專利名稱：：半定量快速檢測氧化低密度脂蛋白的膠體金試紙條及制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種半定量快速檢測人血漿中氧化低密度脂蛋白(OXLDL)含量的免疫膠體金試紙條。
背景技術：
：心腦血管疾病是導致人類死亡首位原因，而動脈粥樣硬化(As)又是大多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎，故研究動脈硬化的發(fā)病機理、診斷和防治方法已經(jīng)成為醫(yī)學界研究的熱點。流行病學調查和醫(yī)學臨床研究都發(fā)現(xiàn)并證實高脂血癥與動脈粥樣硬化之間存在密切的關系[1]。眾所周知，動脈粥樣硬化最主要的病理學標志是泡沫細胞的形成，而OXLDL又是泡沫細胞形成的關鍵。新近的研究表明，在動脈粥樣硬化的病灶中發(fā)現(xiàn)了OXLDL的沉積，而正常動脈壁中沒有[2，3]，屬AS病灶中的特有成分，血漿OXLDL增高與動脈粥樣硬化性心血管病(ASCVD)的發(fā)生率和死亡率有密切關系。由于OXLDL系As病灶中特有的成份，患者體內的含量遠高于正常人，其濃度與病變范圍成比例，對ASCVD的輔助診斷價值優(yōu)于TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、APO-B(載脂蛋白B)和LP(a)(脂蛋白(a))[4]。臨床上檢測OXLDL的水平，①可間接地反映病人的病變程度.隨著As的發(fā)展，免疫組化顯示OXLDL越來越多地沉積于細胞外基質中，尤其是纖維帽區(qū)及脂質核心、粥樣壞死區(qū)。定量檢測結果也表明在As不同時期OXLDL含量有顯著性差異。病變越到晚期，OXLDL的含量越高。②將有利于動脈硬化性疾病的輔助診斷。對于那些OXLDL值升高而臨床尚未出現(xiàn)心臟血管動脈硬化癥狀者.可起到一定的預警作用[5]。③測定血中氧化型低密度脂蛋白的水平，是抗氧化和抗低密度脂蛋白(LDL)修飾治療的重要依據(jù)，也是治療效果監(jiān)測指標，為預防和治療心臟血管疾病找到了一條新的措施[6]。臨床認為健康人體內OXLDL含量在200-500μg/L之間，當臨床上檢測OXLDL含量大于600ug/L時認為異常[7，8]。由于OXLDL是As病灶中特有的成份，它對ASCVD輔助診斷的特異性要優(yōu)于常規(guī)血脂項目，故OXLDL的檢測對ASCVD的早期輔助診斷具有極其重要的意義。檢測OXLDL的方法很多[9，10]，最常用的方法是采用OXLDL單抗或多抗的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清OXLDL的含量[10，11]。該方法的缺陷是需要專門的儀器設備如酶標儀來配合使用；檢測操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓；操作過程相對比較復雜，檢測所需費用較高，不能實現(xiàn)單人分檢測。隨著疾病診斷向著簡便、快速、靈敏的方向發(fā)展，很多疾病實現(xiàn)了用金標快速診斷試劑進行檢測。但是絕大多數(shù)膠體金試紙條都是定性檢測，沒有實現(xiàn)半定量檢測。半定量快速檢測氧化低密度脂蛋白的膠體金試紙條既具有ELISA酶法的高靈敏度，又具有半定量功能，能夠取代傳統(tǒng)機器檢測定量的地位，大幅降低檢測成本。對于體外快速檢測血漿中氧化低密度脂蛋白的含量是很有意義的。參考文獻1、郭剛等.低密度脂蛋白的分離提純和鑒定.