一種兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物，該兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物是重復(fù)結(jié)構(gòu)單元為下式(Ⅰ)所示的銅配位聚合物。所述的銅配位聚合物用N?(3,5?二羧基芐基)?(4?羧基苯)溴化吡啶與銅鹽反應(yīng)合成。本發(fā)明所述的四核銅金屬配位聚合物具有良好的水溶性，可檢測胃癌患者外周血中高表達的五種miRNA，
【專利說明】
一種兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及金屬配位聚合物。
【背景技術(shù)】
[0002] microRNA(miRNA)是一類由18~25個核苷酸組成，并且參與基因調(diào)控的內(nèi)源性RNA 分子。miRNA在諸多生物過程(如細胞分化、增值、凋亡以及疾病過程等）中起重要的角色性 作用。不同發(fā)育階段、不同組織中miRNA的表達水平有著顯著差異。近年來有科學(xué)家研究發(fā) 現(xiàn)，很多疾病的發(fā)生與miRNA的表達水平息息相關(guān)，如2015年Shu&Liu等發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周 血中有5種miRNA(miR-185，miR-20a，miR-210，miR25和miR-92b)表達顯著上調(diào)，并推斷此5 種miRNA很可能作為潛在的胃癌診斷的生物標(biāo)記物。因此，miRNA作為對疾病預(yù)測及診斷的 新型生物標(biāo)記物受到了科研工作者廣泛的關(guān)注，對不同物種中miRNA表達進行識別對預(yù)防 和診斷相關(guān)疾病具有重要意義。
[0003] 識別miRNA最常見的方法有特異性強的northern blot(諾瑟雜交法），高效快速的 microarrays(基因芯片），靈敏度高的qRT_PCR(實時熒光定量PCR)，但這些方法得需經(jīng)過逆 轉(zhuǎn)錄過程來識別，過程復(fù)雜，成本高且耗時。近年來所報道RCA(滾環(huán)擴增法），LAMP(環(huán)介導(dǎo) 等溫擴增法)及LCR(連接酶鏈式反應(yīng))等方法雖一定程度上提高了識別靈敏度，但仍未克服 耗時且尚成本等缺點。
[0004] Cu(II)作為一種高效的熒光淬滅劑，在熒光光譜學(xué)原理作用下，基于Cu(II)構(gòu)筑 的金屬有機骨架常被應(yīng)用于焚光物質(zhì)的淬滅實驗中，但大部分基于Cu( II)的金屬有機骨架 具有水水溶性差等缺點，限制了這類材料在miRNA檢測方面的研究。
[0005] 眾所周知，季銨鹽官能團因其較大的極性，使得此類化合物具有較好的水溶性。將 季銨鹽官能團引入到金屬配位聚合物中能夠顯著的增強此類金屬配位聚合物的水溶性。將 季銨鹽基團和羧酸基團同時引入構(gòu)筑兩性羧酸配體，不僅能發(fā)揮羧酸較強的配位能力和多 樣的配位模式的優(yōu)勢，而且也能有效的克服羧酸金屬配位聚合物溶解性較差的缺陷。目前， 含有羧酸和季銨鹽基團的配體研究較少，而關(guān)于此類金屬配位聚合物作為熒光探針識別 miRNA的研究更是鮮見文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物，該金屬 配位聚合物具有良好的水溶性，可檢測胃癌患者外周血中高表達的miRNA。
[0007] 本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：
[0008] -種兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物，該兩性羧酸銅金屬配位聚合物是重復(fù)結(jié)構(gòu) 單元為下式（I)所示的銅配位聚合物，該銅配位聚合物的紅外光譜數(shù)據(jù)(KBr)為：3429(s)， 1632(s)，1564(s)，1394(s)，1156(m)，847(w)，778(w)，720(w) ,607^)01^,晶胞參數(shù)分別 為：^=16.0688(10) (6)U=17.1508(10)l c=19.5973(13)A，a = 90。，β = 93.155(2)°，γ =90°，
