專利名稱：6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降解6-氨基青霉烷酸的細(xì)菌及其篩選方法。
背景技術(shù)：
抗生素廢水是一類含有難降解物質(zhì)和生物毒性物質(zhì)的高濃度有機(jī)廢水。近年來由于制藥工業(yè)的飛速發(fā)展，特別是抗生素的出現(xiàn)給中國(guó)甚至世界的水資源帶來了嚴(yán)重的污染。對(duì)抗生素廢水進(jìn)行合理有效的治理已經(jīng)迫在眉睫，這是關(guān)系到社會(huì)的發(fā)展以及人類未來的問題?？股貜U水的成分十分復(fù)雜，含有多種難降解的有機(jī)物和無機(jī)物，一般處理起來很困難，例如對(duì)于抗生素一般使用細(xì)菌對(duì)其降解，但其中所含的殘留物質(zhì)潔霉素對(duì)革蘭氏陽性菌和厭氧菌具有很強(qiáng)的抗性，由于諸如此類的特性，廢水處理起來十分困難。目前抗生素廢水處理方法主要有化學(xué)處理法、物化處理法(包括包埋法、混凝-沉淀法、光降解法、反滲透和膜分離技術(shù)、吸附法、電解法)、生物處理法以及多種組合法。其中生物處理法有處理?xiàng)l件溫和、費(fèi)用低、微生物適應(yīng)性強(qiáng)、易培養(yǎng)和可強(qiáng)化等優(yōu)點(diǎn)，故已廣泛應(yīng)用于抗生素廢水的處理。

在發(fā)酵及化學(xué)合成制藥廢水中，氨基青霉烷酸(6-APA)和阿莫西林是最常見的特征污染物。6 -APA作為制備具有重要商業(yè)價(jià)值的氨芐西林和阿莫西林的起始材料，可以通過青霉素V或青霉素G的酶水解來獲得，同時(shí)產(chǎn)生苯氧乙酸副產(chǎn)品。阿莫西林是一種廣譜β -內(nèi)酰胺類抗生素，屬于青霉素類有機(jī)物，用作獸藥，治療細(xì)菌感染的過程中遇到的腸道和全身感染。但化學(xué)法生產(chǎn)6-ΑΡΑ和阿莫西林造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，需要使用諸如吡啶、五氯化二磷和亞硝酰氯等危險(xiǎn)化學(xué)品。這些6-ΑΡΑ和阿莫西林制藥廢水主要來自設(shè)備的清潔、洗滌廢水，鍋爐吹下和地板清洗廢水。由于制定了嚴(yán)格的制藥工業(yè)廢水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)(從以前COD ( 300mgL-l減少到COD ( 120mgL_l)，所以，采取適當(dāng)?shù)募夹g(shù)處理含6-APA和阿莫西林制藥廢水已成為當(dāng)務(wù)之急。生物處理法有處理?xiàng)l件溫和、費(fèi)用低、微生物適應(yīng)性強(qiáng)、易培養(yǎng)和可強(qiáng)化等優(yōu)點(diǎn)，故已廣泛應(yīng)用于抗生素廢水的處理。而生物法最核心的也就是能夠降解特征污染物的細(xì)菌。所以，獲得高效降解6-APA的細(xì)菌是處理含6-APA廢水的關(guān)鍵之一。但目前，國(guó)內(nèi)外均沒有相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于篩選能夠高效降解6-APA的細(xì)菌。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一株6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2,其于2012年10月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6691。優(yōu)選地，所述6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2的16S rRNA基因序列GenBank 注冊(cè)號(hào)為 HQ840720。本發(fā)明的第二方面涉及上述的6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2的篩選方法，其包括步驟:先將采取的來自抗生素工廠排污溝的樣品放入到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入到分離培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，之后經(jīng)多代平板稀釋法進(jìn)行分離、純化，最終獲得純培養(yǎng)菌株，利用標(biāo)準(zhǔn)的菌種鑒定手段鑒定所述純培養(yǎng)菌株，其中所述富集培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖 20g、蛋白胨 4g、酵母粉 lg、牛肉膏 2g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6H200.lg、FeSO4.7H200.lg、維生素液10ml、微量元素液10ml,最后定溶于IL ;所述分離培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖 10g、6-APA5g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6Η200.lg、FeSO4.7Η200.lg、維生素液10ml、微量元素液10ml，最后定溶于IL ;其中維生素液的成分為鈷胺素0.0lg、抗壞血酸0.025g、核黃素0.025g、檸檬酸0.02g、吡多醛0.05g、葉酸0.0lg、對(duì)氨基苯甲酸0.0lg、肌酸 0.025g,微量元素液的成分為 MnSO4.7H200.0lg、ZnSO4.7Η200.05g、H3BO30.0lg、N(CH2COOH) 34.5g、CaCl2.2H200.0lg、Na2MoO40.0lg、CoCl2.6H200.2g、AlK (SO4) 20.0lg。