天津醫(yī)學院學報1997年第15卷第1期，16-19.2、YlaHerttualas，PalinskiW，RosenfeldME，etal.Lipoproteinsinnormolandatherosclerosicaorra.EurHeartJ，1990，11[SupplE]88-99.3、BoydHC，GownAM，Wodlbaner，etal.DirectevidenceforaproteinrecognizedbyamonnoclonnalantibodyagainstoxidativelymodifiedLDLinatherosclerosislesionsfromaWatanabeheritablehyperlipidemicrabbits.AmJPathol，1989，136815.4、YlaHerttualaS，PalinskiW，RosenfeldME，etal.Evidenceforthepresenceofoxidativelymodifiedlowdensitylipoproteininatheroscleroticlesionsofrabbitandman.JCIinInvest，1993，841086.5、BoydHC，GownAM，Wodfbaner，etal.DirectevidenceforproteinrecognizedbyamonocolonalantibodyagainstoxidativelymodifiedLDLinatheroselerosislesionsfromawatanableheritablehyperlipidemicrabbits.AmJPathol，1992，36815.6、丁振華.低密度脂蛋白的氧化修飾及其理化、生物學性質的改變.國外醫(yī)學生理、病理學與臨床分冊，1994，14108.7、蘇寶鑫，李淑翠等.動脈硬化患者氧化型低密度脂蛋白的定量研究.江西醫(yī)學檢驗，2000年第18卷第1期，19-20.8、張曉鋼，陳運貞等.血漿氧化低密度脂蛋白測定的臨床價值.臨床心血管病雜志，2002年12月第18卷第12期，613-616.9、楊成玉等.氧化低密度脂蛋白的臨床研究進展.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢測學分冊，2000年第21卷第一期，18-19.10、RifaiN，WarnickGR，DorniniczaxMH.Handbookoflipproteintesting.WashingtonDCAACC，1997，357-372.11、王華梁，王笑利等.雙抗夾心法檢測血漿氧化修飾型低密度脂蛋白.上海醫(yī)學檢驗雜志1994年第9期第三卷，135-136.
發(fā)明內容本發(fā)明的目的就是為了彌補當前檢測技術的不足，提供一種快速、簡便、敏感、經(jīng)濟、特異的、不需要特定儀器設備輔助的氧化低密度脂蛋白金標快速診斷試紙條，并能根據(jù)氧化低密度脂蛋白抗體捕獲抗原的量建立顏色對濃度關系，迅速判定人血漿中OXLDL定性及半定量檢測結果(高于或等于或低于標準對比氧化低密度脂蛋白樣品的濃度)，實現(xiàn)對動脈粥樣硬化性心血管病(ASCVD)的早期輔助診斷。試紙的基本原理和制作和裝配方法參照中國發(fā)明專利申請2005102002271。該試紙的制備裝配方法包括以下步驟(1)選擇所標記單抗最適納米金顆粒大小(5nm～40nm)。(2)將所需金標記蛋白測定最適蛋白標記量。(3)大量制備所選粒度的納米金蛋白溶膠。(4)裁剪層析膜(硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜或玻璃纖維素膜)成規(guī)定大小，中間作0.8～1mm窄縫，要求平行于膜側邊，縫距兩邊等距，縫長10～15mm。(5)固定膜于PVC板，固定海綿吸水端，固定探樣區(qū)海綿吸水墊。(6)點樣在膜的檢測區(qū)和對比質控區(qū)。(7)最后將加入金標蛋白的吸水海綿裝配上PVC板。