[0009]
[0010] 本本發(fā)明所述的兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物的的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的分子式為 [Cu4(Dcbcbp)4(H20) 12,式中的Dcbcbp為N-(3,5-二羧基芐基)-(4-羧基苯)吡啶，上述四核銅 金屬配位聚合物在常溫下為藍色塊狀晶體，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元中含有四個Cu(II)離子和四個 N-( 3，5-二羧基芐基)-(4-羧基苯)吡啶。四個3，5-二羧基芐形成矩形的四個角，一個銅離子 與兩個配體上3,5_二羧基芐部分的羧基單齒配位構(gòu)成的矩形的短邊，長邊是由一個銅離子 與兩個配體上苯甲酸吡啶部分的羧基單齒配位形成。每個銅（II)原子與三個水分子配位， 與不同羧基上的兩個氧形成四角錐的幾何結(jié)構(gòu)。
[0011] 本發(fā)明所述的兩性羧酸銅金屬配位聚合物采用本領(lǐng)域常用的制備方法，如，將N-(4-羧基芐基)-(3,5_二羧基苯)溴化吡啶與銅鹽反應(yīng)得到。本發(fā)明人推薦的方法，由以下步 驟組成：
[0012] (1)將N-(3，5-二羧基芐基)-(4-羧基苯)溴化吡啶溶解在體積濃度為99 %的甲醇 中，調(diào)整溶液pH為6.0~7.0，得到配體溶液；
[0013] ⑵將與N-(3,5-二羧基芐基)-(4-羧基苯)溴化吡啶等摩爾量的硝酸銅溶解于體 積濃度為99 %的甲醇中，得到銅鹽溶液；
[0014] (3)將步驟(2)得到的銅鹽溶液加入到步驟（1)得到配體溶液中，室溫攪拌反應(yīng)0.5 ~lh，過濾，收集沉淀并用體積濃度為99 %的甲醇溶液洗滌得到藍色沉淀物；
[0015] (4)將步驟(3)得到的藍色沉淀物溶解在蒸餾水中，溶液室溫靜置至有藍色晶體析 出，過濾，收集藍色晶體，乙醚洗凈并真空干燥得到所述的兩性羧酸四核銅金屬配位聚合 物。
[0016] 本發(fā)明的所述的兩性羧酸銅金屬配位聚合物具有檢測胃癌患者外周血中5種高表 達microRNA的性能。檢測原理如下:化合物首先通過靜電、JT-JT堆積和(或)氫鍵作用與P-DNA (帶有熒光標(biāo)記物質(zhì)的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄DNA)結(jié)合形成復(fù)合體系并產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象。在加入 miRNA后，miRNA與P-DNA通過堿基互補配對的作用形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的雜化雙鏈DNA/RNA。由于 雜化雙鏈變大的橫截面和螺旋骨架的保護作用，使得雜化雙鏈與化合物的相互作用減弱， 并與化合物分離開來，體系的熒光也隨著PET機制消失而復(fù)蘇，實現(xiàn)了對miRNA的檢測。
[0017] 本發(fā)明的所述的四核銅金屬配位聚合物可以用于檢測胃癌患者外周血中5種高表 達microRNA，具體檢測方法包括以下步驟：
[0018] (1)化合物結(jié)合P-DNA的熒光淬滅性能
[0019] 用lOOnM Tris-HCl緩沖溶液將100μΜ的P-DNA溶液稀釋成50nM，作為待滴定液；將 化合物溶解在ΙΟΟηΜ Tris-HCl緩沖溶液配成500μΜ(含50nM P-DNA)的溶液為滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于熒光比色皿中，將滴定液按體積梯度加入比色皿中，記錄體系熒光強度 的變化(λΘΧ = 480ηπι)直到熒光淬滅達到飽和。熒光淬滅效率Qe用公式1.1計算。