本發(fā)明的第三方面涉及含有上述的6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2的組合物。優(yōu)選地，所述組合物能降解青霉素類、頭孢類抗生素生產(chǎn)廢水中的6-APA。本發(fā)明的第四方面涉及上述的6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2在處理含6-APA頭孢菌素的污染物中的用途。優(yōu)選地，所述污染物為污水。本發(fā)明的第五方面涉及上述的組合物在處理含6-APA頭孢菌素的污染物中的用途。優(yōu)選地，所述污染物為污水。換言之，本發(fā)明利用常規(guī)的篩選方法從抗生素生產(chǎn)廠家的排污溝里篩選出一株6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌博代氏〔桿〕菌Bordetella sp.L2。本發(fā)明的博代氏〔桿〕菌Bordetella sp.L2已于2012年10月18日在位于北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCCN0.6691，其建議的分類命名為博德特氏菌Bordetella SP.。該菌株的16S rRNA基因序列GenBank注冊(cè)號(hào)為HQ840720。菌株L2為需氧短桿菌，在pH值為8.0時(shí)，6-氨基青霉烷酸(6-APA)降解率約為28%。 該菌株降解6-APA能力較強(qiáng)，對(duì)含6-APA頭孢菌素產(chǎn)生廢水的處理具有現(xiàn)實(shí)意義和重要的工程應(yīng)用價(jià)值。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在本發(fā)明所獲得的上述6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌新種的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼T變而繼續(xù)提高其水解6-氨基青霉烷酸的能力，這樣的誘變后的基于本發(fā)明所述菌種的突變株也落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述誘變包括輻射、化學(xué)誘變等。同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可能將本發(fā)明獲得的上述菌株與其他導(dǎo)致污染的常見微生物的降解菌株共同使用，已達(dá)到同時(shí)消除多種污染抗生素的目的。


圖1:菌株 Bordetella sp.L2 的 16S rDNA 序列。圖2:菌株Bordetella sp.L2的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。圖3:菌株Bordetella sp.L2與其他菌株的16s rRNA基因序列相似性分析。圖4:菌株Bordetella sp.L2的透射電鏡照片。圖5:菌株Bordetella sp.L2菌落的高倍顯微鏡照片。圖6:菌株Bordetella sp.L2在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面將通過下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。實(shí)施例實(shí)施例1降解6-APA的功能菌的分離材料與方法1、培養(yǎng)基①富集培養(yǎng)基:葡萄糖，20g;蛋白胨，4g ;酵母粉，Ig ;牛肉膏，2g ；NaCl,4g ；K2HPO4,1.5g ；MgCl2.6Η20，0.Ig ；Fe S04.7Η20，0.Ig ;維生素液 IOml (鈷胺素，0.0lg ;抗壞血酸，0.025g ；核黃素，0.025g ;檸檬酸，0.02g ;吡多醛，0.05g ;葉酸，0.0lg ;對(duì)氨基苯甲酸，0.0lg ;肌酸，0.025g);微量元素液(MnSO4.7H20，0.0lg ；ZnSO4.7Η20，0.05g ;Η3Β03，0.0lg ;Ν(CH2COOH) 3，
4.5g ；CaCl2.2Η20，0.0lg ；Na2Mo04,0.0lg ；CoCl2.6Η20，0.2g ；Α1Κ(SO4)2,0.0lg) 10ml,最后定溶于1L。②分離培養(yǎng)基:葡萄糖IOg ；6-APA5g ;NaCl，4g ；K2HPO4,1.5g ；MgCl2.6Η20，0.Ig ；FeS04.7H20,0.1g ;維生素液IOml(鈷胺素,0.0lg ;抗壞血酸,0.025g ;核黃素，0.025g ;梓檬酸，0.02g ;批多醛，0.05g ;葉酸，0.0lg ;對(duì)氨基苯甲酸，0.0lg ;肌酸，0.025g);微量元素液(MnSO4.7H20，0.0lg ；ZnSO4.7Η20，0.05g ；H3BO3,0.0lg ;N (CH2COOH) 3，4.5g ；CaCl2.2Η20，0.0lg ；Na2Mo04,0.0lg ；CoCl2.6Η20，0.2g ；A1K(SO4)2,0.0lg) 10ml，最后定溶于 IL02、樣品采集和菌株分離樣品采自哈爾濱制藥總廠排污溝，取一定量水樣及土樣加入到富集培養(yǎng)基中于37°C搖床中培養(yǎng)2d，然后取5ml該培養(yǎng)液加入到IOOml分離培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2d，該培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后涂布分離培養(yǎng)基固體平皿，在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，通過劃線法進(jìn)一步分離純化，得到一株能夠降解6-氨基青霉烷酸(6-APA)的細(xì)菌，命名為L(zhǎng)2。實(shí)施例2菌株L2的菌種鑒定1、基因組DNA提取按照常規(guī)技術(shù)手段大量培養(yǎng)上述菌株L2，然后獲取其基因組DNA。