專利名稱：多孔聚合物珠狀載體高分子材料的生產(chǎn)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過單體相的相翻轉(zhuǎn)懸浮聚合來生產(chǎn)一種珠狀，交聯(lián)，親水性，對于帶有親核性基團(tuán)的配體具有結(jié)合活性的混合聚合物的工藝。此外，本發(fā)明還涉及了對青霉素酰胺酶有高結(jié)合能力，且低膨脹系數(shù)的載體高分子材料以及它們的應(yīng)用。
蛋白質(zhì)，特別是酶的多孔高分子載體材料已被充分認(rèn)識(shí)。其應(yīng)用領(lǐng)域在醫(yī)學(xué)范疇，例如借助青霉素酰胺酶使諸如青霉素G的β-內(nèi)酰胺抗生素進(jìn)行酶的分裂為6-氨基青霉烷酸(6-APA)。重要的發(fā)展目標(biāo)首先是盡可能高的負(fù)載能力，但是也要有低膨脹率以及盡可能少的殘余溶劑含量。生產(chǎn)時(shí)原則上應(yīng)避免使用鹵化溶劑。
DE-OS 2237316描述了一種通過含有自由基引發(fā)劑的單體混合物進(jìn)行自由基聚合生產(chǎn)珠狀交聯(lián)的混合聚合物的工藝，該單體混合物含有一種對生物物質(zhì)有結(jié)合活性的單體、一種交聯(lián)用共聚單體和至少一種其它共聚單體，其中單體混合物在非極性有機(jī)液體中懸浮成滴并聚合。作為非極性有機(jī)液體特別合適的是脂肪族烴類，首選那些帶8個(gè)或更多個(gè)C原子的。在實(shí)施例中使用正庚烷和四氯乙烯的混合物。單體相和連續(xù)有機(jī)相的比在1∶1和1∶10之間，但優(yōu)選1∶1．5和1∶4之間的比。
DE-A 3106456描述了一種相對于DE-OS 2237316中聚合珠粒結(jié)合能力有改善的工藝。當(dāng)載體高分子中交聯(lián)單體含量高，和當(dāng)由單體和稀釋劑構(gòu)成的單體相中含有溶劑混合物作為稀釋劑時(shí)，可獲得對蛋白質(zhì)，特別是對青霉素酰胺酶特別高的結(jié)合能力。合適的混合物例如有水／甲醇或甲酰胺／甲醇。單體和稀釋劑的比約為1∶2．6。有機(jī)連續(xù)相使用正己烷和四氯乙烯的混合物。實(shí)施例中單體相和連續(xù)有機(jī)相的比約為1∶2．8。單體混合物中50wt．％的交聯(lián)劑組份以及應(yīng)用水／甲醇作為稀釋劑可得到具有作為青霉素酰胺酶活性測量的最高為125U／g的結(jié)合能力的載體高分子。
本發(fā)明的主題基于生產(chǎn)珠狀，交聯(lián)的混合聚合物的改進(jìn)工藝。對此應(yīng)放棄在有機(jī)連續(xù)相中使用鹵化溶劑，同時(shí)在標(biāo)準(zhǔn)化條件(1g載體高分子材料負(fù)載1530個(gè)單位青霉素酰胺酶)達(dá)到至少220[U／g濕態(tài)]的對青霉素酰胺酶(EC 3．5．1．11)的結(jié)合能力。此外，聚合物珠在水中的膨脹率以膨脹系數(shù)表示(ml濕態(tài)／ml干態(tài))的值不高于1．5。
解決此主題是通過一種由單體和稀釋劑組成的單體相的翻轉(zhuǎn)珠狀聚合來生產(chǎn)珠狀、交聯(lián)、親水的、相對于帶親核基團(tuán)的配體具有結(jié)合活性的混合聚合物的工藝，其中作為單體含有a)5-40wt．％親水性可自由基聚合的含乙烯基單體，室溫下構(gòu)成至少10％的水溶液，b)30-50wt．％可自由基聚合含乙烯基并附加官能基團(tuán)的單體，它能在與配體的親核基團(tuán)發(fā)生類似聚合物的反應(yīng)中引入共價(jià)鍵，c)20-60wt．％親水性，交聯(lián)，可自由基聚合的帶兩個(gè)或多個(gè)烯類不飽和可聚合基團(tuán)的單體，并且附加一點(diǎn)，a)、b)和c)加入量總和為100wt．％，作為稀釋劑使用甲醇和水的比為1∶1．0至1∶4．0的混合物，其中單體相在5-7個(gè)碳原子的脂肪族烴的有機(jī)溶劑組成的連續(xù)相中分散成滴狀，單體相和連續(xù)相的比為1∶2．0至1∶4．0，這樣在聚合引發(fā)劑和保護(hù)膠體存在下進(jìn)行自由基聚合，并且單體和稀釋劑的比為1∶1．7至1∶2．4。
