專利名稱：用于時間分辨熒光的成像熒光計的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對生化和醫(yī)學(xué)樣品中的時間分辨熒光進行成像的裝置和方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)一熒光團與入射光子相互作用時(激勵)發(fā)出熒光。光子的吸收導(dǎo)致熒光團中的電子從其基態(tài)躍遷到更高能級。在熒光團和其環(huán)境所決定的一段時間之后，電子返回其初始能級，釋放一個光子(熒光發(fā)射)，該光子的波長取決于返還過程中所釋放的能量大小。當(dāng)電子從各個軌道下落到其基態(tài)時，熒光團可能以單波長或者多波長發(fā)射(產(chǎn)生一發(fā)射光譜)。對于每種熒光團，發(fā)射光譜不變。
熒光標(biāo)記通常是小有機燃料分子，如熒光素，得克薩斯紅(TexasRed)或若丹明，它們易于與探測分子如鏈霉親和素相結(jié)合?？梢酝ㄟ^用適當(dāng)激發(fā)頻率的光照射來探測熒光團，并且可以通過電光探測器或通過眼睛檢測所產(chǎn)生的光譜發(fā)射。
對熒光材料進行分析的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且例如在紐約Plenum出版社(1983年)出版的Lakowicz，J.R.的熒光光譜學(xué)原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy)；圣地亞哥Academic出版社(1989)出版的Taylor，D.L.和Wang，Y.L.編輯的培育中活體細胞的熒光顯微技術(shù)(Fluorescence Microscopy of LivingCells in Culture)，B部，細胞生物學(xué)中的方法(Methods in CellBiology)，Vol.30中的Herman，B.的諧振能量轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)(Resonance Energy Transfer Microscopy)，p.219-243；Menlo ParkBenjamin/Cummings Publishing有限公司(1978)出版的Turro，N.J.，現(xiàn)代分子光化學(xué)(Modern Molecular Photochemistry)，P.296-361和美國分子探測器目錄(Molecular Probes Catalog)(2001)中描述了熒光材料分析方法。
熒光計是測量熒光的儀器。熒光計具有三個主要元件(a)用于激勵的光源，最典型的為激光器或?qū)拵Ч庠矗?b)濾波器和/或色散單色儀，用于在激勵和發(fā)射過程中選擇感興趣的波長區(qū)域；(c)探測器，將碰撞熒光發(fā)射轉(zhuǎn)換成電信號。本發(fā)明涉及測量生物樣品，尤其是藥品發(fā)現(xiàn)活動中所使用的生物樣品中的熒光。
有些熒光計(微熒光計)根據(jù)共焦或非共焦顯微鏡的原理構(gòu)成，且被設(shè)計成將熒光標(biāo)記的細胞或樣品的微量視作分離目標(biāo)。大量在先技術(shù)涉及到這種微熒光計。該在先技術(shù)群的一個子集涉及將微熒光計與帶微池(microwell)的平板或薄片一起使用(例如，Galbraith等人，1991；Rigler，1995)。
其它熒光計(宏熒光計)不進行細胞分辨率測量，而是使用低放大倍數(shù)光學(xué)裝置收集多個樣品中每個樣品發(fā)出的信號(如Bjornson等人的美國專利No.5,125,748；Eden等人的5,340,747)，最典型的是在微池平板中設(shè)置小池(如Modlin等人的美國專利No.6,071,748；Akong等人的5,670,113)。
在“掃描熒光計”、“步進熒光計”與“區(qū)域成像熒光計”之間，對多個樣品進行測量的方法不同。
在掃描宏熒光計(如Kain的美國專利No.5,672,880中所披露的)中，通過在樣品上掃描激勵光束，并逐點收集各個發(fā)射，順序?qū)Χ鄠€樣品進行檢測。掃描熒光計能將每個樣品分成多個分辨點。
在步進宏熒光計中，激勵光束和探測器(通常為光電倍增管或二極管)以步進方式從一個樣品移動到另一個樣品。探測器(或探測器陣列)對各個樣品進行整體測量，不對每個樣品中的多個分辨點進行辨別(如，例如Harootunian的美國專利No.5,589,351；Akong等人的5,670,113；Tuunanen等人的6,144,455；Akong等人的6,127,133)。
