[0213] 使用BIAcoreX100儀器通過表面等離子共振測定本發(fā)明的mAb和-突觸核蛋 白原纖維之間相互作用的動力學常數(shù)。通過在IOmMpH4. 5的醋酸鈉緩沖液中注入35y1 120yg/ml的-突觸核蛋白原纖維，將a-突觸核蛋白原纖維固定至用N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)和N乙基-N(二甲基氨丙基）碳化二亞胺（EDC)活化的CM5傳感芯片。通過將范圍 在 0? 01 至IOnM的 8 個不同濃度的mAb(Syn_Fl、Syn_F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03、Syn-04 和mAb211(SantaCruzBiotechnolgy))以 10yI/分鐘的流速注入HBS電泳緩沖液（IOmM hepes、0. 15mNaCl、3.4mMEDTA和0.005%表面活性劑P20 ;pH7.4)，來獲得結(jié)合速率常數(shù)。 以40y1/分鐘的流速測定解離速率。使用IOOmMpH9. 6的NaHCO3再生傳感芯片。用BOA 評價軟件分析傳感圖。
[0214] 示出由Biacore進行的mAb的對比的結(jié)果可見于圖7和表4。發(fā)現(xiàn)單克隆抗體的 Kd小于10 8。發(fā)現(xiàn)mAbSyn-Ol具有KD15. 9pM的最高的親和力。發(fā)現(xiàn)6個單克隆抗體（mAb) 之中最低親和力是具有2. 6nM的Syn-F2。
[0215]表4
[0216]
[0217] 實施例7
[0218] 對mAb的表位作圖
[0219] 為了揭露本發(fā)明的mAb是否檢測線型表位或構(gòu)象表位，針對覆蓋a_突觸核蛋白 序列的肽文庫測試抗體的親和性。合成了覆蓋人類a-突觸核蛋白序列（參見表5)的 14個氨基酸長、具有7個氨基酸重疊的肽（上海瀚鴻化工有限公司（ShanghaiHanhong ChemicalCo.)，中國）。將肽溶解于高壓滅菌的水或DMSO中，給到lmg/ml的最終濃度。
[0220] 表 5
[0221]

[0222] 通過斑點雜交進行的肽掃描
[0223] 在室溫下用0? 1 %EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽）的 PBS預(yù)處理硝酸纖維素膜10分鐘，并空氣干燥。將200ng(在5yIpH7. 4的PBS中）的肽 1-19(a-突觸核蛋白肽文庫，表5)和50ng的a-突觸核蛋白原纖維（點20)點樣在膜 上。在空氣干燥后，用含5%脫脂奶的PBST封閉膜，并在室溫下孵育1小時。用PBST洗滌 膜三次，之后用Syn-Fl、Syn-F2、Syn-Ol、Syn-02、Syn-03、Syn-04 或Syn-I單克隆抗體孵育 (50ng/ml，在PBST中），并在室溫下孵育2小時。用PBST洗滌膜，并用以1:20000稀釋（在 PBST中）的山羊抗小鼠IgG-HRP(杰克遜免疫研究（JacksonImmunoresearch))孵育。使 用SupersignalWestPico化學發(fā)光底物（賽默飛科技（ThermoScientific))使斑點顯 色。肽掃描的結(jié)果示于圖8中。
[0224] 使用斑點雜交進行的肽掃描的結(jié)果表明mAb、Syn-01、Syn-02、Syn-03、Syn-04、 Syn-Fl或Syn-F2不識別線型表位。
[0225] 通過ELISA進行的肽掃描
[0226] 為確認使用斑點雜交的肽掃描結(jié)果，也通過使用ELISA的肽掃描測試mAb。用 在0? 2MpH9. 6的NaHCO3中的50yI(500ng/孔）肽（表5中具體描述的a-突觸核蛋 白肽1-19)和在pH7. 4的PBS中的50yI(IOOng/孔）a-突觸核蛋白原纖維通過在37°C 下孵育過夜以允許完全干燥，來涂布384孔黑色maxisorp酶標板（能肯（NUNC))。用 PBST洗滌板三次，并用100y1封閉緩沖液（含2. 25%明膠的PBST)在室溫下封閉1小 時。在用PBST洗滌板三次后，加入 50yl(100ng/ml)的mAb(Syn-Fl、Syn-F2、Syn-OU Syn-02、Syn-03 和Syn-04)，以及對照抗體（50yI(100ng/ml)的Syn-I(小鼠抗a-突觸 核蛋白；BD生物科學（BDBiosciences))、50yl(100ng/ml)的N-19(山羊抗a-突觸核 蛋白；圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（SantaCruzBiotechnology))、50iil(100ng/ml)的 211(小鼠抗a-突觸核蛋白；圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（SantaCruzBiotechnology))、 50yl(200ng/ml)的FL-140(兔抗a-突觸核蛋白；圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（Santa CruzBiotechnology))、50liI(Ilig/ml)的5C2 (小鼠抗a-突觸核蛋白；圣克魯斯生 物技術(shù)有限公司（SantaCruzBiotechnology))和 50lil(llig/ml)的3B6(小鼠抗a/ 0-突觸核蛋白；圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（SantaCruzBiotechnology))，并在室溫下 孵育1小時。