應(yīng)用本發(fā)明的工藝可得到一類新的載體高分子材料，它對青霉素酰胺酶的負(fù)載能力至少為220[U／g濕態(tài)]，來自于1530個(gè)單位的青霉素酰胺酶與1g載體高分子材料的反應(yīng)，膨脹系數(shù)至多為1．5。
不可預(yù)料的是，確定彼此不同的工藝參數(shù)會(huì)明顯提高對青霉素酰胺酶的結(jié)合能力，但同時(shí)膨脹率下降。也令人驚喜的是，應(yīng)用本發(fā)明的工藝，通過選擇帶5-7個(gè)碳原子的脂肪烴類有機(jī)溶劑，能放棄使用鹵代烴，例如四氯乙烯，它目前為止主要用于相的密度平衡。
單體為保證單體混合物的親水性，它的主要部分必須由親水性單體組成。所謂的親水性單體是指那些在室溫下至少形成10％的水溶液，優(yōu)選不含離子基團(tuán)或不含通過加入酸或堿可離子化基團(tuán)的單體。
單體a)是5-40，8-35，特別是9-12wt．％的親水性可自由基聚合的帶乙烯基的單體，它們在室溫下形成至少10wt．％的水溶液。
作為單體a)特別合適的是丙烯酰胺和／或甲基丙烯酰胺，其中優(yōu)選甲基丙烯酰胺。其他的例子有不飽和可聚合羧酸的羥基烷基酯，如丙烯酸羥乙酯和甲基丙烯酸羥乙酯或N-乙烯基吡咯烷酮。
單體b)是30-50，優(yōu)選35-45wt．％的可自由基聚合的帶乙烯帶和附加官能基團(tuán)，優(yōu)選環(huán)氧乙烷基團(tuán)(環(huán)氧基團(tuán))的單體，它能在與配體的親核基團(tuán)發(fā)生類似聚合的反應(yīng)中引入共價(jià)鍵。環(huán)氧乙烷基團(tuán)特別適于連接配體得到生物活性。
優(yōu)選的單體b)是甲基丙烯酸縮水甘油酯和／或烯丙基縮水甘油醚。特別優(yōu)選兩種單體以大約同樣的量同時(shí)使用。
單體c)是20-60，特別是25-55，特別優(yōu)選40-55wt．％的親水性，可交聯(lián)，自由基聚合的帶兩個(gè)或多個(gè)烯類不飽和可聚合基團(tuán)的單體。
優(yōu)選的單體c)是N，N＇-亞甲基-二(丙烯酰胺)或N，N＇-亞甲基-二(甲基丙烯酰胺)。特別優(yōu)選N，N＇-亞甲基-二(甲基丙烯酰胺)。同樣也可能使用0-10wt．％其它種交聯(lián)，可自由基聚合的，帶兩個(gè)或多個(gè)烯類不飽和可聚合基團(tuán)的單體。合適的是親水性二(甲基)丙烯酸酯，例如聚氧化乙烯-二(甲基)丙烯酸酯。
單體a)，b)和c)相加總量為100wt．％。
稀釋劑單體相由單體a)-c)組成，它們?nèi)芙庠诒仨毷羌状己退?∶1．0至1∶40配比的混合物的稀釋劑中。甲醇和水特別有利的混合比是1∶1．2至1∶2．5，特別是1∶1．3至1∶1．7。
單體和稀釋劑的比單體和稀釋劑的比特別嚴(yán)格。它必須在1∶1．7至1∶2．4的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在1．9至2．1范圍內(nèi)。
連續(xù)相作為連續(xù)相合適的帶4至7個(gè)C原子的脂肪烴有機(jī)溶劑。優(yōu)選正庚烷，特別優(yōu)選環(huán)己烷。
單體相／連續(xù)相的比單體相和連續(xù)相通過有機(jī)溶劑構(gòu)成的比必須是1∶2．0至1∶4．0，優(yōu)選1∶2．8至1∶3．3之間。
其它的工藝條件作為其它組分，懸浮的單體相含有以已知方法的聚合引發(fā)劑，優(yōu)選無硫引發(fā)劑，特別優(yōu)選4，4＇-偶氮-二(4-戊酸)，以及保護(hù)膠體(乳化劑)，例如分子量(重均)為30，000至80，000的由95份甲基丙烯酸正丁酯和5份甲基丙烯酸-2-三甲基銨乙酯氯化物的混合聚合物。
