用于增加蛋白質(zhì)的焦谷氨酸形成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于在純化過(guò)程內(nèi)將蛋白質(zhì)的N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化成 焦谷氨酸的方法。此外，本發(fā)明還涉及用于純化含有N-端焦谷氨酸的蛋白質(zhì)的方法。本發(fā) 明的方法可以包括在用于制備具有N-端焦谷氨酸的蛋白質(zhì)，具體來(lái)說(shuō)用于制備用于藥學(xué) 產(chǎn)物的活性藥學(xué)成分（API)的制造過(guò)程中。
【背景技術(shù)】
[0002] 大部分重組型治療蛋白質(zhì)顯示一種或多種轉(zhuǎn)譯后修飾。這些修飾可在其核糖體合 成期間或（更通常）在合成完成之后出現(xiàn)。迄今已表征許多轉(zhuǎn)譯后修飾，并且這些修飾可 賦予所影響的蛋白質(zhì)一些結(jié)構(gòu)方面或功能性作用。與治療蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的常見(jiàn)轉(zhuǎn)譯后修飾 包括羧基化和羥基化、酰胺化和硫酸化、雙硫鍵形成和蛋白水解處理，以及糖基化、異構(gòu)化、 氧化、環(huán)化（N-端谷酰胺或谷氨酸轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸）、片段化和聚集作用。因此，轉(zhuǎn)譯后修飾 可由蛋白質(zhì)的酶促修飾或由非酶促轉(zhuǎn)化引起，并且轉(zhuǎn)譯后修飾可在細(xì)胞培養(yǎng)期間或在蛋白 質(zhì)的純化或儲(chǔ)存期間在表達(dá)宿主內(nèi)部出現(xiàn)。
[0003] 重組型單克隆抗體對(duì)生物技術(shù)行業(yè)具有巨大價(jià)值并且許多抗體已批準(zhǔn)用于治療 多種疾病。由于抗體通常在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）中產(chǎn)生，其可具有許多不同的轉(zhuǎn) 譯后修飾，從而引起產(chǎn)物的不均勻性。不均勻性可由抗體的表面電荷的變化引起，由帶電殘 基的數(shù)目的變化直接引起，或由改變表面電荷分布的化學(xué)或生理變化（如糖基化、重鏈的 C-端賴(lài)氨酸的羧基肽酶截割和N-端谷酰胺或谷氨酸殘基環(huán)化成焦谷氨酸）間接引起。
[0004] 抗體典型地由基本結(jié)構(gòu)單元組成，每個(gè)基本結(jié)構(gòu)單元具有通過(guò)二硫橋鍵和非共價(jià) 相互作用接合的兩個(gè)大型重鏈和兩個(gè)小型輕鏈。存在若干不同類(lèi)型的抗體重鏈和若干不同 類(lèi)型的抗體，該等抗體基于其所具有之重鏈而分組成不同的同型。舉例來(lái)說(shuō)，視重鏈恒定區(qū) 的基因而定，存在四種人類(lèi)IgG的同型（1到4)。輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域由兩種基因（K或A)編 碼。因此，每個(gè)IgG同型可以是K或A，例如IgGlK。盡管不同類(lèi)型的細(xì)胞系中產(chǎn)生若干 類(lèi)型的抗體，但最有臨床價(jià)值的抗體是IgGl或IgG2型全長(zhǎng)抗體。
[0005] 許多人類(lèi)IgGl或IgG2型抗體在輕鏈或重鏈或其兩者的N-端含有谷氨酸（Glu) 和/或谷酰胺（Gln)殘基。大部分輕鏈基因編碼谷氨酸或谷酰胺。這類(lèi)N-端谷氨酸和/ 或谷酰胺殘基可經(jīng)歷環(huán)化以形成焦谷氨酸（pGlu)，如圖1所示。因此，焦谷氨酸形成在幾乎 所有的有臨床價(jià)值的抗體中發(fā)生并且過(guò)程的不同完整性程度成為不均勻性的常見(jiàn)原因。這 種不均勻性在治療抗體中不符合需要，因?yàn)檫@些變化可通過(guò)改變帶電基團(tuán)的數(shù)目直接地或 通過(guò)引入結(jié)構(gòu)變化間接地改變抗體的表面電荷特性。這類(lèi)修飾具有降低生物活性以及改變 藥物動(dòng)力學(xué)和抗原性的潛力。
[0006] 在谷酰胺的環(huán)化期間，N-端伯胺（在中性pH值下帶正電）轉(zhuǎn)化成中性酰胺，弓丨 起抗體的凈電荷變化。所述反應(yīng)伴隨有氨損失（17Da)。因此，環(huán)化不足可由陽(yáng)離子交換色 譜檢測(cè)為堿性變異體，因?yàn)橹鞣逋ǔＪ峭耆h(huán)化的物質(zhì)，或由反相HPLC檢測(cè)為較晚洗脫的 峰，因?yàn)樵贜-端胺損失之后疏水性增加。
