一種手性苯甲亞砜的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟：將PseudomonasmonteiliiZMU-T05，保藏號為：CCTCC?NO：M2013683在121℃滅菌20min的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于28℃靜置培養(yǎng)12h后挑取單菌落，作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24h后于4℃保存?zhèn)溆?；常?guī)細胞培養(yǎng)；常規(guī)生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明獲得的產(chǎn)品光學純度高、成本低且安全環(huán)保。
【專利說明】—種手性苯甲亞砜的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物催化與手性合成【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種手性苯甲亞砜的制備方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]手性亞砜作為一類重要的生物活性物質(zhì)和臨床藥物，在有機合成和藥物合成中有非常廣泛的應用。手性亞砜是一類重要的生物活性物質(zhì)和臨床藥物，而單加氧酶催化硫醚底物的不對稱氧化反應，是合成亞砜類化合物的新途徑之一。高活性、高選擇性和高底物耐受性硫醚單加氧酶產(chǎn)生菌株的發(fā)現(xiàn)與獲得，仍然是生物氧化反應發(fā)展過程中的難點和瓶頸。
[0004]目前所知除了一些金屬催化劑能有效催化硫醚底物的不對稱氧化反應外，而當前大多數(shù)過渡金屬催化劑或者有機小分子催化劑在催化硫醚類底物的不對稱氧化反應中還存在過度氧化、副產(chǎn)物多和反應條件苛刻等不足。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述缺點而提供一種能獲得光學純度高、成本低且安全環(huán)保的手性苯甲亞砜的制備方法。
[0007]本發(fā)明的一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的準備:在121°c滅菌20min的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于28 1:靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落，作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 V保存?zhèn)溆茫?br> (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 1:和8000 rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化:將所培養(yǎng)菌株的濕細胞，以10g /L的細胞濃度懸浮于5 mL、pH為7.0的緩沖液中，將底物苯甲硫醚18.6 mg加入到反應體系之中，放入搖床反應(30 0C, 300 rpm),HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，獲得手性苯甲亞砜。
[0008] 上述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:菌種為本課題組自行篩選分離所得的蒙氏假單胞菌ZMU-T05，保藏號為:CCTCC NO:M2013683 (保藏日期:2013年12月23日，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學)，既可以采用休止細胞，生長中的細胞，也可以是固定化的細胞，或者使用其所含的氧化酶。[0009]上述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:LB培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L，pH 6.8-7.0 ；M9培養(yǎng)基的配方為十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g，氯化鈉0.5 g，氯化銨1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，上述成分滅菌后冷卻至40 V -50 °C再加入I mL MT (FeSO4.7H20:4.87g，MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g, H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g,CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:0.84g，HCl:83 mL (注:濃 HCl 物質(zhì)量濃度為 12mol/L)將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL)、2 mL IMMgSO4o
[0010]上述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:緩沖液為Na2HPO4-KH2PO4緩沖液。
[0011]上述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:有機溶劑為甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺等；有機溶劑的加入量為反應體系體積的5%。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下明顯的優(yōu)點和有益的效果，從以上技術(shù)方案可知:在生物催化反應中，有機溶劑的影響，涉及到溶劑對酶的抑制作用，對活性中心的修飾作用以及底物的溶解性、分散度等等諸多因素。水相反應中加入少量的有機溶劑有時也會對反應有明顯的影響，經(jīng)實驗證實加入了所選的有機溶劑，反應的轉(zhuǎn)化率有所降低，而對映選擇性則基本上沒有什么改變。實驗,Pseudomonas monteilii CCTCC M2013683細菌細胞內(nèi)含有高立體選擇性的氧化酶，能有效的催化苯甲硫醚的不對稱氧化反應，合成手性苯甲亞砜。由于苯甲硫醚易于合成且價格便宜，以其作為底物以水為介質(zhì)的環(huán)境中進行不對稱氧化反應獲取手性苯甲亞砜是非常經(jīng)濟有效的制備途徑。
[0013]本發(fā)明的【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0014]
【具體實施方式】
[0015]實施例1