此外珠狀聚合(也稱作懸浮聚合)按已知方法實(shí)施，通過例如先加入連續(xù)相和保護(hù)膠體，也存在引發(fā)劑的單體相在例如40-60℃下借助攪拌分散在有機(jī)相中，然后升溫至60-70℃。水／甲醇混合物可以例如在近似完全共沸狀態(tài)下保持多于6小時(shí)?；旌狭霞s反應(yīng)3-5小時(shí)結(jié)束，然后冷卻至室溫。將形成的珠粒吸引出，例如真空干燥12小時(shí)，也可將珠狀聚合物過濾，用水洗。優(yōu)選在流化床干燥器內(nèi)干燥，因?yàn)檫@樣可特別有效地排除溶劑殘余物。所得的聚合物珠(載體高分子材料)的大小為50-500μm，特別是120-250μm。所謂的結(jié)合能力是指酶的活性，它在載體高分子材料對某種酶的最大負(fù)載量下達(dá)到。本發(fā)明的載體高分子材料的重要應(yīng)用領(lǐng)域是青霉素G借助E．coli的已結(jié)合的青霉素酰胺酶分裂為6-氨基青霉烷酸(6-APA)。結(jié)合能力作為青霉素酰胺酶的活性表示為每克載體聚合物珠上的單元數(shù)[U／g濕態(tài)]。本發(fā)明的載體高分子珠的結(jié)合能力按這種測量方法至少為220[U／g濕態(tài)]。
聚合物珠在水中的膨脹率通過膨脹系數(shù)[ml濕態(tài)／ml干態(tài)]表示。本發(fā)明的載體高分子珠的膨脹系數(shù)不大于1．5。
本發(fā)明的載體高分子材料可以用于在攪拌或連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)釜中借助已有的環(huán)氧乙烷基團(tuán)共價(jià)鍵合配體。這例如通過共價(jià)鍵從濃溶液中吸附蛋白質(zhì)，特別是酶，在保持生物活性不變的情況下進(jìn)行。此外，肽，氨基酸，β-內(nèi)酰胺抗生素，脂類，核苷酸，多元核苷酸，低分子量親核化合物或金屬有機(jī)化合物也可與載體珠的環(huán)氧乙烷基團(tuán)反應(yīng)。
載有配體的聚合物珠可用于按已知方法立構(gòu)專一性地合成手性物質(zhì)，如氨基酸(d-苯基丙氨基，p-羥基-d-苯基丙氨酸，1-叔-白氨酸)或藥物，例如異丁苯丙酸。同樣，它們也作為青霉素G酶分裂為6-氨基青霉烷酸(6-APA)，頭孢菌素酶G分裂為7-氨基去乙?；^孢菌素酸(7-ADCA)或頭孢菌素C酶分裂為7-氨基頭孢菌素酸(7-ACA)中的載體使用。本工藝的介紹參見已注冊協(xié)會(huì)DECHEMA的1996年DECHEMA年會(huì)摘要，第一冊。其它的應(yīng)用領(lǐng)域是底物的專一性酶合成，例如上述分裂為羥氨芐青霉素和氨芐青霉素的產(chǎn)物。另外的應(yīng)用領(lǐng)域是合成用于化學(xué)合成的純化學(xué)品或基本產(chǎn)物(例如蘋果酸)。聚合物珠也用于吸附色譜或凝膠滲透色譜的分離技術(shù)中。用于專一性吸附的聚合物珠負(fù)載抗血清的免疫球球蛋白組分或單克隆抗體。作為其它的使用領(lǐng)域有，使用負(fù)載酶或抗體的載體高分子材料作為體外療法中從全血中排除血病原物質(zhì)或有毒物質(zhì)的吸附材料。
實(shí)施例(下面的測定方法對多孔載體高分子材料領(lǐng)域的專業(yè)人員是常用的，只是從完備性考慮只部分列出)E．coli的青霉素酰胺酶(=青霉素G-酰胺酶)的結(jié)合能力的測定(EC 3．5．1．11)a)載體高分子材料上青霉素酰胺酶的共價(jià)鍵合1g載體高分子材料加到5ml消毒的1M磷酸鉀緩沖液(pH7．5)中的1530個(gè)青霉素酰胺酶單元，在23℃孵化48小時(shí)。
然后，聚合物珠加到燒結(jié)玻璃漏斗(孔隙率2或3)并用去離子水洗兩次，接著用0．1M含0．05％4-羥基苯甲酸乙酯的磷酸鉀緩沖液(pH7．5)借助漏斗的抽吸洗兩次。對所得的負(fù)載青霉素酰胺酶的珠的濕重加以測定。b)結(jié)合能力的測定250-300mg濕的用青霉素酰胺酶偶聯(lián)的載體高分子材料(聚合物珠)加入37℃ 20ml 2％青霉素-G在0．05M pH7．5的，含0．05％ 4-羥基苯甲酸乙酯的磷酸鉀緩沖液中的溶液。在均勻的攪拌下用0．5MNaOH滴定產(chǎn)生的游離苯基醋酸，保持pH值恒定在7．8約10分鐘，記錄NaOH的消耗量。
