帕妥珠單抗變體及其評估的制作方法
【專利說明】帕妥珠單抗變體及其評估
[0001] 依照37CFR§ 1. 53 (b)提交的此非臨時申請要求2013年4月16日提交的流水號 61/812, 603的美國臨時申請依照35USC§ 119(e)的權(quán)益,通過援引將其完整收錄。
[0002] 序列表
[0003] 本申請含有經(jīng)EFS-Web提交并通過援引在此完整收錄的序列表。2014年4月8日 創(chuàng)建的所述ASCII拷貝的名稱為P5584Rl_W0_SeqList.txt且大小為31,363個字節(jié)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明關(guān)注帕妥珠單抗(Pertuzumab)的變體。特別地,它關(guān)注:在帕妥珠單抗的 一個或全部兩個可變輕域中包含Cys23/Cys88未配對半胱氨酸的未配對半胱氨酸變體,帕 妥珠單抗的無巖藻糖基化變體,帕妥珠單抗的低分子量種類(LMffS),和帕妥珠單抗的高分 子量種類(HMffS)。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)注分離的變體,包含變體的組合物,藥物組合物,和制品, 以及生成和表征變體及其組合物的方法。
[0005] 發(fā)明背景
[0006]帕妥珠單抗(PERJETA? )(也稱作rhuMAb2C4)是一種單克隆抗體(MAb),它 是稱作"HER二聚化抑制劑"的一系列藥劑中它所在類別的第一種。通過結(jié)合HER2,它抑制 HER2與其它HER受體二聚化并由此抑制腫瘤生長。帕妥珠單抗在2012年6月8日收到美 國食品和藥品管理局(USFDA)批準(zhǔn)用于治療HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。
[0007] 美國專利No. 7, 862, 817 (Adams等人)記載了 2C4抗體的人源化變體,稱作人源化 2C4型式574或重組人源化單克隆抗體2C4(rhuMAb2C4)??贵w結(jié)合人表皮生長因子受體 2 (HER2)胞外域(E⑶)中的亞域II。以實驗室規(guī)模生成rhuMAb2C4抗體,并顯示結(jié)合HER2 并抑制MDA-175細(xì)胞(其以1+水平表達(dá)HER2)和植入小鼠中的MCF7異種移植物生長。還 可參見Adams等人,CancerImmunol.Immunother. 55 (6) :717-727 (2006) 〇
[0008] 美國專利No. 6, 339, 142 (Blank和Basey)記載了包含抗HER2抗體及一種或多種 其酸性變體的混合物的HER2抗體組合物,其中酸性變體的量小于約25%。人源化單克隆抗 體4D5變體8 (humMAb4D5_8或曲妥珠單抗(Trastuzumab))是例不的HER2抗體。
[0009] 美國專利No. 7, 560, 111,美國專利No. 7, 879, 325,和美國專利No. 8, 241,630(Kao 等人)記載了在抗體的一條或全部兩條輕鏈中包含氨基末端前導(dǎo)延伸(VHS-)的帕妥珠單 抗變體(rhuMAb2C4),即所謂的"VHS-變體"。在于天然條件使用Ellman氏分析對參照材 料(I期),LotS9802A(II期),和400L規(guī)模工藝開發(fā)材料測試游離硫醇時,在測試的所有 材料中游離硫醇水平低于檢測限度。測試的組合物中1-2%的帕妥珠單抗是無巖藻糖基化 (GO-F)的,如通過毛細(xì)管電泳(CE)測定的。參見美國專利No. 7, 560, 111 (Kao等人)的表 5〇
