專利名稱：用于測(cè)定不均一核核糖核蛋白B1(hnRNP B1)mRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于以簡(jiǎn)便、等溫和一步方式快速測(cè)定hnRNP B1 mRNA的方法。本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域并且尤其是臨床診斷領(lǐng)域，并且提供了用于早期診斷癌、監(jiān)測(cè)治療、判斷預(yù)后和確定治療方針提供有用指標(biāo)。
背景技術(shù)：
不均一核核糖核蛋白(此后稱為hnRNP)A2/B1是hnRNP的主要組成成分。所述HnRNP與不均一核RNA(主要由前體信使RNA組成)形成復(fù)合體存在于細(xì)胞核，并參與信使RNA(mRNA)的加工、核外運(yùn)輸及穩(wěn)定性。hnRNP A2和hnRNP B1是剪接變體，其中hnRNP A2除缺失結(jié)構(gòu)基因5’端36個(gè)核苷酸外具有與hnRNP B1相同的序列(見Burd，C.G.，等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，9788-9792和Maeda，A.等，(1994)EMBO J.，13，5783-5795)。
近年來已發(fā)現(xiàn)胰癌和肺癌組織中hnRNP A2/B1過量表達(dá)，并且這已經(jīng)引起了其作為診斷標(biāo)志用于癌癥的興趣(見特表2000-500322號(hào)公報(bào)(Kohyo)和Zhou，J.，等，(1996)J.Biol.Chem.，271，10760-10766，F(xiàn)ielding，P.，等，(1999)Clin.Cancer Res.，5，4048-4052，Zhou，J.，等，(2001)Lung CancerRes.，34，341-350)。
用于測(cè)定hnRNP A2/B1表達(dá)的高敏感測(cè)定方法已報(bào)導(dǎo)，其中通過RT-PCR擴(kuò)增hnRNP A2/B1 mRNA并測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的量(見如前引證的特表2000-500322號(hào)公報(bào)(Kohyo)和Zhou等(2001))。近來研究表明來自癌癥早期階段的人癌細(xì)胞中hnRNP B1過量表達(dá)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)基于通過RT-PCR測(cè)定hnRNP B1 mRNA，與正常組織相比較，hnRNP B1 mRNA水平在癌組織中比hnRNP A2/B1更特異性地提高，并且因此測(cè)定hnRNPB1表達(dá)水平對(duì)肺癌早期診斷有用(見Sueoka，E.，等，(1999)Cancer Res.，59，1404-1407，Sueoka，E.，等，(2001)Cancer Res.，61，1896-1902，F(xiàn)leischhacker，M.，等，(2001)Ann.N.Y.Acad.Sci.，945，179-188)。
這些發(fā)現(xiàn)提示hnRNP B1可以充當(dāng)比hnRNP A2/B1更有用的癌標(biāo)志。用于高敏感性測(cè)定hnRNP B1的一種方法是通過RT-PCR擴(kuò)增hnRNP B1mRNA并測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的量，但這通常需要兩步驟方法，包括逆轉(zhuǎn)錄(RT)階段和PCR階段，這不僅使此方法復(fù)雜化和較低可再現(xiàn)性，而且增加二次污染的風(fēng)險(xiǎn)。另外，大部分情況下組合的RT和PCR階段花費(fèi)2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，因此該方法不適合于處理多個(gè)樣品或降低檢查成本。此外，因?yàn)镽T-PCR中DNA也擴(kuò)增，故如果目的是僅擴(kuò)增mRNA，則染色體DNA必須在核酸提取步驟期間通過DNA酶處理等徹底除去，并且這已經(jīng)導(dǎo)致用于提取核酸的更復(fù)雜方法。此外，PCR需要在反應(yīng)溫度上劇烈升高/降低，這對(duì)于自動(dòng)化反應(yīng)裝置節(jié)省動(dòng)力和降低成本構(gòu)成障礙。
另一個(gè)方面，用于在恒定溫度僅擴(kuò)增RNA的方法已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，如NASBA方法(見日本專利號(hào)2650159和日本專利號(hào)3152927)和TMA方法(見日本專利號(hào)3241717)。這些RNA擴(kuò)增方法使用鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中使用針對(duì)靶RNA的包含啟動(dòng)子序列的引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和根據(jù)需要核糖核酸酶H(RNA酶H)以合成含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA，使用RNA聚合酶以合成含有靶RNA的特定核苷酸序列的RNA，并隨后使用此RNA作為模板以合成含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA。RNA擴(kuò)增后，通過電泳方法或使用與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的核酸探針通過雜交方法檢測(cè)擴(kuò)增的RNA。