[0007] 谷氨酸的環(huán)化通過(guò)側(cè)鏈的羧基和N-端胺發(fā)生，因此形成中性酰胺并且釋放水 (ISDa)。凈電荷保持相同，因?yàn)橐粋€(gè)酸性基團(tuán)和一個(gè)堿性基團(tuán)在反應(yīng)中縮合，然而，損失兩 個(gè)帶電殘基可增加分子的疏水性，使得可通過(guò)反相HPLC檢測(cè)。
[0008] 尚未完全理解抗體中的焦谷氨酸形成機(jī)制。環(huán)化可自發(fā)地發(fā)生或其可由酶谷酰胺 酰基環(huán)化酶輔助。仍然不清楚谷酰胺?；h(huán)化酶在最通常用于抗體制備的CHO細(xì)胞系中是 否是活性；然而，自發(fā)環(huán)化的比率表明反應(yīng)可能是非酶促型的。
[0009] 舉例來(lái)說(shuō)，Yu等人（藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)分析雜志（JournalofPharmaceuticaland BiomedicalAnalysis) 2006 ;42:455-463)歷時(shí)3個(gè)月的時(shí)間段研究單克隆抗體的輕鏈和 重鏈的N-端處由谷氨酸（Glu或E)進(jìn)行的非酶促焦谷氨酸形成。Yu等人陳述，視過(guò)程發(fā)展 期間的pH值和溫度條件而定，mAb的Glu到pGlu的這一非酶促環(huán)化可能是mAb制備和儲(chǔ) 存中發(fā)生的主要分解途徑中的一種。其得出尚不清楚這類(lèi)焦谷氨酸是否可引起其它修飾和 改變mAb生物活性或治療效能的結(jié)論，并且其提出密切監(jiān)測(cè)N-端pGlu形成，因?yàn)槠鋵?duì)于確 保具有N-端Glu的mAb療法的品質(zhì)來(lái)說(shuō)是重要的。
[0010]Chelius等人（分析化學(xué)（Anal.Chem.) 2006, 78, 2370-2376)還研究若干單克隆抗 體的輕鏈和重鏈的N-端處由谷氨酸進(jìn)行的非酶促焦谷氨酸形成，并且發(fā)現(xiàn)這一非酶促反 應(yīng)確實(shí)極頻繁發(fā)生且可在37°C和45°C下溫育數(shù)周之后檢測(cè)到。在若干具有不同pH值的水 性緩沖液中測(cè)量這一反應(yīng)的比率，在PH6. 2下顯示最低程度的焦谷氨酸形成并且在pH4 和pH8下顯示增加的焦谷氨酸形成。
[0011] 考慮到谷酰胺（Gln或Q)轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸，Dick等人（生物技術(shù)和生物工程(BiotechnologyandBioengineering)，第 97 卷，第 3 號(hào)，2007 年 6 月 15 日）證實(shí)，重組 型單克隆抗體的N-端谷酰胺的這類(lèi)環(huán)化自發(fā)地發(fā)生并且得出以下結(jié)論：許多最終容器單 克隆抗體中所觀(guān)測(cè)到的幾乎完全轉(zhuǎn)化最可能由生物反應(yīng)器溫育和純化條件與生物反應(yīng)器 中發(fā)生的大部分修飾的組合引起。這一研究證明，許多重組型抗體中通常觀(guān)測(cè)到的焦谷酰 胺變異體是在生物反應(yīng)器內(nèi)部產(chǎn)生，其中純化過(guò)程僅具有小貢獻(xiàn)，并且由高溫和溶劑組合 物促進(jìn)。具體來(lái)說(shuō)，在37°C下并且在具有75mMNaCl的35mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 2)中發(fā) 現(xiàn)較高轉(zhuǎn)化率。
[0012] 因此，如N-端谷酰胺或谷氨酸殘基環(huán)化成焦谷氨酸的轉(zhuǎn)譯后修飾引起所表達(dá)的 蛋白質(zhì)的不均勻性，所述不均勻性可由于制備和純化條件的微小差異而在各批次之間不 同。因此，制備生物類(lèi)似蛋白質(zhì)的更困難挑戰(zhàn)中的一項(xiàng)是匹配創(chuàng)新產(chǎn)物的不均勻性。因此， 需要具有分析支持的更穩(wěn)定并且可重復(fù)的工業(yè)大規(guī)模純化工藝以滿(mǎn)足藥學(xué)蛋白質(zhì)（如抗 體）的嚴(yán)格的純度要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的第一方面涉及用于在純化過(guò)程內(nèi)將蛋白質(zhì)的N-端谷酰胺和/或谷氨酸 殘基轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸的方法，其包含在促進(jìn)N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基環(huán)化的條件下溫 育蛋白質(zhì)的步驟。