[0020] Qe=(1-Fm/Fo) X100% (1.1)
[0021] 其中Fo為P-DNA初始熒光強度;Fm是加入化合物1后體系熒光淬滅達到飽和時的熒 光強度。
[0022] 配體和金屬離子結(jié)合P-DNA的熒光淬滅實驗采用此方法完成。
[0023] (2)復(fù)合體系在miRNA存在時的熒光復(fù)蘇能力
[0024] 熒光復(fù)蘇時間的確定:在上述實驗基礎(chǔ)上，將稀釋后的miRNA溶液（ΙΟμΜ)加入到熒 光淬滅達到飽和的復(fù)合體系中，使miRNA在體系中達到最小濃度25ηΜ，監(jiān)測熒光強度隨時間 的變化，確定體系熒光復(fù)檢測miRNA的時間。
[0025] 熒光復(fù)蘇效率的測定：以復(fù)合體系的檢測時間為標(biāo)準，記錄復(fù)合體系熒光強度隨 miRNA濃度增加而復(fù)蘇的程度，直到熒光復(fù)蘇達到飽和。熒光復(fù)蘇效率Re用公式1.2計算。
[0026] Re = Ft/Fm-1 (1.2)
[0027] 其中Ft為加入miRNA后復(fù)蘇達到飽和時的熒光強度。
[0028] 檢測限的計算：用公式1.3計算復(fù)合體系對miRNA的檢測限(Limit of Detection， L0D)〇
[0029] L0D = 3〇/S (2.3)
[0030] 其中σ為未加入miRNA前的熒光強度標(biāo)準偏差，S為校正熒光復(fù)蘇曲線斜率。
[0031 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0032] (1)本發(fā)明產(chǎn)物原料來源廣泛，容易獲得；
[0033] (2)本發(fā)明產(chǎn)物合成方法的反應(yīng)條件溫和，時間短，可在一般溶劑中合成，無需惰 性氣體保護;產(chǎn)率為80%以上，純度達100%;
[0034] (3)本發(fā)明所述的四核銅金屬配位聚合物中季銨鹽的引入顯著增強了金屬配位聚 合物的水溶性，為金屬配位聚合物活性的研究提供了前提條件，結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的孔洞對金屬 配位聚合物具有miRNA識別能力具有較大的影響。實驗結(jié)果證明，本發(fā)明所述的四核銅金屬 配位聚合物對胃癌患者外周血中111丨1?-185、111丨1?-2(^、111丨1?-210、111丨1?25和111丨1?-9213五種高表達 microRNA具有良好的檢測作用。
【附圖說明】
[0035] 圖1是本發(fā)明所述兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的X-射線單晶 衍射表征的分子結(jié)構(gòu)圖。
[0036] 圖2是本發(fā)明所述兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物濃度與熒光標(biāo)記的不同miRNA 的熒光強度變化曲線圖，圖中，（a)為P185-DNA，（b)為P21Q-DNA，（c)為P 25-DNA，（d)為P2Qa-DNA， (e)為P92b-DNA〇
[0037] 圖3是本發(fā)明所述兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物形成的復(fù)合體系與熒光標(biāo)記的 不同miRNA(25nM)在不同時間的熒光強度變化曲線圖，（a)為P 185-DNA，（b)為P21Q-DNA，（c)為 P25-DNA，（ d)為P2Qa-DNA，（ e)為P92b_DNA。
[0038] 圖4是本發(fā)明所述兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物形成的復(fù)合體系與熒光標(biāo)記的 不同miRNA在不同濃度的存在下的熒光強度變化曲線圖，圖中，（a)為P185-DNA，濃度為T185; (b)為P21Q-DNA，濃度為T21Q ; ( C )為P25-DNA，濃度為Τ25 ; (d)為P2Qa-DNA，濃度為T2Qa ; (e)為P92b-DNA，濃度為T92b。