這些RNA擴(kuò)增方法適用于簡(jiǎn)便的mRNA測(cè)定因?yàn)樗鼈円缘葴亍⒁徊椒绞絻H擴(kuò)增RNA，但是通過雜交方法等檢測(cè)需要復(fù)雜過程并且不允許高度可再現(xiàn)性的定量。
作為用于擴(kuò)增和測(cè)定mRNA的簡(jiǎn)便方法，可提及由Ishiguro等(特開2000-14400號(hào)公報(bào)(Kokai)和Ishiguro，T.，等，(2003)Anal.Biochem.，314，77-86)描述的方法。在此方法中，在存在核酸探針時(shí)實(shí)施RNA擴(kuò)增，其中該核酸探針以嵌入性熒光色素標(biāo)記并如此設(shè)計(jì)以至在探針與靶核酸形成互補(bǔ)雙鏈時(shí)，嵌入性熒光色素分子通過嵌入至互補(bǔ)雙鏈在熒光特性上發(fā)生改變，并且測(cè)定熒光特性上的改變，因而有可能以簡(jiǎn)便、等溫和一步方式在密封容器內(nèi)同時(shí)完成RNA擴(kuò)增和測(cè)定。
發(fā)明公開測(cè)定hnRNP B1 mRNA對(duì)于肺癌和其它扁平上皮癌早期診斷有用，但是RT-PCR的使用需要具有復(fù)雜過程的兩步驟方法并且需要反應(yīng)溫度劇烈升高/降低。這導(dǎo)致二次污染風(fēng)險(xiǎn)和可再現(xiàn)性不好，同時(shí)對(duì)開發(fā)簡(jiǎn)便的自動(dòng)化測(cè)定法構(gòu)成障礙。本發(fā)明通過提供用于以簡(jiǎn)便、迅速、等溫和一步方式測(cè)定hnRNP B1 mRNA的方法克服了前述困難。
作為旨在解決前述困難的銳意研究成果，本發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)建了應(yīng)用如上所述的RNA擴(kuò)增方法以簡(jiǎn)便、迅速、等溫和一步方式測(cè)定hnRNP B1mRNA的方法。具體地，通過測(cè)定由RNA擴(kuò)增方法得到的已擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物水平，有可能以簡(jiǎn)便、迅速、等溫和一步方式測(cè)定hnRNP B1 mRNA，在所述RNA擴(kuò)增方法中將第一引物和第二引物(至少其一在5’端具有啟動(dòng)子序列)用于產(chǎn)生含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA，使用雙鏈DNA作為模板以產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物并且隨后使用此RNA轉(zhuǎn)錄物作為DNA合成模板以產(chǎn)生雙鏈DNA。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示實(shí)施例2中所制備的嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針的結(jié)構(gòu)。B1、B2、B3和B4代表堿基。
A)根據(jù)Ishiguro等的方法(見Ishiguro，T.，等，(1996)Nucleic AcidsRes.，24，4992-4997)，使嵌入性熒光色素(_唑黃)通過接頭結(jié)合至磷酸二酯部分的探針。為防止3′-末端-OH基延伸反應(yīng)，以羥乙酸修飾3′-末端-OH基。
B)使用商業(yè)可獲得的Label-ON試劑(Clontech)導(dǎo)入氨基，根據(jù)Ishiguro等的方法(見如前引證的Ishiguro等(1996))，使其結(jié)合有_唑黃的探針。這里將氨基導(dǎo)入于導(dǎo)入位置缺少核苷的部分(圖中B3)。為防止3′-末端-OH基延伸反應(yīng)，以生物素修飾3′-末端-OH基。
圖2顯示作為實(shí)施例3測(cè)定結(jié)果所得到的熒光曲線。
顯示的是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施RNA擴(kuò)增同時(shí)定時(shí)測(cè)量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)470nm，熒光波長(zhǎng)520nm)的結(jié)果。水平軸代表反應(yīng)時(shí)間，并且垂直軸代表熒光強(qiáng)度比(反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度/背景熒光)。圖中的拷貝數(shù)代表每一試驗(yàn)中所用hnRNP B1 RNA(包括堿基編號(hào)157-1249)的起始數(shù)(通過在260nm的吸光度計(jì)算)。
圖3顯示作為實(shí)施例4測(cè)量結(jié)果所得到的熒光曲線。