在區(qū)域成像宏熒光計中，探測器同時面對多個樣品(不進行掃描或步進)，且在探測器區(qū)域的不同部分檢測各個樣品。通過將不同樣品定位于探測器上不同的點處，區(qū)域成像熒光計具有對多個樣品中分離樣品進行辨別的能力。區(qū)域成像宏熒光計可以辨別或者不辨別每個樣品中的多個分辨點。
區(qū)域成像宏熒光計是眾所周知的(例如，Haggart 1994；Che的美國專利No.6,140,653；Kawano等人的6,069,734；許多商業(yè)系統(tǒng))。大多數(shù)區(qū)域成像宏熒光計適用于平坦的樣品，如電泳凝膠。某些(例如Reintjes等人的美國專利No.5,275,168；Knuttel的5,309,912)需要更為特殊的方法，如拉曼光譜學(xué)或光照的相位/振幅調(diào)制，并且不適用于眾多生物樣品中所使用的瞬時或時間分辨的熒光強度測量。另外(Stabile等人的5,854,684)提到用于檢測多個樣品所反射的光量的成像檢測器的一般應(yīng)用，沒有描述能夠在宏熒光計中有效使用成像檢測器的照明和光檢測系統(tǒng)中的特定實施例。最后，另外的文獻(McNeil等人的WO96/05488)披露了實現(xiàn)區(qū)域成像宏熒光計的具體方法，該方法對實際應(yīng)用來說不是最佳的。
在藥品發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中需要樣品的高處理量，其中一般將熒光樣品設(shè)置于多個小池內(nèi)，并且要求高處理量。區(qū)域成像熒光計呈現(xiàn)出的已知優(yōu)點在于同時對大量樣品進行量化，從而實現(xiàn)高處理量的能力，如果要使該儀器同時具有高處理量和高靈敏度，則需要適合于這個目的的特殊實施例。
顯然，從區(qū)域成像宏熒光計的技術(shù)來看，設(shè)置一CCD攝像機以便對樣品進行成像，用已知的方法輸送熒光激勵，并且用已知的方式使用透鏡收集所發(fā)射的光。不過，McNeil等人(WO96/05488)披露的這種成像熒光計不能獲得與非成像熒光計相當(dāng)?shù)撵`敏度，并且存在信號檢測錯誤的缺點。例如，它們使用不包含機械裝置的標(biāo)準(zhǔn)透鏡系統(tǒng)，如此設(shè)計以便使反射和其它形式的寄生信號最小，具有視差，通常要求帶微池的平板具有一透明底面，通過該透明底面觀看樣品。相反，非成像熒光計非常靈敏，沒有視差，并且能從平板的頂部或底部觀看，不需要昂貴的透明底面平板。由于上面所詳細說明的原因，藥品篩選中區(qū)域成像熒光計的潛在用戶沒有廣泛采用任何在先技術(shù)系統(tǒng)。
對區(qū)域成像熒光計應(yīng)用于藥品篩選提出的挑戰(zhàn)，總的來說，來自于四個方面a)這些小池(well)形成了與光照明的入射角相互影響的孔徑。接收更大角度光照明的小池不如接收更多正面光照明的小池那樣被很好地照射。由于大多數(shù)區(qū)域成像熒光計從會聚透鏡旁邊輸送光照明(例如，Neri等人，1996)，故它們對于平坦樣品是成功的，不過不能適當(dāng)?shù)卣彰鬏^深的小池。實際上，常常發(fā)現(xiàn)輸送到帶微池的平板中不同位置處小池的光存在超過300％的變化，除非僅通過帶微池平板的底面產(chǎn)生光照明輸送(如Schroeder的美國專利No.5,355,215和McNeil等人的WO96/05488)。
b)這些小池非常暗淡。標(biāo)準(zhǔn)的帶微池平板中所包含的大量小池占據(jù)了大約96平方厘米的空間大小。如果宏區(qū)域成像熒光計能同時對所有小池進行成像，則必須同時照明所有小池。因而，輸送到任何一個小池的光照量(如同被照射面積與強度/單位面積之間的幾何關(guān)系的倒數(shù)所描述的)非常低，而由任何一個小池發(fā)出的熒光量也傾向于較小，且需要靈敏的探測器。不管探測器是多么靈敏，重要的是所有小池都盡可能有效地接收照射光束。如果光照沒有達到某些小池的內(nèi)容物，即使最靈敏的探測器也不能抽提取有用的信號。
c)存在視差。由標(biāo)準(zhǔn)透鏡以不同角度對帶微池的平板內(nèi)不同位置處的深池進行成像。這種眾所周知的視差主要影響光學(xué)裝置的精度，尤其是當(dāng)光學(xué)裝置從頂部對多個小池進行成像時。
d)照明光線與探測光學(xué)裝置相互影響。用于將光照輸送到整個小池平板上的光學(xué)裝置，和用于同時收集平板中多個小池的熒光發(fā)射的光學(xué)裝置，必須具有特殊的性質(zhì)。例如，最有效的照明方法是從聚光透鏡里面照射(外照射)，不過宏外照射透鏡會受到反射和其它不明顯的寄生信號源的影響。