[0010] WO2009/099829 (Harris等人)記載了帕妥珠單抗的酸性變體,包括:脫酰胺變 體,糖化變體,二硫化物還原變體,不可還原變體,和唾液酸化變體。如披露的,變體表征如 下:
[0011] 表I:TO2009/099829(Harris等人)中的酸性變體
[0012]
[0013] CEX=陽離子交換。CE-SDS=具有十二烷基硫酸鈉的毛細(xì)管電泳。
[0014] WO2009/099829 (Harris等人)中用于表征二硫化物還原變體的實驗方法(即對 完整抗體的非還原CE-SDS)評估還原的鏈間二硫鍵,而非鏈內(nèi)二硫鍵。
[0015] Zhang等人,Anal.Chem. 84(16) :7112-7123(2012)報告了在其可變重(VH域)中 具有未配對半胱氨酸(Cys22和Cys96)的重組抗體(mAbA)。發(fā)現(xiàn)未配對半胱氨酸對抗體 結(jié)合CD20沒有顯著影響,而且具有未配對半胱氨酸的mAbA在效力測定法(補體依賴性細(xì) 胞毒性,CDC,測定法)中是有完全活性的。
[0016] 10 20〇9/0〇9523(1^〇等人)披露了結(jié)合0)2〇的〇(^6(3112111^13(濁11嫩13 2117)抗體 的重組生產(chǎn)期間鏈間二硫鍵還原的阻止。
[0017] Harris,R.,Dev.Biol. (Basel,Switzerland) 122 :117-127(2005)披露了 omalizumab(-種人源化抗IgE抗體)的可變重(VH)域中的未配對半胱氨酸(Cys22和 Cys96)。未配對半胱氨酸形式具有顯著更低的效力。
[0018] 發(fā)明概述
[0019] 本文中的實驗數(shù)據(jù)關(guān)注帕妥珠單抗的變體形式,包括未配對半胱氨酸變體,無巖 藻糖基化變體,低分子量種類(LMffS),和高分子量種類(HMffS)。用于鑒定,表征,和量化這 些變體的手段在用于帕妥珠單抗藥物組合物的制造和品質(zhì)控制方法中是有價值的。
[0020] 如此,在第一個方面,本發(fā)明關(guān)注包含帕妥珠單抗及其未配對半胱氨酸變體的組 合物,其中未配對半胱氨酸變體在帕妥珠單抗的一個或全部兩個可變輕域中包含Cys23/ Cys88未配對半胱氨酸。未配對半胱氨酸變體包括異二聚體變體(在帕妥珠單抗的僅一個 可變輕域中包含Cys23/Cys88未配對半胱氨酸)和/或同二聚體變體(在帕妥珠單抗的全 部兩個可變輕域中包含Cys23/Cys88未配對半胱氨酸)。
[0021] 組合物任選進(jìn)一步包含一種或多種別的帕妥珠單抗變體,諸如無巖藻糖基化變 體,低分子量種類(LMffS)變體,高分子量種類(HMffS)變體,糖化變體,二硫化物還原變體, 不可還原變體,脫酰胺變體,唾液酸化變體,VHS-變體,C末端賴氨酸變體,甲硫氨酸氧化變 體,Gl糖基化變體,G2糖基化變體,和非糖基化重鏈變體。
[0022] 本發(fā)明還關(guān)注包含帕妥珠單抗和帕妥珠單抗的無巖藻糖基化變體的組合物,其中 無巖藻糖基化變體的量為組合物的〇. 9-4. 1 %。在一個實施方案中,本發(fā)明關(guān)注包含帕妥珠 單抗和帕妥珠單抗的無巖藻糖基化變體的組合物,其中無巖藻糖基化變體的量為大于組合 物的2%。依照這個實施方案,無巖藻糖基化變體的量大于美國專利No. 7, 560, 111,美國專 利No. 7, 879, 325,和美國專利No. 8, 241,630(Kao等人)中報告的量。
[0023] 在一個別的方面,本發(fā)明關(guān)注包含帕妥珠單抗,帕妥珠單抗的低分子量種類 (LMffS),和帕妥珠單抗的高分子量種類(HMffS)的混合物的組合物,其中LMffS的量為 彡1.6%且HMWS的量為彡1.7%。