顯示的是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施RNA擴(kuò)增同時(shí)定時(shí)測(cè)量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)470nm，熒光波長(zhǎng)520nm)的結(jié)果。水平軸代表反應(yīng)時(shí)間，并且垂直軸代表熒光強(qiáng)度比(反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度/背景熒光)。本圖說明中的數(shù)字代表所用hnRNP B1 RNA(包括堿基編碼157-1249)的起始數(shù)(通過在260nm的吸光度計(jì)算)。
圖4是自圖3的結(jié)果所得到的校準(zhǔn)曲線。將檢測(cè)時(shí)間定義為在圖3結(jié)果中熒光強(qiáng)度比達(dá)到1.2的時(shí)間，將檢測(cè)時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)RNA的拷貝起始數(shù)的對(duì)數(shù)作圖。未知樣品拷貝的起始數(shù)自該校準(zhǔn)曲線和通過本方法得到的未知樣品的檢測(cè)時(shí)間計(jì)算。
用于實(shí)施本發(fā)明的最佳實(shí)施方案現(xiàn)在更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
本發(fā)明是用于測(cè)定樣品中存在的不均一核核糖核蛋白B1(HnRNP B1)mRNA的方法，該方法包括使用與RNA的特定堿基序列5’末端下游的至少部分同源的第一引物和與所述特定堿基序列3’末端上游的至少部分互補(bǔ)的第二引物(其中第一引物和第二引物至少之一在5’末端具有啟動(dòng)子序列)以產(chǎn)生含有啟動(dòng)子序列和該啟動(dòng)子序列下游的特定堿基序列的雙鏈DNA的步驟；使用所述雙鏈DNA作為模板以形成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；接下來使用所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為DNA合成的模板以產(chǎn)生雙鏈DNA的步驟；在允許同時(shí)進(jìn)行前述各步驟的條件下重復(fù)前述步驟的核酸擴(kuò)增步驟；以及測(cè)定前述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的步驟。
本發(fā)明的樣品為通過已知方法自樣品如血液、血清、血漿、組織或懷疑含有癌細(xì)胞的洗凈液等中提取的核酸組成。
本發(fā)明的特定核苷酸序列包含hnRNP B1 mRNA的至少部分序列或其互補(bǔ)序列，并且具有第一引物和第二引物所定義區(qū)域的序列。根據(jù)本發(fā)明，來自此特定核苷酸序列的RNA轉(zhuǎn)錄物得以擴(kuò)增。當(dāng)將啟動(dòng)子序列添加至第一引物時(shí)，hnRNP B1 mRNA在充當(dāng)用于cDNA合成的模板前優(yōu)選地在特定核酸序列的5’端切割。不特別限制切割方法，但是它優(yōu)選地是使用具有RNA酶H活性的酶切割RNA-DNA雜交體的RNA部分的方法，其中所述RNA-DNA雜交體通過添加具有與hnRNP B1 mRNA的特定核苷酸序列5’端重復(fù)的相鄰區(qū)域互補(bǔ)的序列的寡核苷酸(切割用寡核苷酸)形成，并且優(yōu)選地所用的切割用寡核苷酸3’-末端-OH得以合適修飾例如胺化以防止延伸反應(yīng)。
本發(fā)明的靶核酸是指在所述特定堿基序列中的顯示與第一引物和第二引物不同源或不互補(bǔ)的區(qū)域，但具有允許與嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針互補(bǔ)性結(jié)合的序列。因此，嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針是與本發(fā)明特定核苷酸序列的部分互補(bǔ)的序列。因此根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)特定的核苷酸序列是同源于hnRNP B1 mRNA的序列時(shí)，嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針具有如SEQ ID NO3所示序列中至少15個(gè)連續(xù)堿基的序列，并且當(dāng)特定的核苷酸序列是互補(bǔ)于hnRNP B1 mRNA的序列時(shí)，嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針具有包含如SEQ ID NO3所示序列的互補(bǔ)序列中至少15個(gè)連續(xù)堿基的序列。
本發(fā)明的第一引物和第二引物至少其中之一在5’端具有啟動(dòng)子序列，并且第一引物對(duì)于hnRNP B1 mRNA的互補(bǔ)序列、第二引物對(duì)于hnRNP B1mRNA，分別為具有充分互補(bǔ)性的寡核苷酸?！宄浞值幕パa(bǔ)性″意指在本發(fā)明核酸擴(kuò)增步驟的反應(yīng)條件(反應(yīng)溫度和鹽的組成等)下可以與所述特定核苷酸序列或該序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行互補(bǔ)性結(jié)合。此類反應(yīng)條件可以是例如在43℃存在60mM Tris、17mM氯化鎂、100mM氯化鉀和1mM DTT的雜交條件。