Ramm等人在美國專利申請09/240,649和09/477,444中披露了在小池平板、凝膠和污漬中進行測定的數(shù)字成像系統(tǒng)。這種系統(tǒng)滿足高處理量區(qū)域成像熒光計的需要，并且實現(xiàn)了技術(shù)進步，因為它克服了上面點a-d中所提出的問題。更具體地說，所披露的系統(tǒng)a)最小限度地與小池孔徑相互影響，以便以有效和均勻的方式從上面或下面照射多個小池；b)通過用有效的方式進行照射，使區(qū)域成像熒光計更加靈敏；c)使用遠心光學(xué)裝置，避免視差；d)包含用于使宏區(qū)域成像熒光計中產(chǎn)生的背景信號源最少的光學(xué)裝置和元件(例如，使安裝在聚光透鏡中的發(fā)射濾波器的內(nèi)反射最小)。
所披露的系統(tǒng)已經(jīng)被付諸實踐，并且廣泛地用于發(fā)光和瞬時熒光信號的區(qū)域成像。在所引用的專利申請中披露了使用該系統(tǒng)進行時間分辨熒光成像的方法，不過沒有詳細描述用于該目的的實施例。本發(fā)明披露了用于在小池平板、凝膠和污漬中進行時間分辨測定的區(qū)域成像熒光計的最佳實施例。
通過收集所發(fā)射熒光的同時輸送激勵光照定義瞬時熒光發(fā)射。瞬時熒光中的問題包括●必須檢測發(fā)射中非常小的改變，同時該系統(tǒng)充滿激勵光；●與激勵相比，發(fā)射的強度非常低，難以濾除所有激勵而剩下純凈的發(fā)射；●樣品介質(zhì)(例如溶劑，包含被標(biāo)記化合物的細胞)，光學(xué)裝置(例如Beverloo等人的裝置，1990，1992)和樣品載體(小池平板，小池)可能發(fā)射與感興趣的熒光相似的光譜成分。
總的來說，將到達探測器的任何激勵光或樣品介質(zhì)的貢獻稱為“背景”。發(fā)射濾波器被放置在樣品與探測器之間，以便阻擋盡可能多的背景信號到達探測器(如Ramm等人的國際專利申請公開W099/08233中所披露的)。不過，發(fā)射濾波器不能去除所有的背景，且使背景泄漏到探測器上，導(dǎo)致探測靈敏度降低。即，熒光計的靈敏度傾向于受到大背景信號的限制。
時間分辨的熒光(TRF)是一種眾所周知的用于減小背景并提高探測靈敏度的技術(shù)(例如，Hemilla等人的美國專利N0.4,565,790，Mikola等人的4,808,541，Zarling等人的5,736,410)。在TRF中，使用光源激發(fā)樣品，然后迅速地熄滅或遮斷光源。在激勵過程中，關(guān)閉探測器。處于關(guān)閉狀態(tài)時，它不受激勵期間所產(chǎn)生的背景成分的影響(例如激勵光通過發(fā)射濾波器的泄漏)。
在激勵終止之后，大多數(shù)背景成分都消失或迅速地衰減(例如溶劑熒光)。相反，熒光團并不立即停止其發(fā)射。相反，存在一個在激勵終止之后熒光團繼續(xù)發(fā)射的周期(從皮秒到毫秒)。在這期間，打開探測器，觀察具有最小背景的相關(guān)熒光信號。探測周期的這種延遲計時是TRF的主要原理。
為了能夠進行TRF探測，在控制時間周期內(nèi)必須打開和關(guān)閉探測器。在激勵終止之后某個時間，開始探測周期(在一段延遲時間之后)，并持續(xù)一段時間(探測時間)。通常將TRF用于鑭系(Eu，Tb等)熒光團，其延遲時間為100微秒到2毫秒的量級，比典型的背景源延遲時間長得多。一般，該延遲時間為數(shù)十微秒量級，且探測時間為數(shù)十到數(shù)百微秒。
在激勵期間和延遲時間，遮斷或關(guān)閉探測器(下面稱之為斷開)。在探測期間，探測器暴露于來自樣品的發(fā)射(下面，稱之為選通)。不可能任何一個斷開和選通周期都將在探測器上產(chǎn)生可靠的信號，從而要重復(fù)該周期，直到積累了足夠的信號。
與瞬時熒光發(fā)射相比，被延遲的熒光發(fā)射要弱得多，而且區(qū)域成像系統(tǒng)必須以非常低的發(fā)射量/單位面積來工作。因而，與另外類型的熒光計相比，區(qū)域成像熒光計更易于遭受探測器的噪聲基底(noisefloor)中失去延遲發(fā)射的影響。因此，需要TRF系統(tǒng)具有可產(chǎn)生高光學(xué)處理量〔廣延性(etendue)〕和低傳輸損耗的幾何結(jié)構(gòu)。在優(yōu)化系統(tǒng)以便實現(xiàn)這種快速選通和高廣延性的組合時產(chǎn)生了困難。
必須對激勵光和探測器兩者進行選通。使用機械斬波器和/或使用脈沖激光器(例如，Gadella和Jovin，1995)對激勵進行選通是眾所周知的，如同使用衰減足夠快、使它們對延遲探測的影響最小的閃光燈(如Ramm等的WO99/08233；Vaisala等的EP0987540A2；Vereb等，1998中所披露的)。