[0014] 本發(fā)明的第二方面涉及用于純化含有N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基的蛋白質(zhì)的 方法，所述方法包含將所述蛋白質(zhì)的N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化成N-端焦谷氨酸 的步驟。這類(lèi)轉(zhuǎn)化是在促進(jìn)N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基環(huán)化的條件下進(jìn)行。
[0015] 本發(fā)明的第三方面涉及制備作為藥學(xué)產(chǎn)物的API具有N-端焦谷氨酸的蛋白質(zhì)的 方法，所述方法包含如第一或第二方面以及其實(shí)施方式中的任一個(gè)的純化方法。
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供制備具有提高或受控制的N-端焦谷氨酸含量的蛋白質(zhì) 以便降低或獲得所需產(chǎn)物不均勻性的替代性方法。
[0017] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)在具有N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基的蛋白質(zhì)（具體來(lái)說(shuō)，單 克隆抗體）的純化過(guò)程期間引入將N-端谷酰胺和/或谷氨酸殘基溫育/轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸 的步驟，可控制不均勻性程度達(dá)到所需程度。
[0018] 在閱讀本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)、附圖和權(quán)利要求后，本發(fā)明的其它目標(biāo)將變得顯而易見(jiàn)。
[0019]定義：
[0020] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)識(shí)"是指兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間 的相關(guān)性并且由參數(shù)"序列同一性"描述。出于本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間的序 列同一 ,性的程度使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼和翁施，1970，分 子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol. )48:443-453)測(cè)定，如在EMBOSS包的尼德?tīng)枺∟eedle)程序 (EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件包（TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftware Suite),萊斯（Rice)等人，2000，《遺傳學(xué)趨勢(shì)》（TrendsGenet. ) 16:276-277)，優(yōu)選地 3. 0. 0版或更高版本中所實(shí)施。所使用的任選參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10、空位延伸罰分0. 5 以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。使用尼德?tīng)枠?biāo)記的"最長(zhǎng)標(biāo)識(shí)"的 輸出（使用非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）作為同一性百分比并且計(jì)算如下：（相同殘基X100)八對(duì)準(zhǔn) 長(zhǎng)度-對(duì)準(zhǔn)中的間隙總數(shù)）。
[0021] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"N-端"、"N-末端"或"氨基端"是指蛋白質(zhì)或多肽的末端部 分中的自由氨基（-NH2)。書(shū)寫(xiě)蛋白質(zhì)或多肽序列的常見(jiàn)方式是將N-端放在左側(cè)并且從N 端到C-端書(shū)寫(xiě)序列。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或多肽由信使RNA轉(zhuǎn)譯時(shí)，其以從N端到C-端的順序產(chǎn)生。