[0024] 本發(fā)明還關(guān)注包含帕妥珠單抗,峰1,和峰2的混合物的組合物,其中峰1的量為 彡0. 5%且峰2的量為彡1. 0%,如通過還原毛細(xì)管電泳十二烷基硫酸鈉(R-CE-SDS)測定 法測量的。
[0025] 本發(fā)明的別的方面關(guān)注使用或包含本文中的組合物的藥物組合物,制品,和治療 癌癥患者的方法。
[0026] 在一個別的方面,本發(fā)明關(guān)注用于評估帕妥珠單抗組合物的方法,其包括:(1)測 量組合物中未配對半胱氨酸變體的量,其中未配對半胱氨酸變體在帕妥珠單抗的一個或全 部兩個可變輕域中包含CyS23/CyS88未配對半胱氨酸;和/或(2)測量組合物中無巖藻糖 基化帕妥珠單抗的量;和/或(3)測量組合物中帕妥珠單抗的低分子量種類(LMffS)或高分 子量種類(HMffS)的量。
[0027] 在還有一個別的方面,本發(fā)明關(guān)注用于評估帕妥珠單抗組合物的生物學(xué)活性的方 法,其包括測量組合物中無巖藻糖基化帕妥珠單抗變體的量以測定組合物的抗體依賴性 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性,并確認(rèn)無巖藻糖基化帕妥珠單抗的量在自約0.9至約 4. 1 %的范圍中。
[0028] 在另一個方面,本發(fā)明關(guān)注用于生成組合物的方法,其包括:(1)生成包含帕妥 珠單抗及一種或多種其變體的組合物,并(2)對如此生成的組合物進(jìn)行分析性測定法以 評估其中變體的量,其中變體包含:(i)在帕妥珠單抗的一個或全部兩個可變輕域中包含 Cys23/Cys88未配對半胱氨酸的未配對半胱氨酸變體;和/或(ii)帕妥珠單抗的無巖藻糖 基化變體;和/或(iii)帕妥珠單抗的高分子量種類(HMffS);和/或(iv)帕妥珠單抗的低 分子量種類(LMffS),和/或(V)帕妥珠單抗的峰1片段,和/或(vi)帕妥珠單抗的峰2片 段。
[0029] 在另一個方面,本發(fā)明關(guān)注分離的帕妥珠單抗變體,其中分離的變體包含:(a) 帕妥珠單抗的未配對半胱氨酸變體,其中變體為在帕妥珠單抗的僅一個可變輕域中包含 Cys23/Cys88未配對半胱氨酸的異二聚體變體;和/或(b)帕妥珠單抗的未配對半胱氨酸 變體,其中變體為在帕妥珠單抗的全部兩個可變輕域中包含CyS23/CyS88未配對半胱氨酸 的同二聚體變體;和/或(c)帕妥珠單抗的無巖藻糖基化變體;和/或(d)帕妥珠單抗的高 分子量種類(HMffS);和/或(e)帕妥珠單抗的低分子量種類(LMffS);和/或(f)帕妥珠單 抗的峰1片段,和/或(g)帕妥珠單抗的峰2片段。
[0030] 在一個別的方面,本發(fā)明關(guān)注用于評估帕妥珠單抗組合物的片段化的方法,其包 括通過還原毛細(xì)管電泳十二烷基硫酸鈉(R-CE-SDS)測定法測量組合物中峰1和峰2的量 并確認(rèn)峰1的量為< 5%且峰2的量為< 1. 0%。
[0031] 附圖簡述
[0032] 圖1提供HER2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖,及其胞外域的亞域I_IV(分別為SEQIDNO: 1-4)的氨基酸序列。
[0033] 圖2A和2B描繪鼠單克隆抗體2C4的可變輕(VL)(圖2A)和可變重(VH)(圖2B) 域(分別為SEQIDNO:5和6);變體574/帕妥珠單抗的VL和VH域(分別為SEQIDNO: 7和8),和人VL和VH共有框架(humK1,輕卡帕亞組I;humIII,重亞組III)(分別為SEQ IDNO:9和10)的氨基酸序列比對。星號鑒別帕妥珠單抗和鼠單克隆抗體2C4的可變域之 間或帕妥珠單抗和人框架的可變域之間的的差異?;パa決定區(qū)(CDR)在括號中。