有三種通常所使用的在TRF中對發(fā)射路徑進行選通的方法(a)快速旋轉(zhuǎn)光閘輪，以產(chǎn)生發(fā)射光的微秒級選通。已經(jīng)將這種方法應(yīng)用于TRF顯微鏡(Seveus等人，1992)中，以除去瞬時發(fā)射的熒光信號，從而減小自發(fā)熒光。在Vaisala等人的EP0626575A1中披露了一種類似的方法，并且用于掃描探測系統(tǒng)(Harju等人的美國專利No.5,780,857)。在一次探測一個樣品的顯微鏡或系統(tǒng)中，由于廣延性非常小，所以一個快門就行了。相反，宏成像系統(tǒng)的廣延性很大，其幅值比顯微鏡大大約兩個量級。宏成像系統(tǒng)將需要較大的機械快門機構(gòu)，從打開到關(guān)閉逐漸變化。
(b)多元件的機械快門，使用快速旋轉(zhuǎn)的光閘輪，具有一次暴露探測器一小部分的同步開口。該裝置(如Vaisala等人的EP0987540A2中所描述的)比單個輪快，不過比較復(fù)雜，由快速運動部件組成，且具有較差的廣延性。
(c)電選通探測器，并且還將發(fā)射光子轉(zhuǎn)變成電子。在這種方法中，在光路中設(shè)置一光電陰極。可以以很短的間隔打開和關(guān)閉該光電陰極，以適應(yīng)TRF的定時要求。不過，這類裝置具有低量子效率，不能用于將暗淡的熒光發(fā)射成像在成像探測器上。因而，施加一加速電場，以便在靶子之前增大光電子的能量，在許多情形中，被加速的電子通過微通道板引導(dǎo)，而在微通道板處它們引起更多的加速電子的發(fā)射。因此，電選通的探測器一般采用一光放大器，在靶子之前放大電子束。
已經(jīng)披露了使用電選通探測器，并且具有光電陰極和微通道板放大的宏TRF成像系統(tǒng)(Ramm等人的WO99/08233；Ramm，1999)。在透鏡與探測器之間使用放大光電陰極，具有一些固有的缺點
(a)最典型的是在長波長下發(fā)射TRF。這對于熒光諧振能量轉(zhuǎn)移(FRET)中的施主—受主對尤其正確，它傾向于發(fā)射光譜的紅光部分。為了探測這種類型的信號，光電陰極的帶隙需要足夠低，以便使長波長光子能夠產(chǎn)生光電子。不過，低帶隙材料易于產(chǎn)生熱信號，產(chǎn)生不能區(qū)別于被檢測信號的儀器背景。適當(dāng)?shù)乩鋮s光電陰極(如在市售的裝置中已經(jīng)付諸實施)并不能消除熱背景。將光電陰極深度冷卻到足夠低的溫度，以便極大地減小熱背景，存在明顯的技術(shù)困難，不常被使用。
(b)增強型系統(tǒng)的攝像機元件產(chǎn)生噪聲，尤其是熱背景。為了克服這個問題，可以冷卻CCD，以減小熱背景(如在若干工業(yè)裝置中付諸實施)。在對從增強器吸收熱載荷的光纖耦合CCD進行冷卻，并且保持熱光纖耦合與冷CCD之間的連接時存在困難。
(c)選通/放大元件的QE較低，一般在藍綠波長中為10％的量級，在紅光中低到1％。因而，入射到放大選通系統(tǒng)的大部分信號光被損失掉，且將該系統(tǒng)用于時間分辨的熒光發(fā)射是有問題的。
(d)放大過程并不產(chǎn)生每入射光電子恒定數(shù)量的電子。通常通過設(shè)置探測活動的最小閾值來克服這種增益噪聲，且只考慮有效的具有高度可能性的活動。通過這種方法，放大裝置起計數(shù)器的作用，而不是起積分成像器的作用。雖然這種考慮方法非常靈敏，不過放大裝置效率非常低，并且需要較長探測周期來積累足夠的超過閾值的活動，以便產(chǎn)生圖像。
還有其它缺點，包括光放大器的易損壞性(它易于被亮光毀壞)和被放大圖像中的弱調(diào)制傳輸。另外，樣品的明亮區(qū)域勢必會影響其周圍的區(qū)域，從而微池平板的成像極易遭受小池之間的串?dāng)_?？傊诒景l(fā)明領(lǐng)域中，使用光電陰極選通和放大的在先技術(shù)系統(tǒng)，均表現(xiàn)出缺陷。
有可能構(gòu)成一種用于TRF的宏區(qū)域成像熒光計，其中選通和放大功能是該探測器所固有的。例如，已經(jīng)確定在Ramm等人(WO99/08233)所披露的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)中可以實現(xiàn)電子轟擊CCD(EBCCD)。可以想到，其它整體放大探測器，如電子放大的CCD(如由英國馬可尼應(yīng)用技術(shù)付諸實施)也將適用于所披露結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)中。與增強型CCD攝像機相比，EBCCD(和其它可能的整體選通探測器)的優(yōu)點在于它表現(xiàn)出非常小的成像微池平板中的串?dāng)_，同時保持足夠的靈敏性，以便探測微弱的延遲熒光信號。
