一種汞-低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及重金屬離子的免疫學(xué)檢測，具體設(shè)及一種隸-低密度脂蛋白馨合物及 其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白化i曲densitylipoprotein,簡稱皿L)、中間密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein,簡稱IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,簡稱LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,簡稱VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron,簡稱CM)。
[0003] 血液中大約百分之=十的膽固醇是通過高密度脂蛋白從組織細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)礁闻K 轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL所攜帶，而 LDL所攜帶的膽固醇含量大于VLDL由于LDL富含膽固醇，因而被稱為"壞膽固醇"。其與多 種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，特別是冠屯、病，糖尿病等疾病，研究發(fā)現(xiàn)LDL升高是動(dòng)脈粥 樣硬化發(fā)生、發(fā)展的必備條件。2014年，CE化REPORTS報(bào)道，"壞膽固醇"還可促進(jìn)癌癥細(xì) 胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
[0004] LDL是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，其改變在血清蛋白中有很強(qiáng)的 影響動(dòng)脈粥樣硬化作用，是冠狀動(dòng)脈疾病的重要危險(xiǎn)因子，與屯、血管疾病危險(xiǎn)程度呈正相 關(guān)。因而定量檢測血清中LDL對于屯、血管疾病具有重要意義，不僅可W用于早期識別動(dòng) 脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性，而且可W作為降脂藥物治療過程的檢測W及預(yù)后評價(jià)的指標(biāo)之一。 此外，其他一些疾病，諸如：腎病綜合征、慢性腎功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中 LDL含量上升，而定量檢測LDL也可用于該些疾病的早期診斷W及治療效果監(jiān)測，甚至作為 預(yù)后好壞的評價(jià)指標(biāo)之一。而對于營養(yǎng)不良、慢性貧血、骨髓瘤、急性屯、肌梗死、創(chuàng)傷和嚴(yán)重 肝病等患者，血清LDL的含量將會下降，定量檢測LDL也可用于該些疾病的早期診斷、治療 效果監(jiān)測W及作為預(yù)后評價(jià)的指標(biāo)之一。
[0005] 隸（Mercury,Hg)是一種無處不在的重金屬，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)，是 一種非常重要的環(huán)境污染物。2011年，美國毒物和疾病登記署扣nitedStatesAgency forToxicSubstancesandDiseaseRegistry,ATSDR)已將其列入物質(zhì)優(yōu)先列表內(nèi) (SubstancePriorityList),而世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization,WHO)也早已 將其列為10大最易引起健康問題的化學(xué)品之一。
[0006] 隸被認(rèn)為是對人體及其有害的，會影響人體的多個(gè)組織、器官及系統(tǒng)，包括屯、血管 系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，對人體危害極 大。關(guān)于隸致機(jī)體損傷的機(jī)制及其復(fù)雜，是很多學(xué)者及專家的研究中屯、。目前普遍研究認(rèn) 為隸是一個(gè)具有其極強(qiáng)的琉基結(jié)合能力的金屬，因此推測其與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切。 眾所周知，蛋白質(zhì)作為身體多種功能的執(zhí)行者，與機(jī)體各組織、器官功能的穩(wěn)定息息相關(guān)， 而隸作為一種金屬與機(jī)體內(nèi)的多種蛋白質(zhì)皆關(guān)系密切，相信隸與蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系與 隸致機(jī)體損傷息息相關(guān)，研究隸與蛋白質(zhì)的關(guān)系將有助于我們了解隸致機(jī)體損傷的具體機(jī) 制。
[0007] 隸是一種強(qiáng)有力的琉基結(jié)合劑，隸也表現(xiàn)出對氨基、磯酷基、駿基及哲基團(tuán)巨大的 親和力。因此，隸可W廣泛地結(jié)合多種蛋白質(zhì)，并影響他們的功能，抑制他們的活性。隨著 對隸毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到隸與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重要的 角色，被認(rèn)為是了解隸的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對隸和蛋白質(zhì)相互作用的研究就顯得 愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于隸與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與隸之間的 關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)研究對于隸與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引針對隸污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種隸-低密度脂蛋白馨合物及 其制備方法，并建立隸-低密度脂蛋白馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測隸-低 密度脂蛋白馨合物在評價(jià)一個(gè)地區(qū)隸污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中 隸-低密度脂蛋白馨合物，可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受隸污染的情況，從而間接反映該 個(gè)地區(qū)隸污染程度。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是；提供一種隸-低密度脂蛋白馨合 物，該隸-低密度脂蛋白馨合物是隸離子與低密度脂蛋白馨合物通過琉基或/和半脫氨酸 殘基馨合而成。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述的隸-低密度脂蛋白馨合物的制備方法，即體外合成法， 包括W下步驟：
[0011] A)隸-低密度脂蛋白馨合物的合成；在提純源于人體的低密度脂蛋白或按照生物 學(xué)方法重組的低密度脂蛋白中加入隸離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得反應(yīng)溶液；