[0034] 圖3A和3B顯示帕妥珠單抗輕鏈(圖3A;SEQIDNO:11)和重鏈(圖3B;SEQID NO:12)的氨基酸序列。⑶R以粗體顯示。輕鏈和重鏈的計算分子量為23, 526. 22Da和 49,216. 56Da(半胱氨酸處于還原形式)。碳水化合物模塊附著至重鏈的Asn299。
[0035] 圖4A和4B分別顯示曲妥珠單抗輕鏈(圖4A;SEQIDNO:13)和重鏈(圖4B;SEQ IDNO:14)的氨基酸序列??勺冚p和可變重域的邊界以箭指示。
[0036] 圖5A和5B分別描繪一種變體帕妥珠單抗輕鏈序列(圖5A;SEQIDNO:15)和一 種變體帕妥珠單抗重鏈序列(圖5B;SEQIDNO:16)。
[0037] 圖6描繪(主要種類)帕妥珠單抗的結(jié)構(gòu),包括其4個鏈間和12個鏈內(nèi)二硫鍵, 包括每個可變輕(VL)域中的Cys23/Cys88鏈內(nèi)二硫鍵。描繪的域為:VL=可變輕域;VH= 可變重域;CL=輕鏈恒定域;CHl=重鏈恒定域I;CH2 =重鏈恒定域2 ;CH3 =重鏈恒定域 3〇
[0038] 圖7顯示帕妥珠單抗的非還原(天然)胰蛋白酶肽圖。
[0039] 圖8描繪還原的和非還原的帕妥珠單抗的胰蛋白酶肽圖(全刻度)。
[0040] 圖9描繪還原的和非還原的帕妥珠單抗的胰蛋白酶肽圖(0-120分鐘)。
[0041] 圖10描繪還原的和非還原的帕妥珠單抗的胰蛋白酶肽圖(120-204分鐘)。
[0042] 圖11描繪木瓜蛋白酶消化的帕妥珠單抗的疏水相互作用層析(HIC)分析。
[0043] 圖12描繪木瓜蛋白酶消化的帕妥珠單抗的HIC分析(擴(kuò)展視圖)。
[0044] 圖13描繪完整帕妥珠單抗的HIC分析。顯示包含下述各項的峰:富集的游離硫醇 同二聚體(全部兩條輕鏈上的游離硫醇),游離硫醇異二聚體(一個輕鏈上的游離硫醇), 和野生型同二聚體(主要種類抗體)。
[0045] 圖14描繪帕妥珠單抗(批次anti2C4907_2)在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (ADCC)測定法中的活性。
[0046] 圖15描繪GO-F水平對ADCC活性的影響。測試的樣品為III期帕妥珠單抗(G0-F =2. 2% )和I期帕妥珠單抗(G0-F= 0? 8% )。
[0047] 圖16描繪對自帕妥珠單抗釋放的N連接寡糖的毛細(xì)管電泳分析。
[0048] 圖17描繪對自帕妥珠單抗釋放的N連接寡糖的毛細(xì)管電泳分析(擴(kuò)展視圖)。注 意:Gl寡糖具有兩種異構(gòu)形式(標(biāo)記為Gl和G1'),其中末端半乳糖殘基附著至a1-6分 支或a1-3分支任一。
[0049] 圖18描繪帕妥珠單抗Fab和Fc(有限的Lys-C消化)分開的反相-高效液體層 析(HP-HPLC)。顯示有限的Lys-C消化的帕妥珠單抗和然后用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)處 理的有限的Lys-C消化的帕妥珠單抗。
[0050] 圖19描繪肽作圖,確認(rèn)帕妥珠單抗游離硫醇Fab在其輕鏈含有游離Cys23和 Cys88。來自含有游離硫醇的Fab的L2肽被NEM標(biāo)記并因此在肽圖分析中移位。
[0051] 圖20示意性描繪:主要種類或野生型IgGl(圖20A),Cys23/Cys88異二聚體變體 (圖20B),和Cys23/Cys88同二聚體變體(圖20C)。