【具體實施方式】
[0039] 實施例1
[0040] 1、兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物的制備
[0041 ] (1)將0 · 2mmol (76 · 2mg)N-(4-羧基芐基)-(3，5-二羧基苯)溴化吡啶加入5mL體積 濃度為99%的甲醇中，用0. lmmol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至7.0，得到配體溶液；
[0042] (2)將0.2mmol(48.2mg)Cu(N03)2 · 3H20溶解于體積濃度為99% 的甲醇溶液（5mL) 中，得到銅鹽溶液；
[0043] (3)將步驟(2)得到的銅鹽溶液逐滴加入到步驟（1)得到的配體溶液中，室溫攪拌 反應(yīng)0.5h，反應(yīng)出現(xiàn)大量藍色沉淀物，過濾，收集沉淀物并用體積濃度為99 %的甲醇溶液洗 滌，得到藍色沉淀物；
[0044] (4)將步驟(3)得到的藍色沉淀物溶解在30mL蒸餾水中，過濾，收集濾液，室溫靜置 一周，有藍色晶體析出，過濾，收集藍色晶體，乙醚洗凈并真空干燥，得到71mg藍色塊狀晶體 (經(jīng)測算產(chǎn)率:86%)。
[0045] 2、兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物的鑒定
[0046] 通過下述元素分析、IR光譜和X-射線單晶衍射分析鑒定，上述步驟1所得到的藍色 塊狀晶體為本發(fā)明所述的兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物，其重復(fù)單元的分子式為[Ciu (Dcbcbp)4(H20)12] · 24H20,式中的Dcbcbp為N-(4-羧基芐基)-(3,5-二羧基苯)吡啶，所述重 復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如（I)所示。鑒定結(jié)果如下：
[0047] (1)元素分析：理論值：C 41·97，Η 5·20，Ν 2.33;實驗值：C 41·52，Η 5·16，Ν 2.72〇
[0048] (2)紅外光譜（KBr disk，cm-l) :3429(s)，1632(s)，1564(s)，1394(s)，1156(m)， 847(w)，778(w)，720(w)，607(w)。
[0049] (3)X-射線單晶衍射:晶體學(xué)參數(shù)和部分鍵長如表1和表2所示。X-射線單晶衍射結(jié)果 表明，上述四核銅金屬配位聚合物在常溫下為藍色塊狀晶體，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元中含有四個Cu (II)離子，四個3，5-二羧基芐形成矩形的四個角，一個銅離子與兩個配體上3，5-二羧基芐部分 的羧基單齒配位構(gòu)成的矩形的短邊，長邊是由一個銅離子與兩個配體上苯甲酸吡啶部分的羧 基單齒配位形成。每個銅(II)原子與三個水分子配位，與不同羧基上的兩個氧形成四角錐的幾 何結(jié)構(gòu)。晶胞參數(shù)分別為：α=丨6.0688( 10) (6) A，/)=丨7·丨508(丨0) A，丨9.5973( 13) .Α，α = 90°，β = 93· 155(2)。，γ =90° 射線單晶衍射表征結(jié)果如圖1所示。
[0050] 表1 · [Cu4(Dcbcbp)4(H20)12] · 24Η20的晶體學(xué)參數(shù)
[0051]
[0052] a R= I |F〇|-|Fc|/|F〇| ,b wR={w(F〇2-Fc2)2/w(F〇2) 2}1/2.c G0F= {w( (F〇2-Fc2)2)/ (n-p)} 1/2,
[0053] 表2.[&14(0(^(^)4(1120)12].2紐2〇的部分鍵長(為
[0054]
[0055]
[0056] 利用對稱變換生成的原子:#l-x，_y+2，-z+1.