2、菌株L2的16S rDNA的鑒定方法2.116S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建2.1.116S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增16S rRNA基因序列的兩端引物選用通用引物:正向引物BSF8/20:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO:1)和反向引物 BSR1541/20:5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' (SEQ ID NO:2)。PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L,反應(yīng)條件為 94°C變性5min ;接下來進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng):94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸90s ;然后72°C再延伸lOmin，最后于4°C保存。2.1.2擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及序列測(cè)定
PCR產(chǎn)物用TAKARA公司生產(chǎn)的pMD 18_T Vector克隆試劑盒進(jìn)行克隆，先將16S rRNA基因片段純化，連接到pMD 18-T Vector載體上，5 μ L連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，并用菌落PCR進(jìn)行鑒定。重組子的基因序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)定。2.1.3系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建運(yùn)用NCBI的BLAST程序比對(duì)數(shù)據(jù)庫中嗜鹽菌屬的16S rRNA基因序列和本研究中得到的16S rRNA基因序列。選擇相似性高的序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹用MEGA5.0軟件構(gòu)建。2.2菌株L2的16S rDNA的鑒定結(jié)果2.2.1菌株L2的16S rRNA基因序列擴(kuò)增菌株L2的16S rRNA基因序列，得到了長(zhǎng)度約1.5kb的擴(kuò)增片段。擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收、連接、克隆后測(cè)序，測(cè)得菌株L2的16S rDNA為1523bp (SEQ ID NO:3，同時(shí)請(qǐng)見圖1 )，該序列已提交NCBI數(shù)據(jù)庫，其收錄號(hào)為HQ840720。AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGGATGCTTTACACATGCAAGTCGGACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGGCAGGAAAGAAACGGCGCCAGCTAATACCTGGCGCTAATGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCTTCGGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAG AGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT (SEQ IDNO:3)。 2.2.2L2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和16S rRNA基因序列的相似性比較2.2.2.1L2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析將L2的序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中，運(yùn)用Blast程序?qū)⑦@株細(xì)菌和數(shù)據(jù)庫中的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，從數(shù)據(jù)庫中挑選與L2的16SrRNA基因序列具有較高相似性的菌株，再挑選同樣起源于Alcaligenaceae科的6株菌作為外群，利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。從圖中可以看出，L2與未培養(yǎng)的博德特氏菌(Bordetella)屬的2個(gè)菌株分在一個(gè)分支上，且相近的菌株 Uncultured Bordetella sp.clone Floct.34 和 UnculturedBordetella sp.clone Floct.23 都是未培養(yǎng)的細(xì)菌，雖然，也與 Bordetella trematumstrain DSM11334分在一個(gè)分支上，可能與Bordetella trematum strain DSM11334 的親緣關(guān)系較近，但不排除是新菌種的可能。2.2.2.2L2菌株16S rRNA基因序列的相似性比較為了比較各菌株間16S rRNA基因序列的相似性，通過DNAstar軟件的SequenceDistances程序獲得各菌株的16S rRNA基因序列相似性，見圖3，表I。從圖3 中可以得出，菌株 L2 與 Uncultured Bordetella sp.clone Floct.23、Uncultured Bordetella sp.clone Floct.34、Uncultured Bordetella sp.clone F2feb.7和 Bordetella trematum strain DSM11334 的序列同源性分別為 100%、99.9%、99.7% 和99.8%。