一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的準備Pseudomonasmonteilii CCTCC M2013683 在 121°C滅菌 20 min 的LB培養(yǎng)基平板上劃線,于28。(!'靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落,作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 1:保存?zhèn)溆茫?br> (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L，pH 6.8-7.0)的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基(十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g,氯化鈉0.5 g,氯化銨1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸懼水1000 mL,上述成分滅菌后冷卻至 40 0C ~50 °C再加入 I mL MT (FeSO4.7H20:4.87g, MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g,H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g, CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:0.84g , HCl:83 mL (注:濃HCl物質(zhì)量濃度為12mol/L)將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL)、2 mL IM MgSO4)的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 °〇和8000rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞(細胞內(nèi)含有選擇性的硫醚氧化酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化-MPseudomonasmonteilii CCTCC M2013683 濕細胞 0.5 g，懸浮于 50 mL、pH 7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物苯甲硫醚18.6 mg加入到上述的5 mL反應體系之中，放入搖床反應(30 0C , 300 rpm), HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0?)-苯甲亞砜。99%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性HPLC分析，99% ee。
[0016]產(chǎn)物分析:
(1)苯甲亞砜的1H NMR 和 13C NMR 如下=1H NMR (CDCl3, 500 Hz): δ 7.35-7.36 (m, 2H,Ph), 7.32-7.33 (m, 3H, Ph), 2.61 (s, 3H, CH3) ; 13C NMR (CDCl3, 75Ηζ): δ 147.6，131.0,130.9，123.4，121.5，124.2，43.8.(2)采用OD-H手性柱進行HPLC分析，流動相速度為lmL/min，流動相比例為異丙醇:正己烷=5: 95，兩種構(gòu)型的保留時間分別為tE=20.238min, ts=28.230min。
[0017]實施例2
一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的準備Pseudomonasmonteilii CCTCC M2013683 在 121°C滅菌 20 min 的LB培養(yǎng)基平板上劃線,于28。(!'靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落,作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 1:保存?zhèn)溆茫?br> (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L，pH 6.8-7.0)的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基(十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g,氯化鈉0.5 g,氯化銨1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸懼水1000 mL,上述成分滅菌后冷卻至 40 0C ~50 °C再加入 I mL MT (FeSO4.7H20:4.87g, MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g,H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g, CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:
0.84g , HCl:83 mL (注:濃HCl物質(zhì)量濃度為12mol/L)將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL)、2 mL IM MgSO4)的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 °〇和8000rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞(細胞內(nèi)含有選擇性的硫醚氧化酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化- MPseudomonasmonteilii CCTCC M2013683 濕細胞 0.5 g，懸浮于 50 mL、pH 7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物2-氯乙基苯基硫醚7.9 mg加入到上述的5 mL反應體系之中，放入搖床反應(30 0C, 300 rpm), HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0?)-2-氯乙基苯基亞砜。69%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性HPLC分析，92% ee。
[0018]產(chǎn)物分析:
(1)2-氯乙基苯基亞砜的1H NMR 和 13C NMR如下=1HNMR (CDCl3, 500 Hz): δ 7.53-7.55(m, 2H, Ph)，7.43-7.45 (m, 3H, Ph)，3.88 (q, 1H, CH2Cl)，3.55 (q, 1H, CH2Cl)，3.07 (t,J=IO Hz, 2H, CH2CH2) ; 13C NMR (CDCl3, 75Hz): δ 142.6，131.3，129.4，123.7，59.1,53.5.(2)采用OD-H手性柱進行HPLC分析，流動相速度為lmL/min，流動相比例為異丙醇:正己燒=5: 95,兩種構(gòu)型的保留時間分別為tK=14.315min, ts=14.753min。[0019]實施例3