[0057] 實施例2
[0058] 本實施例采用實施例1中得到的兩性羧酸四核銅金屬配位聚合物對五種miRNA識 別作用進行研究。
[0059] 本發(fā)明所述的金屬配位聚合物溶解性:在25°C條件下，金屬配位聚合物在16mL水 中的達到飽和狀態(tài)時溶解了 2.4mg。
[0060] (1)通過miRBase數(shù)據(jù)庫確認與胃癌外周血中表達異常的5種miRNA的成熟序列，人 工合成作為待檢序列，即target RNAs?？紤]到RNA相對的不穩(wěn)定性，我們將target RNAs各 自對應(yīng)的互補鏈置換成其互補DNA(complementary DNA，cDNA)，并對cDNAs序列進行焚光標(biāo) 記，即probe DNAs。5種miRNA相互作為干擾序列?？疾旖饘倥湮痪酆衔锬芊襁x擇性識別5種 miRNA〇
[0061] (DmiR-185:
[0062] Target RNA序列（Ti85):5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUG A-3'
[0063] Probe DNA序列互補鏈（Pi85-DNA):5'-TCA GGA ACT GCC TTT CTC TCC A-FAM-3'
[0064] ② hsa_miR-20a
[0065] Target RNA序列（T2〇a) :5，-UAA AGU GCU UAU AGU GCA GGU AG-3'
[0066] Probe DNA序列互補鏈（P2〇a-DNA):5，-CTA CCT GCA CTA TAA GCA CTT TA-FAM-3'
[0067] ③hsa_miR-92b
[0068] Target RNA序列（T92b) :5，-UAU UGC ACU CGU CCC GGC CUC C-3'
[0069] Probe DNA序列互補鏈（P92b-DNA):5，-GGA GGC CGG GAC GAG TGC AAT A -FAM-3'
[0070] ④ hsa-miR-25
[0071] Target RNA序列（T25) :5，-CAU UGC ACU UGU CUC GGU CUG A-3'
[0072] Probe DNA序列互補鏈(P25-DNA):5'-TCA GAC CGA GAC AAG TGC AAT G-FAM-3'
[0073] ⑤ hsa-miR-210
[0074] Target RNA序列（T21。）：5，-CUG UGC GUG UGA CAG CGG CUG A-3'
[0075] Probe DNA序列互補鏈（P2iq-DNA):5'-TCA GCC GCT GTC ACA CGC ACA G-FAM-3'
[0076] (2)本發(fā)明所述金屬配位聚合物檢測砧1?-185，1^1?-2(^，1^1?-210，1^1?25和1^1?-92匕
[0077] (a)配制金屬配位聚合物水溶液
[0078]將金屬配位聚合物溶于蒸餾水中配制成濃度為62.5μΜ的溶液并用無菌過濾器對 溶液進行除菌，密封保存待用。
[0079] (b)檢測的步驟
[0080] (I)化合物結(jié)合P-DNA的熒光淬滅性能
[0081 ] 用100nM Tris-HCl緩沖溶液將100μΜ的P-DNA溶液稀釋成50nM，作為待滴定液;將 化合物溶解在l〇〇nM Tris-HCl緩沖溶液配成500μΜ(含50nM P-DNA)的溶液為滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于熒光比色皿中，將滴定液按體積梯度加入比色皿中，記錄體系熒光強度 的變化(激發(fā)波長= 480nm，發(fā)射波長= 518nm))直到熒光淬滅達到飽和。熒光淬滅效率Qe用 公式1.1計算。
[0082] Qe=(1-Fm/Fo) X100% (1.1)
[0083] 其中Fo為P-DNA初始熒光強度;Fm是加入化合物1后體系熒光淬滅達到飽和時的熒 光強度。