用PBST洗滌板，加入山羊抗小鼠IgG-HRP綴合物（1/20000 ;杰克遜免疫研 究（JacksonImmunoresearch))或山羊抗兔IgG_HRP(l/5000;杰克遜免疫研究（Jackson Immunoresearch))綴合物或稀釋的雞抗山羊IgG-HRP綴合物（1/20000)，并在室溫下孵育 板1小時。用PBST洗滌板，加入50y1的底物（超級信號SuperSignalELISAFemto最高 敏感性底物，賽默飛科技（ThermoScientific))，并立即使用VictorX3微量滴定板讀數(shù)器 讀取板。在測定ELISA信號后，也將板暴露在X射線膠片上，以使點顯色。
[0227] 通過ELISA進行的肽掃描的結(jié)果可見于圖9和圖10(對照抗體：A，本發(fā)明的抗體： B)。通過ELISA進行的肽掃描方法還顯示抗體不與任何肽反應(yīng)，但是與C末端肽（127-140) 略微反應(yīng)，這表明C末端區(qū)參與形成構(gòu)象表位。
[0228] 實施例8
[0229] 檢測a-突觸核蛋白聚合體的夾心ELISA
[0230] 用在200mMpH9. 6的NaHCO3中的0.Iyg/ml本發(fā)明的構(gòu)象單克隆抗體（Syn-Fl、 Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 或Syn-04)中的一種（50y1/ 孔）通過在 4°C下過夜孵育 來涂布 384 孔ELISA黑色微孔板（NuncMaxisorb,能肯（NUNC),丹麥（Denmark))。
[0231] 用含0. 05%吐溫-20 (PBST)的PBS洗滌板四次，并用100y1/孔的封閉緩沖液（含 2. 5%明膠和1%BSA的PBST)在37°C下孵育2小時。
[0232] 用PBST洗滌板4次，并加入50yl的各濃度（10、5、1、0.5、0. 1和0.05nM，于PBS 中）的單體的、低聚的或聚合的a-突觸核蛋白。然后將板在37°C下孵育2. 5小時。
[0233] 在用PBST洗滌四次后，加入以1:1000稀釋于封閉緩沖液的50yIFL_140(兔多 克隆抗體，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（SantaCruzBiotechnology))，并在37°C下孵育2 小時。
[0234] 在用PBST洗滌孔4次后，加入以1:10000稀釋于封閉緩沖液的50y1/孔的山羊 抗兔IgGHRP(杰克遜免疫研究（JacksonImmunoresearch))，并在37°C下孵育1. 5小時。
[0235] 用PBST洗滌板4次，使用增強化學發(fā)光底物（SuperSignalELISAFemto,皮爾斯 生物技術(shù)（PierceBiotechnology))通過化學發(fā)光反應(yīng)分析結(jié)合的HRP的活性，之后，立即 用泊金埃爾默酶標儀（PerkinElmermicroplatereader)測定化學發(fā)光，以相對光單位為 單位。
[0236] 為了確認構(gòu)象mAb僅檢出聚合形式的a-突觸核蛋白，而未檢出單體形式的 a_突觸核蛋白，使用對照Syn-I作為捕獲抗體進行上述的進一步的ELISA分析。
[0237] 結(jié)果如圖 11 所示。結(jié)果顯示，構(gòu)象mAbSyn-Fl、Syn_F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04同時與低聚形式和聚合形式的a-突觸核蛋白反應(yīng)。Syn-I同時與單體形式和聚 合形式的a-突觸核蛋白反應(yīng)。
[0238] 然而，ELISA顯示，對于所有mAb，單體形式的a-突觸核蛋白未檢出，低聚形式和 原纖維形式的a-突觸核蛋白被檢出，ELISA的結(jié)果顯示，對于Syn-Fl和Syn_F2,a-突觸 核蛋白原纖維的特異性比低聚形式的a-突觸核蛋白的特異性高一些。
[0239] 實施例9
[0240] 用于檢測聚合的磷酸化Serl29-a-突觸核蛋白（D-S129_a-svn)的夾心ELISA
[0241] 用在200mMpH9. 6的NaHCO3中的0?Iyg/ml本發(fā)明的構(gòu)象單克隆抗體（Syn-F2、 Syn-02)中的一種（50yl/孔）通過在4°C下過夜孵育來涂布384孔ELISA黑色微孔板 (NuncMaxisorb,能肯（NUNC),丹麥（Denmark))。
[0242] 用含0. 05%吐溫-20 (PBST)的PBS洗滌板四次，并用100y1/孔的封閉緩沖液（含 2. 5%明膠和1%BSA的PBST)在37°C下孵育2小時。