菌株L2與許多未培養(yǎng)菌株相似性很高，它有可能是一個(gè)未被純培養(yǎng)的新菌株。從表I 中可以得出，菌株 L2 與菌株 Bordetella sp.MT-EKBordetella trematumstrain DSM11334、Bordetella sp.MT-12、Bordetella hinzii LMG13501、UnculturedBordetella sp.clone2cll 和Uncultured Bordetella sp.clone Fl jan.8 的相似性都比較高，均可以達(dá)到99%以上，且都為Boixletella屬的成員。這說明菌株L2為Boixletella屬的一個(gè)種。表I菌株L216S rDNA序列NCBI同源性檢索結(jié)果

權(quán)利要求
1.一株6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2,其于2012年10月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6691。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetellasp.L2,其特征在于其16S rRNA基因序列GenBank注冊(cè)號(hào)為HQ840720。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetellasp.L2的篩選方法，其包括步驟:先將采取的來自抗生素工廠排污溝的樣品放入到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入到分離培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，之后經(jīng)多代平板稀釋法進(jìn)行分離、純化，最終獲得純培養(yǎng)菌株，利用標(biāo)準(zhǔn)的菌種鑒定手段鑒定所述純培養(yǎng)菌株，其中所述富集培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖 20g、蛋白胨 4g、酵母粉 lg、牛肉膏 2g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6Η200.lg、FeS04-7H200.lg、維生素液10ml、微量元素液IOml,最后定溶于IL ;所述分離培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖 10g、6-APA5g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6Η200.lg、FeSO4.7Η200.lg、維生素液10ml、微量元素液10ml，最后定溶于IL ;其中維生素液的成分為鈷胺素0.0lg、抗壞血酸0.025g、核黃素0.025g、檸檬酸0.02g、吡多醛0.05g、葉酸0.0lg、對(duì)氨基苯甲酸0.0lg、肌酸 0.025g,微量元素液的成分為 MnSO4.7H200.0lg、ZnSO4.7Η200.05g、H3BO30.0lg、N(CH2COOH) 34.5g、CaCl2.2H200.0lg、Na2MoO40.0lg、CoCl2.6H200.2g、AlK (SO4) 20.0lg。
4.一種含有權(quán)利要求1或2所述的6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有權(quán)利要求1或2所述的6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2的組合物，其特征在于其能降解青霉素類、頭孢類抗生素生產(chǎn)廢水中的6-APA成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的6-氨基青霉燒酸降解細(xì)菌Bordetellasp.L2在處理含6-APA頭孢菌素的污染物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述污染物為污水。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的組合物在處理含6-APA頭孢菌素的污染物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途 ，其特征在于所述污染物為污水。
全文摘要
本發(fā)明涉及6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌及其篩選方法。具體而言，本發(fā)明涉及一株6-氨基青霉烷酸降解細(xì)菌Bordetella sp.L2，其于2012年10月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.6691，其16S rRNA基因序列GenBank注冊(cè)號(hào)為HQ840720。其為需氧短桿菌，在pH值為8.0時(shí)，其對(duì)6-氨基青霉烷酸(6-APA)的降解率約為28%。該菌株降解6-APA能力較強(qiáng)，對(duì)含6-APA頭孢菌素產(chǎn)生廢水的處理具有現(xiàn)實(shí)意義和重要的工程應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C02F101/38GK103184177SQ20121056849
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者林海龍, 陳先明, 關(guān)旸, 陳兆波, 王曉雨, 王銳, 范陽 申請(qǐng)人:中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司