一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的準備.:\%Pseudomoims monteilii CCTCC M2013683 (從西南地區(qū)選取獨特的土壤和活性污泥樣本，采用多次富集培養(yǎng)和分離所得菌株)在121°C滅菌20 min的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于28 1:靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落，作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 1:保存?zhèn)溆茫?br> (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L，pH 6.8-7.0)的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基(十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g,氯化鈉0.5 g,氯化銨1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸懼水1000 mL,上述成分滅菌后冷卻至 40 0C ~50 °C再加入 I mL MT (FeSO4.7H20:4.87g, MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g,H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g, CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:
0.84g , HCl:83 mL (注:濃HCl物質(zhì)量濃度為12mol/L)將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL)、2 mL IM MgSO4)的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 °〇和8000rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞(細胞內(nèi)含有選擇性的硫醚氧化酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化-MPseudomonasmonteilii CCTCC M2013683 濕細胞 0.5 g，懸浮于 50 mL、pH 7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物烯丙基苯硫醚6.8 mg加入到上述的5 mL反應體系之中，放入搖床反應(30 0C, 300 rpm), HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0?)-烯丙基苯亞砜。99%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性HPLC分析，64%eeD
[0020]產(chǎn)物分析:
(1)烯丙基苯亞砜的1H NMR 和 13C NMR 如下=1H NMR (CDCl3, 500 Hz): δ 7.34-7.24 (m,4H), 7.20-7.16 (m, 1H)，5.48-5.51 (m, 1H)，5.16-5.19 (m, 2H)，3.56-3.53 (m, 2H) ; 13CNMR (CDCl3, 75Ηζ): δ 132.1，131.5，129.6，128.7，124.6，117.6，38.9.(2)采用OD-H手性柱進行HPLC分析，流動相速度為lmL/min，流動相比例為異丙醇:正己燒=10: 90,兩種構(gòu)型的保留時間分別為tK=9.995min, ts=12.216min。
[0021]實施例4:
一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的準備.:\%Pseudomoims monteilii CCTCC M2013683 (從西南地區(qū)選取獨特的土壤和活性污泥樣本，采用多次富集培養(yǎng)和分離所得菌株)在121°C滅菌20 min的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于28 1:靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落，作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 1:保存?zhèn)溆茫?br> (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L，pH 6.8-7.0)的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基(十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g,氯化鈉0.5 g,氯化銨1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸懼水1000 mL,上述成分滅菌后冷卻至 40 0C ~50 °C再加入 I mL MT (FeSO4.7H20:4.87g, MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g,H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g, CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:
0.84g , HCl:83 mL (注:濃HCl物質(zhì)量濃度為12mol/L)將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL)、2 mL IM MgSO4)的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 °〇和8000rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞(細胞內(nèi)含有選擇性的硫醚氧化酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化-MPseudomonas monteilii CCTCC M2013683 濕細胞0.5 g，懸浮于 50 mL、pH 7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物甲基萘硫醚8.7 mg加入到上述的5 mL反應體系之中，放入搖床反應(30 °C, 300 rpm), HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到(K)-甲基萘亞砜。99%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性HPLC分析，99% ee。
[0022]產(chǎn)物分析:
(1)甲基萘亞砜的1H NMR 和 13C NMR 如下=1H NMR (CDCl3, 500 Hz): δ 7.43-7.53 (m,5H, Ph), 3.85 (q, 1H, CH2Cl), 3.55 (q, 1H, CH2Cl), 3.07 (t, J=IO Hz, 2H, CH2CH2) ; 13CNMR(CDCl3, 75Hz): δ 142.6，131.3，129.4，123.7，59.1, 53.5.(2)采用OD-H手性柱進行HPLC分析，流動相速度為lmL/min，流動相比例為異丙醇:正己燒=5: 95,兩種構(gòu)型的保留時間分別為tK=15.587min, ts=16.504min。
[0023]實施例5:
