血清rbp4蛋白作為肝癌病人血清標志物及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種血清標志物的應用，具體為一種血清RBP4蛋白作為肝癌病人血清標志物及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45 %。原發(fā)性肝癌早期一般無任何癥狀，一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，病情大多已進入中、晚期，而且惡性程度高、進展快、預后差、侵襲性強，至今對肝癌的發(fā)病機制不清。因此，開發(fā)新的疾病標志物，對肝癌的防治具有重要意義。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展和蛋白質(zhì)組學研究的深入，產(chǎn)生了血清定量蛋白組學新技術(shù)，常用的幾種方法有:ICAT-MS/MS、iTRAQ-MS/MS、2-D以及蛋白芯片等。其中，iTRAQ-MS/MS是一種檢測靈敏度好、蛋白序列的覆蓋率高以及重復性、可靠性好的實驗手段。iTRAQ有如下優(yōu)點:(1)標記過程簡單，反應速度快，標記效率可高達97%以上，質(zhì)譜檢測較為靈敏。(2)能夠和多肽的氨基端或多肽鏈賴氨酸殘基上的氨基基團發(fā)生共價反應。(3)同一種多肽的離子化程度十分接近，標記后在RPHPLC上的峰位相同。(4)8種同位素標記的相同多肽在進行第一級質(zhì)譜檢測時，分子量完全相同，這種在同一峰位上的疊加效應可以增強了離子的強度，提高檢測的靈敏性。(5)在碰撞誘導解離(collis1n induced dissociat1n, CID)后，進行二級質(zhì)譜分析時，帶不同同位素標簽的同一多肽產(chǎn)生質(zhì)量為113、114、115、116、117、118、119和121Da的報道離子(reporter 1n)。由于低分子量區(qū)是質(zhì)譜定性(質(zhì)量確定)和定量(豐度比較)較為準確的區(qū)域，在此區(qū)域比較8種報道離子的豐度，可以較為準確的獲得不同樣品間相同多肽的豐度差異。(6)代表多肽豐度報道離子的比較以及多肽前體的序列等信息，可在一次MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜過程中同時獲得。iTRAQ-MS/MS技術(shù)已經(jīng)廣發(fā)應用于多種疾病標志物的研究。為進一步揭示疾病的致病機制，引導新的藥物靶標的發(fā)現(xiàn)提供了重要的線索。
[0003]轉(zhuǎn)錄組測序是發(fā)現(xiàn)功能基因和標志物的一種可行方法。20世紀70年代誕生第一代化學降解法測序，到二代測序技術(shù)已經(jīng)具備高通量、高度并行等特點，但昂貴的費用成本成為其大范圍應用的姅腳石，新發(fā)展起來的第三代測序技術(shù)以較低成本、長讀長及高堿基識別率為測序技術(shù)發(fā)展帶來廣闊的前景，高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，已經(jīng)廣泛應用于多種腫瘤標志物研究。本發(fā)明就是血清定量蛋白組學技術(shù)結(jié)合新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在肝癌研究中的新發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種血清RBP4蛋白作為肝癌病人血清標志物及其應用，適用于肝癌血清輔助檢測，發(fā)病機制研究和抗癌癥藥物開發(fā)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種血清RBP4(Retinol binding protein 4)蛋白作為肝癌病人血清標志物，是利用 iTRAQ(isobaric tags for relative and absolutequantitat1n，iTRAQ)結(jié)合MALD1-TOF/MS技術(shù)檢測肝癌病人和正常人的血清，和利用1nProton?基因測序儀測序肝癌細胞Smmc-7721及對照組正常肝細胞L-02，共同發(fā)現(xiàn)的生物標志物，RBP4蛋白在肝癌病人血清中表達水平明顯低于正常人的血清中表達水平，同時其mRNA水平上也是在肝癌細胞表達水平明顯低于正常人的細胞中表達水平。RT-PCR、免疫組織化學和質(zhì)譜多反應監(jiān)測(multiple react1n monitoring,MRM)也驗證RBP4蛋白在肝癌細胞、組織和病人血清中表達降低。