[0022] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"谷酰胺"、"2-氨基-4-氨基甲酰基丁酸"、"Gin"或"Q"是 由標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼編碼的20種氨基酸中的一種。其側(cè)鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)用酰胺官能團(tuán)置換谷氨酸的 側(cè)鏈羧基而形成的酰胺。因此，其可視為谷氨酸的酰胺。
[0023] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"谷氨酸"、"2-氨基戊二酸"、"Glu"或"E"是由標(biāo)準(zhǔn)遺傳密 碼編碼的20種氨基酸中的一種。在生理pH值下，側(cè)鏈羧酸官能團(tuán)以其帶負(fù)電去質(zhì)子化羧 酸鹽形式存在。
[0024] 如本文所使用術(shù)語(yǔ)"多肽"是指通過(guò)肽鍵連接的氨基酸單體的線(xiàn)性單鏈。已并入 多肽中的氨基酸稱(chēng)為"殘基";每個(gè)多肽在多肽的各別末端具有一個(gè)N-端殘基和一個(gè)C-端 殘基。如本文所使用的多肽是更長(zhǎng)的肽，其包含超過(guò)約20個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0025] 如本文所使用術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"是指由一個(gè)或多個(gè)典型地折疊成球形或纖維形形式 (促進(jìn)生物功能）的多肽組成的生物化學(xué)化合物。蛋白質(zhì)可由除肽鍵以外的鍵連接，例如這 類(lèi)組成蛋白質(zhì)的多肽可由二硫鍵連接。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"意圖涵蓋抗體、蛋白 質(zhì)和抗體的片段、蛋白質(zhì)和抗體的裂解形式等，其大于約20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。此外，如本 文所使用的蛋白質(zhì)意圖涵蓋天然存在的多肽和以重組方式產(chǎn)生的多肽。
[0026] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"焦谷氨酸"、"5-側(cè)氧基脯氨酸"、"氧脯氨酸"或"焦谷氨 酸"大體上是指不常見(jiàn)的氨基酸衍生物，其中谷氨酸或谷酰胺的自由氨基環(huán)化以形成內(nèi) 酰胺。其可見(jiàn)于許多蛋白質(zhì)（例如噬菌調(diào)理素、纖維蛋白、血纖維蛋白原）、神經(jīng)元肽以 及激素（例如神經(jīng)調(diào)壓素、胃泌素、愛(ài)帕琳（Apelin)和食欲素A(OrexinA))抗體（例 如英利昔單抗（Infliximab)、西妥昔單抗（Cetuximab)、利妥昔單抗（Rituximab)、曲妥 珠單抗（Trastuzumab)、貝伐單抗（Bevacizumab)、帕尼單抗（Panitumumab)、阿達(dá)木單抗 (Adalimumab)、蘭比珠單抗（Ranibizumab))中。N-端谷酰胺和谷氨酸殘基可自發(fā)地環(huán)化 以變成焦谷氨酸。這是被阻斷的N-端的若干形式中的一種，存在關(guān)于使用愛(ài)德曼化學(xué)方法 (Edmanchemistry)進(jìn)行N-端定序的一個(gè)問(wèn)題，其需要焦谷氨酸中不存在的自由伯氨基。 酶焦谷氨酸胺基肽酶可通過(guò)從焦谷氨酸殘基裂解來(lái)恢復(fù)自由N-端。
[0027] 如本文中所使用，"純化過(guò)程"是指意圖從復(fù)雜混合物分離蛋白質(zhì)的一個(gè)過(guò)程或一 系列過(guò)程。蛋白質(zhì)可由一種或多種同種型（即呈現(xiàn)不均勻性）組成。術(shù)語(yǔ)"純化過(guò)程"涵 蓋（但不限于）蛋白質(zhì)和抗體純化。起始物質(zhì)通常是細(xì)胞培養(yǎng)物（例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 物、酵母培養(yǎng)物或微生物培養(yǎng)物）并且純化過(guò)程中的不同步驟可從限制蛋白質(zhì)的基質(zhì)釋放 蛋白質(zhì)，分離混合物中的蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)部分，并且最終從所有其它蛋白質(zhì)分離出所需 蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)是抗體的情況下，典型分離包含蛋白質(zhì)A親和色譜、陽(yáng)離子交換色譜、陰 離子交換色譜、疏水性相互相用和/或羥基磷灰石色譜。
[0028] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"抗體