[0052] 圖21描繪帕妥珠單抗批次的%GO-F對ADCC活性,使用本文中實施例4中的測定 法。
[0053] 圖22示意性描繪帕妥珠單抗在HER2的異二聚體結(jié)合位點處結(jié)合,由此阻止與活 化的EGFR或HER3異二聚化。
[0054] 圖23比較曲妥珠單抗(其結(jié)合HER2E⑶的近膜域附近的亞域IV)和帕妥珠單抗 (其結(jié)合HER2E⑶的亞域II)的活性。
[0055] 圖24A和24B描繪附著至IgG抗體的寡糖結(jié)構(gòu)。
[0056] 圖25描繪帕妥珠單抗的大小排阻層析(SEC)分析(全刻度)。
[0057] 圖26描繪帕妥珠單抗的SEC分析(擴(kuò)展刻度)。峰包括主峰(主要種類抗體), 高分子量種類(HMffS),和低分子量種類(LMffS)。
[0058] 圖27描繪帕妥珠單抗樣品的大小排阻-高效液體層析(SE-HPLC)分析。樣品A為 代表性帕妥珠單抗成品藥批次。樣品B為以1. 2毫勒克斯小時進(jìn)行光暴露的帕妥珠單抗批 次。樣品C為以3. 6毫勒克斯小時進(jìn)行光暴露的帕妥珠單抗批次。樣品D為于pH3. 2進(jìn) 行酸處理的帕妥珠單抗批次。樣品E為來自離子交換-HPLC(IEHPLC)的純化的堿性變體。
[0059] 圖28描繪分析性超速離心(AUC)沉降速度和SE-HPLC分析的一致性圖 (concordanceplot)。誤差棒代表來自n= 3測定的兩個標(biāo)準(zhǔn)偏差。所有其它數(shù)據(jù)點表示 單次測定。圓圈表示具有低于AUC檢測水平的HMWS水平的樣品。
[0060] 圖29描繪非還原帕妥珠單抗的毛細(xì)管電泳十二烷基硫酸鈉分析(CE-SDS)及激光 誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測。
[0061] 圖30描繪非還原(NR)帕妥珠單抗的CE-SDS-LIF(擴(kuò)展視圖)。
[0062] 圖31A和31B描繪實施例6的SE-HPLC層析圖:全刻度(圖31A)和擴(kuò)展刻度(圖 31B) 〇
[0063] 圖32A和32B描繪實施例6的非還原CE-SDS(NR-CE-SDS)電泳圖:全刻度(圖32A) 和擴(kuò)展刻度(圖32B)。
[0064] 圖33A和33B描繪實施例6的還原CE-SDS(R-CE-SDS)電泳圖:全刻度(圖33A), 和擴(kuò)展刻度(圖33B)。
[0065] 圖34提供酸處理樣品的NR-CE-SDS和R-CE-SDS電泳圖的比較(擴(kuò)展刻度)。
[0066] 圖35描繪NR-CE-SDS和SE-HPLC之間Fab量化的相關(guān)性。
[0067] 發(fā)明詳述
[0068] I?定義
[0069] "配對半胱氨酸"在本文中指蛋白質(zhì)(諸如抗體)中形成二硫鍵的兩個半胱氨酸殘 基。此類二硫鍵可以是鏈間二硫鍵(例如抗體的重和輕鏈之間的或抗體的兩條重鏈之間的 二硫鍵),或鏈內(nèi)二硫鍵(例如抗體的一條輕鏈內(nèi)的或抗體的一條重鏈內(nèi)的)。大多數(shù)IgGl 抗體包含四個鏈間二硫鍵和十二個鏈內(nèi)二硫鍵。見圖6。
[0070] "未配對半胱氨酸變體"為蛋白質(zhì)(例如抗體,諸如帕妥珠單抗)的一種變體,其中 一個或多個配對半胱氨酸沒有處于成二硫鍵狀態(tài)。此類未配對半胱氨酸可以是尚未配對以 形成二硫鍵(例如當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)最初折疊成它的三級結(jié)構(gòu)時)或可以是已經(jīng)形成二硫鍵但其稍 后斷裂(例如在制造期間或在貯藏后)。未配對半胱氨酸常常稱作游離硫醇或游離氫硫基。 在一個實施方案中,未配對半胱氨酸來自鏈內(nèi)二硫鍵。在一個實施方案中,未配對半胱氨 酸在抗體的輕鏈(例如可變輕域)中。在一個實施方案中,未配對半胱氨酸變體為Cys23/Cys88變體。