可以想到將任何類型的快門作為TRF系統(tǒng)的選通器。已經(jīng)披露了使用安裝在光路中樣品后面探測器之前的液晶、葉片或其它快門的具有宏外照明系統(tǒng)的TRF(WO99/08233，Ramm等)。在一個最佳實施例中，本發(fā)明采用了這樣一種快門，設(shè)置于系統(tǒng)中，對該系統(tǒng)進行優(yōu)化以便允許使用這種快門。
雖然沒有特別描述應(yīng)用本發(fā)明的自動過程，不過可以想到可以將本發(fā)明應(yīng)用在利用用于識別調(diào)制器、路徑、具有有用活性的化學(xué)制品的自動化和集成工作站的系統(tǒng)和方法，以及此處所披露的其它方法。在下列文件〔參見Kramer等人的美國專利No.4,000,976(公開于1977年1月4日)，Pfost等人的美國專利No.5,104,621(公開于1992年4月14日)，Bjornson等人的美國專利No.5,125,748(公開于1992年1月30日)，Kowalski的美國專利No.5,139,744(公開于1992年8月18日)，Bjornson等人的美國專利No.5,206,568(公開于1993年4月27日)，Mazza等人的美國專利No.5,350,564(1994年9月27日)，Harootunian的美國專利No.5,589,351(公開于1996年12月31日)和Baxter Deutschland GMBH的PCT申請No.93/20612(公開于1993年10月14日)，McNeil等人的WO96/05488(公開于1996年2月22日)和Agong等人的WO93/13423(公開于1993年7月8日)〕中概括地描述了這些系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，一種用于小池平板、凝膠和污漬中樣品的時間分辨的熒光測定術(shù)的區(qū)域成像系統(tǒng)，采用設(shè)置于大廣延性選通照射系統(tǒng)中，與高靈敏攝像機(最好是如Ramm等在WO99/08233中所披露的)耦合的快速動作電子發(fā)射快門。最好，但不是必須，該系統(tǒng)的發(fā)射快門是基于鐵電晶體(FLC)技術(shù)。FLC快門是一種基于鐵電性的裝置，由一輸入偏振片、一根據(jù)電場改變偏振的旋轉(zhuǎn)的鐵電材料，和一插在陣列成像系統(tǒng)發(fā)射路徑之中樣品與固態(tài)陣列探測器之間的偏振分析器組成。
本發(fā)明的系統(tǒng)的特征在于包含F(xiàn)LC快門的光/探測元件是如此靈敏，以至于可調(diào)節(jié)通過電子快門的傳輸損耗而無需光放大階段。在一個最佳結(jié)構(gòu)中，探測器的量子效率很高，且光學(xué)裝置的廣延性很大。當(dāng)用于該系統(tǒng)中時，本發(fā)明的快門能夠透過足夠的延遲熒光，以產(chǎn)生類似于從非成像時間分辨的熒光計所得到的測量結(jié)果，并且大于使用放大光電陰極的系統(tǒng)的靈敏度，而沒有這種系統(tǒng)的缺點(串?dāng)_，易損壞性等)。
本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員將理解到，可將快速電子快門用作用于TRF的選通機構(gòu)。不過，大多數(shù)快門如克耳盒、聲光調(diào)制器或電光調(diào)制器，具有有限的廣延性，將其應(yīng)用限制為具有小廣延性的系統(tǒng)，如顯微鏡。本發(fā)明的電子快門的優(yōu)點在于它具有極大的孔徑，利用本發(fā)明系統(tǒng)的廣延性。
本發(fā)明的系統(tǒng)可以配備一基于液晶的快門。雖然這類快門可以具有足夠大的孔徑以利用本發(fā)明的大廣延性，但其透射狀態(tài)與阻斷狀態(tài)的比值(被定義為對比度)較低。具體來說，與用FLC快門觀察的＞400∶1相比，液晶快門的對比度為＜200∶1的量級。對于許多通常使用的螢石進行TRF成像而言，基于液晶的快門不夠快。
最好是，本發(fā)明的系統(tǒng)采用基于鐵電晶體(FLC)的快門。本發(fā)明系統(tǒng)的優(yōu)點在于FLC快門可以在100微秒內(nèi)從選通轉(zhuǎn)變到關(guān)斷，且適用于通常所使用的鑭系，銪和鋱螢石的延遲熒光成像。
如前面所披露的，在TRF顯微鏡中嘗試使用FLC快門，F(xiàn)LC的缺點是由于對比度不夠，而對瞬時熒光的阻擋很差(Verwoerd等人，1994；Shotten，1995)。這種很差的對比度使得被迫使用兩個串聯(lián)FLC快門，導(dǎo)致傳輸損耗如此之高(Vereb等人，1998)，使得不可能用于宏成像熒光計中。在本發(fā)明中，將FLC設(shè)置于光學(xué)裝置中可產(chǎn)生最佳可能的對比度的位置。本發(fā)明的系統(tǒng)的特征在于構(gòu)成光學(xué)裝置，將快門設(shè)置于發(fā)射熒光的光路中，使相對快門法線的入射角不大于20°。這種定位由快門得到了最佳可能的對比度，并且使所述快門受到的傳輸光波長特性的影響最小。