其具體細節(jié)和具體的制作和裝配方法參照后面的具體實施方式，其式樣參見說明書附圖1。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有突出的優(yōu)點和實用性①親和性好(特異性好、靈敏度高)，準確性高；②穩(wěn)定性好，批內/批間差小，易于質量控制；③以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后的顏色標記；④操作簡便，無需儀器設備，實現(xiàn)半定量檢測；⑤符號顯示結果，自帶質控對照；⑥單體操作，經(jīng)濟實用；⑦擺脫冷鏈，易運輸、儲藏。具體實施例方式實施例一半定量快速檢測氧化低密度脂蛋白的膠體金試紙條的生產(chǎn)方法1、單克隆抗體的制備用OXLDL(購自北京協(xié)和三友科技開發(fā)公司)免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾細胞與小白鼠骨髓瘤細胞雜交融合，制備雜交瘤細胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌OXLDL單克隆抗體的細胞株制備抗OXLDL的單克隆抗體1、2，1、2是針對抗原上不同的抗原決定簇，因此不會彼此結合，并測定單抗的效價。2、膠體金標記單克隆抗體1的方法膠體金與OXLDL單克隆抗體1按一定比例混勻，使膠體金與抗體形成單克隆抗體1-膠體金標記物。選擇OXLDL單克隆抗體1作為金標記抗體，使用檸檬酸鈉還原法制備并測定其最適標記納米金顆粒大小為10nm，7300rpm/min轉速離心25分鐘，制備儲液。將10nm膠體金和標記單抗進行蛋白最適量測定，pH9.0硼酸鹽緩沖液將標記單抗作5～50ug/ml的梯度，加入金儲液后再加入10％NaCl作穩(wěn)定實驗，5分鐘后離心靜止測OD580nm，得光密度穩(wěn)定時得蛋白濃度為12ug/ml。制備好后，加入PEG做成膠體金穩(wěn)定液。3、將金標物噴涂在結合墊上用聚乙二醇洗滌膠體金復合物，離心除去上清液，得深紅色沉淀。純化后的沉淀(即OXLDL單克隆抗體1-膠體金標記物)用緩沖液溶解，將標記好的金標抗體用1cm寬1.5cm長0.08cm厚度的無菌吸水海綿吸附做成膠體金標記物墊，真空抽干。4、硝酸纖維素膜的包被用純化后制備成精確濃度的OXLDL單克隆抗體2溶液用特制的噴涂設備于硝酸纖維素膜上畫線，線的寬度為1～1.5mm，包被好的硝酸纖維素膜用10％BSA溶液噴涂進行封閉。制取選取0.22um的無菌硝酸纖維素薄膜，裁剪成1cm寬，5cm長的矩形條，中間作0.8～1mm窄縫，要求平行于膜側邊，縫距兩邊等距，縫長10～15mm。檢測區(qū)條帶距膜探樣端2.2cm，處于窄縫中間位置。檢測帶噴涂6ug/ml的OXLDL單克隆抗體2，半定量質控帶涂0.6ug/ml的OXLDL，兩條帶長0.2cm，寬0.05cm。4℃黑暗環(huán)境，CO2緩慢吹干。5、試紙條的裝配試紙條由樣品墊，結合墊，硝酸纖維素膜，吸水墊和PVC背襯組成。分為4個部分探樣區(qū)，標記物結合區(qū)，對比檢測區(qū)，吸水區(qū)。對比檢測區(qū)中間有一縱向的狹縫，分為左邊的測試區(qū)和平行參比區(qū)，用膠體金標記OXLDL單克隆抗體1，包被于標記物結合區(qū)，OXLDL單克隆抗體2包被于測試區(qū)的檢測帶上，一定量的氧化低密度脂蛋白包被于平行參比區(qū)的半定量對比條帶上，兼作指控帶。該試紙條利用免疫層析技術和雙抗夾心法原理，通過測試區(qū)與平行參比區(qū)顏色對比的強弱來判定檢測的半定量結果，可迅速判定樣品中待測抗原的有無及其含量高低。顏色對比越強，則樣品中OXLDL濃度越高，患病可能性越大，病變程度越深。從而對動脈粥樣硬化性心血管病(ASCVD)進行早期輔助診斷。