[0012] B)隸-低密度脂蛋白馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的低密度脂蛋白、特異性抗體和隸離子，即得隸-低密度脂蛋白馨合物。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括W下步驟：
[0014] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的隸-低密度脂蛋白馨合物溶解于生理鹽水中，得 隸-低密度脂蛋白馨合物溶液；
[001引 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密 度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0016] 所述能與低密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料為吸附有可與低密度脂蛋白特異性結(jié) 合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0017] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0018] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0019] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0020] (6)透析；將步驟巧）的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次后，4°C透 析過夜，收集樣本；
[0021] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與隸特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0022] 所述能與隸特異性結(jié)合的填料為吸附有可與隸特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0023] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0024] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0025] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0026] (11)透析；將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立次后，4°C 透析過夜，收集樣本，即得隸-低密度脂蛋白馨合物。
[0027] 作為優(yōu)選，上述隸-低密度脂蛋白馨合物的制備方法，還包括W下對隸-低密度脂 蛋白馨合物的鑒定步驟，具體包括W下步驟：
[002引 （1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0029] 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的隸-低密度脂蛋白馨合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0030] 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0031] (4)檢測；在膠床上找出含隸的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有隸W及檢測隸的含量。
[0032] 本發(fā)明還提供一種如上述的隸-低密度脂蛋白馨合物在制備檢測人體內(nèi)隸-低密 度脂蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的隸-低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試 劑盒。
[0034] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲低密度脂蛋白的蛋白或捕 獲金屬隸的物質(zhì)。
[0035] 本發(fā)明還提供一種定量檢測隸-低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述 的隸-低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對樣品進(jìn)行檢測；酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純隸-低 密度脂蛋白馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純隸-低密度脂蛋白馨合物與原子吸收光譜結(jié)合 法、提純隸-低密度脂蛋白馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0036] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0037] 1.本發(fā)明首次合成了隸-低密度脂蛋白馨合物；
[003引 2.本發(fā)明首次提出隸-低密度脂蛋白馨合物可用于制備檢測血樣中隸-低密度脂 蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0039] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了馨合型低密度脂蛋白的特異性識別和定量檢測，W便定量檢測人 群血清中隸-低密度脂蛋白馨合物的含量，W評價(jià)一個(gè)地區(qū)隸污染程度的應(yīng)用，為工業(yè)地 區(qū)的隸污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的隸-低密度脂蛋白馨合物定量檢測方法的準(zhǔn) 確度高、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明所述的隸-低密度脂蛋白馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0041]圖2為本發(fā)明所述的隸-低密度脂蛋白馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分 析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0043] 本發(fā)明除特別說明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0044] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0045] 捕獲低密度脂蛋白的蛋白為抗低密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，如艾博抗 (上海）貿(mào)易有限公司出售的貨號為"Abeam油157795"的anti-LDL抗體，W下實(shí)施方式 中，所述與低密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗低密度脂蛋白抗體、抗LDL抗體均為捕獲低 密度脂蛋白的蛋白；
[0046] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0047] 稀釋緩沖液為抑9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例