在本發(fā)明的一個最佳實施例中，通過首先拍攝快門關(guān)閉時瞬時熒光的圖像(泄漏圖像)，而校正通過FLC快門的泄漏。在獲得延遲的熒光圖像之前，從CCD攝像機讀出該圖像。然后，從延遲的熒光圖像中減去該泄漏圖像，剩下沒有附加有通過FLC快門泄漏的延遲熒光的圖像。
本發(fā)明的照明系統(tǒng)和電子快門的優(yōu)點在于適用于現(xiàn)有的宏區(qū)域成像熒光計，無需對所述裝置進行較大的改變(例如如Ramm等人在WO99/08233中所公開的)。相反，本發(fā)明的照明系統(tǒng)可以安裝在現(xiàn)有的宏區(qū)域成像熒光計內(nèi)，而且快門也可以安裝在所述裝置內(nèi)，無需較大的改變。
本發(fā)明的優(yōu)點在于易于從宏區(qū)域成像熒光計中插入或取出快門，使所述熒光計能用于非常廣泛的應(yīng)用中，而不會受到所述快門的防礙。
本發(fā)明系統(tǒng)的優(yōu)點在于可以用在利用用于識別調(diào)制器、路徑，具有有用活性的化學(xué)物品的自動化和集成工作站的系統(tǒng)和方法，以及此處所描述的其它方法。在下列文件〔參見Kramer等人的美國專利No.4,000,976(公開于1977年1月4日)，Pfost等人的美國專利No.5,104,621(公開于1992年4月14日)，Bjornson等人的美國專利No.5,125,748(公開于1992年1月30日)，Kowalski的美國專利No.5,139,744(公開于1992年8月18日)，Bjornson等人的美國專利No.5,206,568(公開于1993年4月27日)，Mazza等人的美國專利No.5,350,564(1994年9月27日)，Harootunian的美國專利No.5,589,351(公開于1996年12月31日)和Baxter DeutschlandGMBH的PCT申請No.93/20612(公開于1993年10月14日)，McNeil等人的WO96/05488(公開于1996年2月22日)和Akong等人的WO93/13423(公開于1993年7月8日)〕中，概括地描述了這些系統(tǒng)。
雖然本發(fā)明的目的在于時間分辨的宏熒光區(qū)域成像，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以使用本發(fā)明的偏振特性，如用采用偏振光學(xué)裝置的FLC快門或其它快門構(gòu)成偏振宏熒光區(qū)域成像系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，通過首先通過FLC快門或其它偏振裝置，使激勵光偏振。發(fā)射光則通過一安裝在發(fā)射光路中的偏振片。可以使任一個偏振片相對另一個旋轉(zhuǎn)，該系統(tǒng)具有如此高的靈敏度，使得它實現(xiàn)了類似于非區(qū)域成像裝置的偏振測量。
附圖簡述從下面參照附圖的目前最佳實施例，不用說是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的描述，將更加完全地理解本發(fā)明的上述和其它目的，特征和優(yōu)點，其中

圖1為根據(jù)本發(fā)明用于熒光成像的光學(xué)系統(tǒng)的最佳實施例的剖面示意圖；圖2為用外延照明系統(tǒng)代替環(huán)形照射裝置時圖1所示光學(xué)系統(tǒng)的剖面圖；圖3為與圖2相似的剖面圖，表示增加一快速快門；圖4為光線圖，說明光學(xué)系統(tǒng)中快門和濾波器的操作；圖5說明將根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的性能與非成像時間分辨熒光計進行比較的曲線；以及圖6說明將目前系統(tǒng)中采用的電子轟擊CCD攝像機性能與非成像時間分辨熒光計進行比較的曲線。
最佳實施例的詳細描述圖1表示用于對帶微池的平板3中所包含的多個小池2進行熒光成像的光學(xué)系統(tǒng)1的橫截面。光學(xué)系統(tǒng)1的主要元件為透鏡系統(tǒng)4，脈沖光源5，初始激勵濾波器6，環(huán)形照明裝置7，初始發(fā)射濾波器8(去除與所需樣品信號無關(guān)的波長)和CCD攝像機系統(tǒng)9。光學(xué)系統(tǒng)1的透鏡系統(tǒng)4包括在遠心空間中工作的前元件4a，和在CCD攝像機9的CCD探測器10上形成小池平板3的圖像。