為了使第一引物對(duì)于hnRNP B1 mRNA的互補(bǔ)序列、第二引物對(duì)于hnRNP B1 mRNA、以及嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針對(duì)于靶核酸分別充分互補(bǔ)，第一引物優(yōu)選地包含如SEQ ID NO1所示序列的至少15個(gè)并且更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)堿基，第二引物優(yōu)選地包含如SEQ ID NO2所示序列的至少15個(gè)并且更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)堿基，并且嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針優(yōu)選地包含如SEQ ID NO3所示序列或與該序列互補(bǔ)序列的至少15個(gè)并且更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)堿基。
備選地，第一引物、第二引物和嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針可以是分別具有這樣堿基序列的序列，所述堿基序列為在高嚴(yán)格條件下例如在前述用于本發(fā)明核酸擴(kuò)增步驟的反應(yīng)條件下分別與SEQ ID NO1、2或3所示序列的互補(bǔ)鏈雜交的堿基序列。
由于第一引物基于hnRNP B1 mRNA中所包含的、在hnRNP A2 mRNA中缺少的序列設(shè)計(jì)，故其可用于僅hnRNP B1 mRNA的特異性測(cè)定。
本發(fā)明所用的啟動(dòng)子序列是與RNA聚合酶結(jié)合以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的序列，并且對(duì)應(yīng)于不同RNA聚合酶的特異性序列為已知。對(duì)RNA聚合酶沒有特別限制，但優(yōu)選常用的RNA聚合酶如T7噬菌體RNA聚合酶、T3噬菌體RNA聚合酶和SP6噬菌體RNA聚合酶，并且可以使用它們對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子序列。
本發(fā)明用于測(cè)定hnRNP B1 mRNA的方法需要某些酶(對(duì)單鏈RNA模板具有依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)活性的酶、對(duì)單鏈DNA模板具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶、以及具有RNA聚合酶活性的酶)。各種酶可以使用具有多種活性的一種酶，也可以使用具有分別的活性的多種酶。例如向同時(shí)對(duì)單鏈RNA模板具有依賴RNA的DNA聚合酶活性、具有RNA酶H活性、并對(duì)單鏈DNA模板具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶不僅添加具有RNA聚合酶活性的酶，根據(jù)需要進(jìn)一步添加具有RNA酶H活性的酶作為補(bǔ)充。從靈活使用的觀點(diǎn)優(yōu)選AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和它們的衍生物作為逆轉(zhuǎn)錄酶。
當(dāng)在第一引物、第二引物和hnRNP B1 mRNA存在下實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，第二引物與hnRNP B1 mRNA的特定堿基序列結(jié)合并以具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶實(shí)施cDNA合成。所得到RNA-DNA雜交體的RNA部分由具有RNA酶H活性的酶降解，并解離以至第一引物可與cDNA結(jié)合。
隨后，自特定堿基序列衍生并在5’端含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA通過具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶產(chǎn)生。此雙鏈DNA含有該啟動(dòng)子序列下游的特定堿基序列并且自該特定堿基序列衍生的RNA轉(zhuǎn)錄物通過具有RNA聚合酶活性的酶產(chǎn)生。RNA轉(zhuǎn)錄物充當(dāng)模板用于通過第一引物和第二引物合成雙鏈DNA，以至作為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一系列反應(yīng)進(jìn)行并且導(dǎo)致擴(kuò)增RNA轉(zhuǎn)錄物。
為促進(jìn)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，當(dāng)然需要至少添加如對(duì)每種酶為必需的已知成分即緩沖劑、鎂鹽、鉀鹽、核苷三磷酸和核糖核苷三磷酸。此外，可以添加添加劑如二甲基亞砜(DMSO)、二硫蘇糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)、糖等以調(diào)節(jié)反應(yīng)效率。