一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的準備.:\%Pseudomoims monteilii CCTCC M2013683 (從西南地區(qū)選取獨特的土壤和活性污泥樣本，采用多次富集培養(yǎng)和分離所得菌株)在121°C滅菌20 min的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于28 1:靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落，作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 1:保存?zhèn)溆茫?br> (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1.0 L，pH 6.8-7.0)的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基(十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g,氯化鈉0.5 g,氯化銨1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸懼水1000 mL,上述成分滅菌后冷卻至 40 0C ~50 °C再加入 I mL MT (FeSO4.7H20:4.87g, MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g,H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g, CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:
0.84g , HCl:83 mL (注:濃HCl物質(zhì)量濃度為12mol/L)將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL)、2 mL IM MgSO4)的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 °〇和8000rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞(細胞內(nèi)含有選擇性的硫醚氧化酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化-MPseudomonasmonteilii CCTCC M2013683 濕細胞 0.5 g，懸浮于 50 mL、pH 7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物3-氯苯甲硫醚7.9 mg加入到上述的5 mL反應體系之中，放入搖床反應(30 0C, 300 rpm), HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0?)-3_氯苯甲亞砜。54%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性HPLC分析，63%
eeD
[0024]產(chǎn)物分析:
(1)3-氯苯甲亞砜的 1H NMR 和 13C NMR如下,HNMR (CDCl3, 500 Hz): δ 7.52-7.54 (m,2H), 7.38-7.41 (m, 3H)，2.60 (s, 3H) ; 13C NMR (CDCl3, 75Ηζ): δ 145.0, 13.0.9，129.2，127.1, 123.3，43.8.(2)采用OD-H手性柱進行HPLC分析，流動相速度為lmL/min，流動相比例為異丙醇:正己燒=5: 95,兩種構(gòu)型的保留時間分別為tE=20.868min, ts=21.898min。
[0025]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與 修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種手性苯甲亞砜的制備方法，包括以下步驟: (1)菌株的準備:在121°c滅菌20min的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于28 1:靜置培養(yǎng)12 h后挑取單菌落，作為種子于M9培養(yǎng)基平板上劃線，甲苯誘導靜置培養(yǎng)，生長24 h后于4 V保存?zhèn)溆茫? (2)細胞的培養(yǎng):挑取上述M9培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL LB培養(yǎng)基的50 mL的搖瓶中，在30 1:和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)8 h后，按二級誘導培養(yǎng)菌液初始OD值為0.1為標準的接種量接種于含有50 mL M9培養(yǎng)基的250 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)18 h后取出，在4 1:和8000 rpm的條件下離心去除上清液，獲得菌株的濕細胞備用； (3)生物轉(zhuǎn)化:將所培養(yǎng)菌株的濕細胞，以10g /L的細胞濃度懸浮于5 mL、pH為7.0的緩沖液中，將底物苯甲硫醚18.6 mg加入到反應體系之中，放入搖床反應(30 0C, 300 rpm),HPLC跟蹤反應，反應24小時，反應結(jié)束后，反應液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，獲得手性苯甲亞砜。
2.如權(quán)利要求1所述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:菌種為Aewt/offioftasmonteilii ZMU-T05’保藏號為:CCTCC NO:M2013683,既可以采用休止細胞，生長中的細胞，也可以是固定化的細胞，或者使用其所含的氧化酶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中:LB培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,瓊脂15.0 g,蒸懼水1.0L, pH 6.8-7.0 ； M9培養(yǎng)基的配方為十二水磷酸氫二鈉17.1 g，磷酸二氫鉀3.0 g，氯化鈉0.5 g，氯化銨1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，上述成分滅菌后冷卻至40 V~50 °C再加入I mL MT,2mL IMMgSO4 ;其中 MT 的制備方法為=FeSO4.7H20:4.87g, MnCl2.4H20:1.50g, ZnSO4:1.05g,H3BO3:0.3g, CaCl2.2H20:4.12g, Na2MoO4.2H20:0.25g, CuCl2.2H20:0.15g, Na2EDTA.2H20:0.84g，12mol/L濃度的HCl:83 mL，將上述物質(zhì)溶解后補足蒸餾水至1000 mL。
4.如權(quán)利要求3所述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:緩沖液為Na2HPO4-KH2PO4緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的一種手性苯甲亞砜的制備方法，其中:有機溶劑為甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺等；有機溶劑的加入量為反應體系體積的5%。
【文檔編號】C12R1/38GK104017836SQ201410202683
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】陳永正, 卓俊睿, 鄭代軍, 楊敏 申請人:遵義醫(yī)學院