在操作過程中，光源5提供施加給小池2中樣品的必須的光能。最好，可以在小于100微秒的時間內(nèi)將光源從高亮度調(diào)節(jié)到小于該高亮度的1％。光源發(fā)出的光通過濾波器6，并經(jīng)過諸如光纖束或液體光導(dǎo)的光導(dǎo)引導(dǎo)到環(huán)形照明裝置7，進入透鏡系統(tǒng)內(nèi)，該環(huán)形照明裝置進行外圍照明，最好照射一大于25平方厘米的區(qū)域。通過外圍照明激發(fā)的樣品所發(fā)射的光能通過透鏡4a和整個透鏡系統(tǒng)4，到達攝像機9，且在CCD探測器10上形成圖像。
圖2與圖1相同，用外延照明系統(tǒng)代替環(huán)形照明裝置。該外延照明由脈沖光源11、初始激勵濾波器12和二向色反射鏡13組成，由二向色反射鏡13將激勵波長反射到樣品上，并朝向攝像機透射樣品所發(fā)射的波長。
圖3與圖2相同，增加一快速快門14?？扉T14緊靠發(fā)射濾波器8，處于所有光線均接近光軸的位置。最好，快門14由可以使之不透明(關(guān))或透明(開)的材料制成，開關(guān)周期短于100微秒，且對比度超過200∶1。最好該快門在500至700納米的光波長之間的透射率大于20％。在一個最佳實施例中，快門14為FLC裝置，不過在發(fā)射光路中應(yīng)用快速動作的電子快門的原則是概括性的，快門14可以是任何其它快速動作的電子快門。例如，快門14可以由根據(jù)電場改變偏振的旋轉(zhuǎn)的鐵電材料組成的輸入偏振器，和設(shè)置于樣品3與CCD攝像機9之間的檢偏器(a polarizing analyzer)組成。
圖4表示出起源于平板一個角落處一個的光線A1-A3，如何通過快門14和發(fā)射濾波器8。還表示出分別發(fā)自平板中心和相對角落處的光線B1-B3和光線C1-C3?？扉T14和濾波器8處于通過透鏡4進行成像時，所預(yù)測的關(guān)于平板3的無限共軛位置處。快門14和濾波器8還設(shè)置成a)發(fā)射光線(如由線A1’-A3’，B1’-B3’和C1’-C3’所示)通過濾波器8的光軸的角度均接近于濾波器8的表面的法線，并以濾波器8的法線為中心，以及b)從平板3到濾波器8上光線的分布是均勻的。在所示結(jié)構(gòu)中，當(dāng)濾波器是干涉類型時，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠使發(fā)射濾波器8的動作所導(dǎo)致的光譜偏移最小。本實施例的特征在于，發(fā)射濾波器14處于透鏡4的無限共軛位置，該光束也相對法線以小角度入射在快門14上，優(yōu)點在于a)快門14的對比度最大；b)對于給定的最大入射角，發(fā)射濾波器8和快門14的尺寸最?。缓蚦)不可避免的快門14點缺陷的影響將在探測器上均勻分布，不在探測器10上所產(chǎn)生的圖像中產(chǎn)生亮斑或暗斑。
圖5表示本發(fā)明的系統(tǒng)的性能，與配備有最適宜的用于時間分辨熒光的元件的非成像時間分辨熒光計〔在這種情形中，以Wallac Victor2(Perkin Elmer Life Sciences)為例〕進行比較。用信噪比定義的銪的檢測極限為3∶1，這對于兩種儀器是相似的。如果說存在差別的話，本發(fā)明提供接近檢測極限的更高的性能。
圖6表示電子轟擊的CCD攝像機(Hamamatsu)的性能，在本發(fā)明中所采用的系統(tǒng)中實現(xiàn)。在這種情形中，在電子轟擊CCD探測器中實現(xiàn)的選通與使用安裝在透鏡4中的快速電子快門4不同。在這種結(jié)構(gòu)中，性能為增益等于非成像熒光計的增益。圖6說明可以通過多種形式的電子選通來實現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)，或者是通過發(fā)射路徑中的快門，或者是設(shè)置于探測裝置中的選通機構(gòu)。
從圖5和6將理解到，本發(fā)明使之可能在時間分辨成像熒光計系統(tǒng)中實現(xiàn)至少與最好的非成像熒光計同樣好的性能。
雖然為了說明的目的已經(jīng)披露了本發(fā)明的最佳實施例，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解到，在不偏離所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍和精神的條件下，可能進行多種另外的變型和替代。
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權(quán)利要求