[0084] 配體和金屬離子結(jié)合P-DNA的熒光淬滅實驗采用此方法完成。
[0085] (II)復(fù)合體系在miRNA存在時的熒光復(fù)蘇能力
[0086] 熒光復(fù)蘇時間的確定:在上述實驗基礎(chǔ)上，將稀釋后的miRNA溶液（ΙΟμΜ)加入到熒 光淬滅達到飽和的復(fù)合體系中，使miRNA在體系中達到最小濃度25ηΜ，監(jiān)測熒光強度隨時間 的變化，確定體系熒光復(fù)檢測miRNA的時間。
[0087] 熒光復(fù)蘇效率的測定：以復(fù)合體系的檢測時間為標(biāo)準，記錄復(fù)合體系熒光強度隨 miRNA濃度增加而復(fù)蘇的程度，直到熒光復(fù)蘇達到飽和。熒光復(fù)蘇效率Re用公式1.2計算。
[0088] Re = Ft/Fm-1 (1.2)
[0089] 其中Ft為加入miRNA后復(fù)蘇達到飽和時的熒光強度。
[0090] 檢測限的計算：用公式1.3計算復(fù)合體系對miRNA的檢測限(Limit of Detection， L0D)〇
[0091] L0D = 3〇/S (2.3)
[0092] 其中σ為未加入miRNA前的熒光強度標(biāo)準偏差，S為校正熒光復(fù)蘇曲線斜率。
[0093] (5)實驗結(jié)果
[0094] 如下表3所示，金屬配位聚合物對目標(biāo)miRNA逆轉(zhuǎn)錄的熒光標(biāo)記DNA P185-DNA，P210- DNA，P25-DNA，P2Qa-DNA和P92b-DNA的熒光淬滅能力（圖2)，形成的復(fù)合體系對11^-185，11^-210，111丨1?-25，111丨1?-2(^和111丨1?-9213的檢測時間分別為5.3,8.3,9.0,8.7,8.0111丨11(見圖3) ;熒光 復(fù)蘇率(Re)分別為 1.72，1.93,2.91，1.82，1.04;檢測限為0.71，0.32,0.61，0.63,0.9211]\1 (見圖4)。該結(jié)果表明本發(fā)明所述的四核銅金屬配位聚合物對五種胃癌病人外周血中過表 達的miRNA具有較好的檢測作用。
[0095] 表3.四核銅金屬配位聚合物對五種胃癌患者外周血中高表達的五種miRNA檢測效 果
[0096]
【主權(quán)項】
1. 一種兩性簇酸四核銅金屬配位聚合物，該兩性簇酸銅金屬配位聚合物是重復(fù)結(jié)構(gòu)單 元為下式（I)所示的的銅配位聚合物，該銅配位聚合物的紅外光譜數(shù)據(jù)化化)為：3429(S)， 1632(s)，1564(s)，1394(s)，1156(m)，847(w)，778(w)，720(w)，607(w)cm-i，晶胞參數(shù)分別 為：0=16.0688(10) (6) Λ,/尸 17.1508(10)A，￡,= 19.5973(!3)Α，α = 90%β=93.155 (2)。，丫 =90。，2. 權(quán)利要求1所述的兩性簇酸四核銅金屬配位聚合物的制備方法，該方法由W下步驟 組成： (1) 將N-(3,5-二簇基芐基)-(4-簇基苯)漠化化晚溶解在體積濃度為99%的甲醇中，調(diào) 整溶液pH為6.0~7.0，得到配體溶液； (2) 將與N-(3,5-二簇基芐基)-(4-簇基苯)漠化化晚等摩爾量的硝酸銅溶解于體積濃 度為99 %的甲醇中，得到銅鹽溶液； (3) 將步驟（2)得到的銅鹽溶液加入到步驟（1)得到配體溶液中，室溫攬拌反應(yīng)0.5~ 化，過濾，收集沉淀并用體積濃度為99 %的甲醇溶液洗涂得到藍色沉淀物； (4) 將步驟(3)得到的藍色沉淀物溶解在蒸饋水中，溶液室溫靜置至有藍色晶體析出， 過濾，收集藍色晶體，乙酸洗凈并真空干燥得到所述的兩性簇酸四核銅金屬配位聚合物。
【文檔編號】C08G83/00GK106084245SQ201610403491
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】陳金香, 覃亮, 陳文華, 劉叔文, 謝寶平, 孫斌
【申請人】南方醫(yī)科大學(xué)