[0243] 用PBST洗滌板 4 次，并加入 50yl的各濃度（1、0.5、0.l、0.05、0.0UP0.005nM， 于PBS中）的單體的p-S129-a-syn或聚合的p-S129-a-syn。然后將板在37°C下孵育 2. 5小時。
[0244] 在用PBST洗滌四次后，加入以1:1000稀釋于封閉緩沖液的50y1兔抗 P-S129-a-突觸核蛋白（宜佰康（Epitomics))，并在37°C下孵育2小時。
[0245] 在用PBST洗滌孔4次后，加入以1:10000稀釋于封閉緩沖液的50y1/孔的山羊 抗兔IgGHRP(杰克遜免疫研究（JacksonImmunoresearch))，并在37°C下孵育1. 5小時。
[0246] 用PBST洗滌板4次，使用增強化學發(fā)光底物（SuperSignalELISAFemto,Pierce Biotechnology)通過化學發(fā)光反應(yīng)分析結(jié)合的HRP的活性，之后，立即用泊金埃爾默酶標 儀（PerkinElmermicroplatereader)測定化學發(fā)光，以相對光單位為單位。
[0247] 為了確認構(gòu)象mAb僅檢出聚合形式的a-突觸核蛋白，而未檢出單體形式的 a_突觸核蛋白，使用對照Syn-I作為捕獲抗體進行上述的進一步的ELISA分析。
[0248] 結(jié)果可見于圖12中。結(jié)果顯不構(gòu)象（confirmation)mAbSyn_F2和Syn-02與聚 合形式的磷酸化a-突觸核蛋白反應(yīng)。Syn-I顯示相似的情況，但在兩種情況中，與單體形 式和聚合形式的磷酸化S129a-突觸核蛋白均顯示低反應(yīng)。
[0249] 突觸核蛋白的聚合和磷酸化被認為在ro發(fā)病機理中起到?jīng)Q定性作用。因此，在生 物體液中檢測磷酸化或未磷酸化形式的a-突觸核蛋白可被用作潛在的用于ro的生物學 標記（potentialbiologicalmarked) 〇
[0250] 已經(jīng)開發(fā)出可以特異性地檢測聚合形式的a-突觸核蛋白但不檢測單體形式 的a-突觸核蛋白的ELISA分析。該分析使用抗體Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、 Syn-03或Syn-04作為捕獲抗體，隨后對于聚合的a-突觸核蛋白用抗體如FL-140 (針 對全長a-突觸核蛋白產(chǎn)生的兔多克隆抗體，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（SantaCruz Biotechnology))、對于P-S129-a-突觸核蛋白的聚合體用兔抗P-S129-a-突觸核蛋白 (宜佰康（Epitomics))進行檢測。
[0251] 實施例10
[0252] 免疫組織化學
[0253] 在來自帕金森氏病病例的腦切片中使用過氧化物酶免疫組織化學法測試mAb。 Syn-Fl和Syn-02 以 1 比 10000(0.Iyg/ml)稀釋液使用，而Syn-F2、Syn-01、Syn-03 和 Syn-04以1比5000(0. 2yg/ml)稀釋液使用。也同時對小鼠陰性對照載片進行處理，其中 包括所有免疫組織化學步驟，但將一級抗體刪除。
[0254] 結(jié)果
[0255] 通過在帕金森氏病（PD)和多系統(tǒng)萎縮（MSA)病例中使用過氧化物免疫組織化學 法使mAb已得到逐步發(fā)展。所有抗體在ro腦中（圖14)產(chǎn)生路易氏體和路易氏神經(jīng)突的強 免疫染色，在多系統(tǒng)萎縮的腦（圖15)的白質(zhì)少突細胞中產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細胞質(zhì)內(nèi)含物。也 對小鼠陰性對照載片進行處理，并且在切片（圖13)中未產(chǎn)生任何免疫反應(yīng)性。
[0256] 在對照病例（圖13)中，圖像示出了在來自對照病例的前扣帶皮層中的對本發(fā)明 的mAb免疫染色的切片和市售的小鼠單克隆抗a-突觸核蛋白抗體（Syn-I)或小鼠單克隆 抗磷酸化Serl29a-突觸核蛋白（phospho-syn)。同時也處理小鼠和兔的陰性對照載片。 所有切片用甲酚紫（藍色）復(fù)染色，以使細胞核和細胞膜可視化。將相同的亮度調(diào)節(jié)應(yīng)用 于所有圖像。比例尺代表20ym(應(yīng)用于所有圖（panel))。
[0257] 在帕金森氏病病例（圖14)中，圖像示出了在來自帕金森氏病病例的前扣帶皮層 中的對本發(fā)明的mAb有免疫反應(yīng)的路易氏體和市售的小鼠單克隆抗a-突觸核蛋白抗體 (Syn-I)或小鼠單克隆抗磷酸化Serl29a-突觸核蛋白抗體（phospho-syn)。所有切片用 甲酚紫（藍色）復(fù)染色，以使細胞核和細胞膜可視化。將相同的亮度調(diào)節(jié)應(yīng)用與所有圖像。 比例尺代表20ym(應(yīng)用于所有圖）。
[0258] 在多系統(tǒng)萎縮病例（圖15)中，圖像示出了在來自MSA病例的硬膜（putamen)中 的對本發(fā)明的