裁剪同硝酸纖維膜寬度的潔凈PVC塑料板，要求在吸水端多2cm作為檢測用手柄，在對應硝酸纖維膜探樣區(qū)外多延伸1.2cm用強力雙面膠將處理好的硝酸纖維素膜固定在PVC板上。硝酸纖維素膜吸水區(qū)用固定等寬1.5cm長0.25cm厚度的無菌吸水海綿。探樣區(qū)固定1cm長等寬高級濾紙，距固定硝酸纖維膜0.2cm。中間用制備好的金標記物墊按Z型方式壓在濾紙和硝酸纖維膜下面，搭在硝酸纖維膜上面的用膠貼牢，整個過程要求避免其它蛋白的沾染，即制備成了半定量檢測氧化低密度脂蛋白的試紙條，鋁箔袋密封4℃度干燥保存?zhèn)溆谩嵤├z體金試紙條的使用方法1、采樣于晨起7～10時空腹抽前臂血，立即加入抗氧化劑，以防低密度脂蛋白在體外繼續(xù)氧化，離心后取血漿置-30℃?zhèn)錂zOXLDL。2、檢測在檢測前將試紙連包裝拿出，室溫放置5分鐘左右。取出試紙，將探樣區(qū)浸于樣品溶液中，樣品為血漿，液面不要過探樣區(qū)。2-5秒后拿出，水平放置在干凈操作臺上。6～10分鐘內即可肉眼見到結果。如果檢測帶沒有看到紅色而半定量帶看見紅色說明檢測結果呈陰性，待測樣品沒有檢出可以懷疑病患的氧化低密度脂蛋白，試紙條裝置質量完好(如附圖2中示意圖1所示)；如果樣品檢測帶和半定量帶均出現(xiàn)紅色，證明檢測陽性。檢測帶顏色高于半定量帶表明樣品中存在的氧化低密度脂蛋白高于0.6ug/ml水平，表示患病(如附圖2中示意圖2所示)；顏色差異不大則樣品中存在的氧化低密度脂蛋白接近于0.6ug/ml的臨界水平，可能患??；如果檢測帶顏色低于半定量帶則表面樣品中存在的氧化低密度脂蛋白低于0.6ug/ml水平，表示正常(如附圖2中示意圖3所示)；如果檢測帶沒有看到紅色而半定量帶也沒有看見紅色說明試紙條裝置失效，已經(jīng)不能用于檢測。權利要求1.一種氧化低密度脂蛋白(OXLDL)快速半定量檢測膠體金試紙條，該試紙條分為4個部分，包括了探樣區(qū)，標記物結合區(qū)，對比檢測區(qū)，吸水區(qū)，采用雙單抗夾心模式檢測，其特征在于膠體金標記OXLDL單克隆抗體1作為檢測流動相，固定OXLDL單克隆抗體2作為固定相，半定量質控條帶為能與金標單克隆抗體1特異結合并規(guī)定0.6ug/ml的OXLDL。2.根據(jù)權利要求1所述的OXLDL單克隆抗體1和OXLDL單克隆抗體2，其特征在于OXLDL單克隆抗體1和OXLDL單克隆抗體2為分別針對OXLDL的不同抗原決定簇。3.根據(jù)權利要求1所述的OXLDL單克隆抗體1和OXLDL單克隆抗體2，其特征在于OXLDL單克隆抗體1和OXLDL單克隆抗體2均為采用小鼠雜交瘤細胞法制備。4.根據(jù)權利要求1所述的一種氧化低密度脂蛋白快速半定量檢測膠體金試紙條，其特征在于該試紙條用于檢測血漿樣品。5.根據(jù)權利要求1所述的一種氧化低密度脂蛋白快速半定量檢測膠體金試紙條，其特征在于該試紙條可在動脈粥樣硬化性心血管病(ASCVD)早期輔助診斷中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種快速、簡便、敏感、經(jīng)濟、特異的、不需要特定儀器設備輔助的氧化低密度脂蛋白金標快速診斷試紙條，并能根據(jù)氧化低密度脂蛋白抗體捕獲抗原的量建立顏色對濃度關系，迅速判定人血漿中OXLDL定性及半定量檢測結果(高于或等于或低于標準對比氧化低密度脂蛋白樣品的濃度)，實現(xiàn)對動脈粥樣硬化性心血管病(ASCVD)的早期輔助診斷，同時提供該試紙的制作和裝配方法。文檔編號G01N33/544GK1896740SQ20051020039公開日2007年1月17日申請日期2005年7月15日優(yōu)先權日2005年7月15日發(fā)明者李紅玉,孫鶯,張波,支德娟申請人:蘭州大學