[0071] "Cys23/Cys88"未配對半胱氨酸變體缺乏抗體的一個或全部兩個可變輕域中的半 胱氨酸殘基23和88處的分子內(nèi)二硫鍵。見本文中的圖20(b)和(c)。
[0072] "同二聚體變體"缺乏抗體的全部兩個可變輕域中的Cys23/Cys88二硫鍵。見本文 中的圖20(c)。
[0073] "異二聚體變體"缺乏抗體的一個可變輕域中的僅一個Cys23/Cys88二硫鍵。見本 文中的圖20(b)。
[0074] "無巖藻糖基化變體"為抗體的一種糖基化變體,其中附著至一條或全部兩條重鏈 中的殘基Asn299的一個或全部兩個寡糖結(jié)構(gòu)中缺乏巖藻糖,例如在核心寡糖結(jié)構(gòu)中缺乏 Fuca(1->6)。
[0075] 帕妥珠單抗的"低分子量種類"或"LMWS"包含帕妥珠單抗的一種片段,其具有 小于主要種類或完整帕妥珠單抗的分子量的分子量(例如其中完整帕妥珠單抗具有約 145, 197Da的分子量,僅測量它的肽鏈)。LMffS可通過大小排阻高效液體層析(SE-HPLC)和 /或具有十二烷基硫酸鈉的非還原毛細(xì)管電泳(CE-SDS)來檢測,例如實施例5中的。在一 個實施方案中,LMffS包含通過CE-SDS獲得的"峰6 "或由通過CE-SDS獲得的"峰6 "組成 (見例如實施例5)。
[0076] "高分子量種類"或"HMWS"包含帕妥珠單抗的一種制備物,其具有大于主要種類 或完整帕妥珠單抗的分子量的分子量(例如其中完整帕妥珠單抗具有約145, 197Da的分子 量,僅測量它的肽鏈)。HMffS可通過大小排阻高效液體層析(SE-HPLC)和/或具有十二烷 基硫酸鈉的非還原毛細(xì)管電泳(CE-SDS)測定法來檢測,例如實施例5中的。
[0077] 本文中的"峰1"指其大小比帕妥珠單抗輕鏈(LC)要小的帕妥珠單抗片段??梢?通過CE-SDS測定法(優(yōu)選還原CE-SDS(R-CE-SDS)測定法)將峰1片段與主要種類帕妥珠 單抗分開。見例如本文中的圖33B,表16,和表18。優(yōu)選地,帕妥珠單抗組合物中峰1的量 為< 0. 5%。任選地,如實施例6中所述進(jìn)行R-CE-SDS測定法,而且校正峰面積(CPA)提供 組合物中的%峰1。
[0078] 本文中的"峰2"指其大小比要帕妥珠單抗輕鏈(LC)大且比帕妥珠單抗非糖基化 重鏈(NGHC)要小的帕妥珠單抗片段??梢酝ㄟ^CE-SDS(優(yōu)選還原(R-CE-SDS)測定法)將 峰2與主要種類帕妥珠單抗分開。峰2排除R-CE-SDS測定法期間可出現(xiàn)的峰3,如本文中 的實施例6中解釋的。見例如本文中的圖33B,表16,和表18。優(yōu)選地,帕妥珠單抗組合物 中峰2的量為彡1. 0%。任選地,如實施例6中所述進(jìn)行R-CE-SDS測定法,而且校正峰面積 (CPA)提供組合物中的%峰2。
[0079] "片段化"指多肽鏈切割,例如帕妥珠單抗輕鏈和/或重鏈的切割。它不包括例如 NR-CE-SDS分析期間非共價聯(lián)合的多肽鏈的解離。
[0080] "分析性測定法"為定性評估和/或定量測量組合物中分析物(例如抗體變體)的 存在或量的測定法。進(jìn)行測定法的組合物可以是純化的組合物,包括藥物組合物。
[0081] "Fab疏水性相互作用層析測定法"或"FabHIC測定法"包含生成組合物中的抗體 的片段(例如Fab片段)(例如使用酶木瓜蛋白