[0006]所述RBP4蛋白在肝癌血清和組織中的表達降低是指以下3個肽段表達水平降低:FSGTWYAMAK, YWGVASFLQK, QEELCLAR。
[0007]本發(fā)明的顯著效果在于:
[0008]采用基于iTRAQ標記的定量蛋白質(zhì)組學和基于二代測序的轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，整合蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)實現(xiàn)對肝癌的全面系統(tǒng)的研究，得到一種血清RBP4蛋白作為肝癌病人血清標志物，該標志物經(jīng)過RT-PCR、免疫組織化學和質(zhì)譜MRM驗證，結(jié)果更為可靠，可為臨床應用提供有價值的信息。
【附圖說明】
[0009]圖1 RBP4蛋白肽段FSGTWYAMAK的iTRAQ標記相對定量。
[0010]A:RBP4蛋白的肽段FSGTWYAMAK的二級圖譜；B，肽段FSGTWYAMAK的定量結(jié)果，顯示與正常人相比，該肽段在肝癌血清中的表達明顯降低。
[0011 ] 圖2.免疫組織化學檢測RBP4的表達水平。
[0012]免疫組化法驗證RBP4不同表達等級在癌與非癌的分布，與正常細胞株相比，RBP4在肝癌組織中表達明顯下降。
[0013]圖3.質(zhì)譜MRM檢測血清RBP4的表達水平。
[0014]質(zhì)譜MRM驗證RBP4在血清中的表達，與正常對照和肝炎相比，RBP4的表達水平在肝癌病人血清中明顯低表達。圖中正常對照以Normal表示，肝炎以Hepatitis表示，肝癌以HCC表示。
【具體實施方式】
[0015]以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。
[0016]實施例1
[0017]血清定量蛋白組技術(shù)檢測RBP4蛋白在肝癌病人血清中表達降低
[0018]1.檢測樣本:
[0019]肝癌病人、肝硬化病人、肝炎病人和正常對照血清各10例。清晨空腹采集2mL全血，4°C靜置l_2h待血液凝固析出血清，3000g離心lOmin，收集上清液，冰上分裝后存至-80 °C備用。
[0020]2.檢測方法:
[0021](1)采用安捷倫多重親和去除系統(tǒng)humanl4色譜柱去除血清中的高豐度蛋白；
[0022](2)每組血清定量100 μ g，按照iTRAQ試劑盒說明書進行胰蛋白酶酶解、分別用iTRAQ試劑113、114、115、116標記健康對照組、肝炎組、肝硬化組、肝癌組，然后混合、凍干；
[0023](3)混合干燥的iTRAQ標記樣品用緩沖液A復溶，緩沖液A由lOmmol/LKH2P04, 25% CAN, pH 2.7組成，通過強陽離子交換色譜柱將混合樣品分20個餾份；
[0024](4)每個餾份分別進行cl8反相分離、點靶和質(zhì)譜鑒定；
[0025](5)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用ProteinPilot 3.0軟件，對人類Uniprot數(shù)據(jù)庫進行檢索并定量分析；
[0026](6)統(tǒng)計學處理應用SPSS14.0軟件進行統(tǒng)計學分析.計量數(shù)據(jù)以mean 土 SD表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0027]3.檢測結(jié)果:質(zhì)譜共鑒定到RBP4蛋白包含F(xiàn)SGTWYAMAK、YWGVASFLQK、QEELCLAR在內(nèi)的共10個唯一肽段?？傮w覆蓋率33.8%，其中116/113 = 0.3481，P < 0.05，RBP4蛋白在肝癌病人血清中表達水平明顯降低。結(jié)果如圖1所示。
[0028]實施例2
[0029]RBP4蛋白包含F(xiàn)SGT