然后，聚合物珠如a)中一樣借助從20ml 0．05M pH為7．5的，含0．05％ 4-羥基苯甲酸乙酯的磷酸鉀緩沖溶液中通過玻璃漏斗抽吸得到，這種測定重復(fù)兩次。c)結(jié)合能力的計(jì)算測量曲線的線性范圍(通常范圍為1-5分鐘)作為計(jì)算的基礎(chǔ)并外推到10分鐘的間隔。結(jié)合能力作為每克濕載體高分子材料的青霉素酰胺酶單位(U／g濕態(tài))來說明。一個(gè)單位相應(yīng)于每分鐘μmol氫化青霉素G(μmol／min)，這里110．5M NaOH與550μmol氫化的青霉素G相當(dāng)(載體高分子材料的含水量大約恒定，因此忽略。)
下表列出了實(shí)施例1-3的重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)和結(jié)果。
權(quán)利要求
1．一種通過由單體和稀釋劑組成的單體相的相翻轉(zhuǎn)珠狀聚合生產(chǎn)珠狀、交聯(lián)、親水性、對帶親核基團(tuán)的配體有結(jié)合性的混合聚合物的工藝，其中含有的單體是a)5-40wt．％親水性可自由基聚合的帶乙烯基的單體，它在室溫形成至少10％的水溶液，b)30-50wt．％可自由基聚合的帶乙烯基和附加的官能基團(tuán)的單體，它能在與配體的親核基團(tuán)發(fā)生類似聚合的反應(yīng)過程中引入共價(jià)鍵，c)20-60wt．％可交聯(lián)自由基聚合的帶兩個(gè)或多個(gè)乙烯類不飽和可聚合基團(tuán)的單體，并且，a)，b)和c)相加量總計(jì)為100wt．％，作為稀釋劑使用甲醇和水以1∶1．0至1∶4．0配比的混合物，這里，單體相在帶5-7個(gè)碳原子的脂肪族烴的有機(jī)溶劑形成的連續(xù)相中分散成滴狀，其中單體相和連續(xù)相的比為1∶2．0至1∶4．0，這樣在聚合引發(fā)劑和保護(hù)膠體存在下進(jìn)行自由基聚合，并且單體和稀釋劑的比為1∶1．7至1∶2．4。
2．權(quán)利要求1的工藝，其特征為，作為單體使用a)丙烯酰胺和／或甲基丙烯酰胺b)甲基丙烯酸縮水甘油酯和／或烯丙基縮水甘油醚c)亞甲基-二丙烯酰胺或亞甲基-二甲基丙烯酰胺。
3．權(quán)利要求1的工藝，其特征為，作為有溶劑使用環(huán)己烷。
4．按權(quán)利要求1至3中一項(xiàng)或多項(xiàng)的工藝可生產(chǎn)的載體高分子材料，其特征為，對E．coli的青霉素酰胺霉的結(jié)合能力至少為220[U／g，濕態(tài)]，源于1530個(gè)單位的青霉素酰胺酶和1g載體高分子材料的反應(yīng)，且其膨脹系數(shù)至多為1．5。
5．權(quán)利要求4的載體高分子材料的用途，用于結(jié)合蛋白質(zhì)。
6．權(quán)利要求5的載體高分子材料的用途，用于結(jié)合酶。
7．權(quán)利要求5的載體高分子材料的用途，用于結(jié)合抗體。
8．權(quán)利要求4的載體高分子材料的用途，用在色譜中。
9．權(quán)利要求4的載體高分子材料的用途，用于合成藥物。
10．權(quán)利要求4的載體高分子材料的用途，用于手性物質(zhì)的立構(gòu)專一性合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過單體相的相翻轉(zhuǎn)珠聚合來生產(chǎn)珠狀,交聯(lián),親水性,對帶親核基團(tuán)的配體有結(jié)合活性的混合聚合物。本發(fā)明涉及對青霉素酰胺酶有高結(jié)合性的且低膨脹系數(shù)的載體高分子材料以及它們的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08F2/32GK1291200SQ99802632
公開日2001年4月11日 申請日期1999年2月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月5日
發(fā)明者C·梅爾, T·蘇夫科, H－U·派特里持, R·萊克坦沃德, T·鮑勒 申請人:羅姆有限公司