 ±0.58)。
權(quán)利要求
1.CD 146或抗CD146的抗體或該抗體的功能形式在制備用于診斷和/或治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述的炎癥性疾病是自身免疫疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其中所述炎癥性疾病包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性腹膜炎、動(dòng)脈粥樣硬化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗CD146的抗體或該抗體的功能形式包括抗CD146的單克隆抗體、基因工程抗體和人源化抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗CD146的抗體或該抗體的功能形式是抗CD146的抗體的功能耦合物，其中與抗體結(jié)合的物質(zhì)可以是藥物、毒素、放射活性劑、酶、細(xì)胞因子或另一種抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗CD146的抗體是單克隆抗體AA98。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用是在制備診斷多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用，其特征在于檢測(cè)受試者腦脊液中可溶性CD146的水平。
8.抗CD146的抗體或該抗體的功能形式在制備用于人體炎癥細(xì)胞和血管損傷定位以及導(dǎo)向治療的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述抗CD146的抗體或該抗體的功能形式包括抗CD 146的單克隆抗體、基因工程抗體和人源化抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其中所述抗CD146的抗體是單克隆抗體AA98。
全文摘要
本發(fā)明涉及CD146及其抗體診斷和治療自身免疫病等炎癥性疾病的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出CD146是包括自身免疫疾病等炎癥性疾病的新靶標(biāo)，抗CD146抗體是治療這類疾病的新型靶向藥物。因此，本發(fā)明提供CD146或抗CD146的抗體或該抗體的功能形式在制備用于診斷和/或治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。CD146抗體治療炎癥性疾病(如多發(fā)性硬化癥)的作用機(jī)理主要是阻斷炎癥性細(xì)胞穿越血腦屏障及其他血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障，進(jìn)而抑制活化淋巴細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘及其他相關(guān)組織的損傷，從而延緩多發(fā)性硬化癥的進(jìn)程和復(fù)發(fā)及相關(guān)組織的損傷，并減輕多發(fā)性硬化的癥狀及相關(guān)炎癥的發(fā)展。與常規(guī)治療自身免疫疾病的糖皮質(zhì)激素類藥物相比，抗CD146抗體的副作用小，不會(huì)引起全身范圍的免疫功能的損傷。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102861331SQ20111018803
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者閻錫蘊(yùn), 羅永挺, 段紅霞, 馮立群, 盧迪, 楊東玲, 馮靜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所