1.一種成像系統(tǒng)，用于設(shè)置在容納介質(zhì)上的化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)樣品的時間分辨熒光計，在容納介質(zhì)處樣品受到照射，使它們發(fā)光，該成像系統(tǒng)包括一照明源，可以在小于大約100微秒的時間內(nèi)，從樣品處基本上全亮度調(diào)節(jié)到小于大約全亮度的1％；一照明系統(tǒng)，提供從光源到樣品附近區(qū)域的照明，樣品可以大于顯微鏡視場；一透鏡，用于收集被照射區(qū)域中所包含的樣品發(fā)射的光；一圖像形成裝置，設(shè)置成使來自樣品的光通過該透鏡，入射到該裝置上，并由該裝置產(chǎn)生該樣品發(fā)射圖像的顯示；一設(shè)置于樣品與圖像形成裝置之間的快門，包括一種可以使其不透明(關(guān))或透明(開)的結(jié)構(gòu)，其開關(guān)時間小于大約100微秒，并且開和關(guān)之間的對比度超過大約100∶1；以及一控制裝置，用于設(shè)置照明源的開關(guān)時間和快門的開/關(guān)時間。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中該快門為鐵電晶體裝置，被構(gòu)造成為偏振器，按照所施加的電場改變通過它的光的偏振的旋轉(zhuǎn)。
3.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，還包括一插在發(fā)射光路中樣品與成像形成裝置之間的檢偏器。
4.如權(quán)利要求1，2或3任一個所述的系統(tǒng)，其中該快門設(shè)置于透鏡內(nèi)，處于可產(chǎn)生最佳可能的對比度的位置。
5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中該透鏡具有如此構(gòu)成的光學(xué)裝置，及將快門設(shè)置于發(fā)射光的光路中，使光相對快門上法線的入射角不超過20°。
6.如前面任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中該容納介質(zhì)由多個設(shè)置于平板中的小池組成，并且將透鏡構(gòu)造成無視差地探測小池的全部內(nèi)容物。
7.如前面任一權(quán)利要求所述的照明系統(tǒng)，其中該照明源為閃光燈。
8.如前面任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中將該控制裝置構(gòu)造成通過多個開-關(guān)周期控制快門和照明源，且在多個周期中圖像形成裝置積累入射在其上的光。
9.如前面任一權(quán)利要求所述的成像系統(tǒng)，其中所發(fā)射的光在強度上表現(xiàn)出延遲，并且在照明樣品之后的衰減過程中不止一次地選通和斷開快門，以便獲得衰減過程中不同時刻的圖像。
10.如前面任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中該照明系統(tǒng)被構(gòu)造成將光源發(fā)出的光引導(dǎo)到透鏡中，并且朝向樣品引導(dǎo)到透鏡外部。
11.如前面任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，其中該照明系統(tǒng)包括一處于透鏡與樣品之間的分束器，該分束器被構(gòu)成將來自光源的光朝向樣品反射，并將來自樣品的發(fā)射光朝向透鏡透射。
12.如前面任一權(quán)利要求所述的系統(tǒng)，還包括一校正處理器，存儲快門關(guān)閉時瞬時熒光的泄漏圖像，并從隨后延遲的熒光圖像中減去該所存儲的泄漏圖像，以產(chǎn)生校正的延遲熒光圖像。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于對生化和醫(yī)學(xué)樣品中的時間分辨熒光進行成像的裝置和方法。按照一主要方面，該裝置包括一大孔徑透鏡，一處于照明光路中的閃光燈，一快速動作的固態(tài)快門或者一處于發(fā)射光路中的選通的探測器，一用于將均勻單色光照輸送到分布于帶微池平板中的多個小池的裝置，一高量子效率數(shù)字攝像機，和一計算機。在計算機的控制下，燈以很短的間隔發(fā)射脈沖。該快速動作的發(fā)射快門或者選通的探測器用于將攝像機的曝光限制于每個燈脈沖消失之后若干微妙的時間，在這個期間僅延遲的熒光被傳輸?shù)皆摂z像機。本發(fā)明同時實現(xiàn)了多個樣品的時間分辨的成像，具有高靈敏度和高處理量。
文檔編號G01N33/483GK1457428SQ02800409
公開日2003年11月19日 申請日期2002年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者卡洛斯·澤拉特, 保羅·登德斯, 阿姆德·耶克塔, 贊拉·馬索米, 彼德·拉姆 申請人:圖像研究公司