例如，當(dāng)使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶時(shí)，反應(yīng)溫度優(yōu)選地設(shè)定在35℃-65℃范圍，并且最優(yōu)選地將其設(shè)置為40℃-44℃范圍。RNA擴(kuò)增步驟等溫地進(jìn)行，并且可以將反應(yīng)溫度設(shè)置為逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶發(fā)揮它們活性的任意所需溫度。
已擴(kuò)增的RNA轉(zhuǎn)錄物的量可以通過已知的核酸測(cè)定法測(cè)量。應(yīng)用電泳或液相層析的方法，或應(yīng)用以可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的核酸探針的雜交方法作為此類測(cè)量方法可以使用。但這些方法包括多重步驟，并且因?yàn)樽韵到y(tǒng)中取出擴(kuò)增產(chǎn)物用于分析，存在擴(kuò)增產(chǎn)物逃逸至環(huán)境引起二次污染原因的高風(fēng)險(xiǎn)。為克服這些問題，優(yōu)選使用如此設(shè)計(jì)的探針以至于一旦與靶核酸互補(bǔ)性結(jié)合，它的熒光特性即改變。作為更優(yōu)選的方法，可提到這樣的方法，其中在核酸探針存在時(shí)實(shí)施核酸擴(kuò)增步驟，其中所述核酸探針以嵌入性熒光色素標(biāo)記并如此設(shè)計(jì)以致其與靶核酸形成互補(bǔ)雙鏈時(shí)，嵌入性熒光色素分子通過嵌入互補(bǔ)雙鏈而在熒光特性上發(fā)生改變，并且測(cè)量熒光特性上的改變(見特開2000-14400號(hào)公報(bào)(Kokai)和Ishiguro，T.，等，(2003)Anal.Biochem.，314，77-86).
不存在對(duì)嵌入性熒光色素的特別限制，并且可以使用常用色素如_唑黃、噻唑橙、溴化乙錠及其衍生物。熒光特性上的改變可以是熒光強(qiáng)度上的改變。例如，已知在_唑黃時(shí)，嵌入雙鏈DNA引起在510nm處熒光的顯著增加(490nm激發(fā)波長(zhǎng))。嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針是與RNA轉(zhuǎn)錄物具有充分互補(bǔ)性的寡核苷酸，并且它具有這樣的結(jié)構(gòu)嵌入性熒光色素通過適宜的接頭結(jié)合至末端、磷酸二酯部分或堿基部分，并且具有適當(dāng)修飾的3’末端-OH基，以防止自3’-末端-OH的延伸(見特開平8-211050號(hào)公報(bào)(Kokai))。
向寡核苷酸標(biāo)記嵌入性熒光色素可以通過已知方法將官能團(tuán)導(dǎo)入寡核苷酸，從而使嵌入性熒光色素結(jié)合而完成(見特開2001-13147號(hào)公報(bào)(Kokai)和Ishiguro，T.，等，(1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997)。導(dǎo)入官能團(tuán)的方法可以使用常用的Label-ON試劑(Clontech Laboratories，Inc.)。
作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，可以向樣品添加這樣的測(cè)定試劑，其至少含有在5’端具有T7啟動(dòng)子序列的第一引物(包含如SEQ ID NO1所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基)、第二引物(包含如SEQ ID NO2所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基)、嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針(包含如SEQ ID NO3所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基)、切割用寡核苷酸(包含選自SEQ ID NO18-21的序列的至少15個(gè)堿基并具有與特定堿基序列5’端重復(fù)的鄰接區(qū)域互補(bǔ)的序列)、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶、緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、三磷酸核苷、三磷酸核糖核苷和二甲基亞砜(DMSO)，并且在35-65℃(優(yōu)選地40-44℃)的恒定反應(yīng)溫度實(shí)施反應(yīng)同時(shí)定時(shí)測(cè)量反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度。此時(shí)，熒光強(qiáng)度作為自起始RNA量的增加曲線的結(jié)果，并且因此通過使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)RNA繪制出校準(zhǔn)曲線，可以定量未知樣品中RNA的起始量。此外，因?yàn)槎〞r(shí)測(cè)量熒光強(qiáng)度，所以可以在檢測(cè)到熒光顯著增加的任意時(shí)間點(diǎn)終止測(cè)定，測(cè)量結(jié)果通?？梢栽谝恍r(shí)內(nèi)，并且用優(yōu)化系統(tǒng)在30分鐘內(nèi)得到。
尤其值得注意的是可以在同一容器內(nèi)包含測(cè)定試劑中所有的試驗(yàn)材料。即，預(yù)定量的試驗(yàn)材料分注至單個(gè)容器的簡(jiǎn)單操作將允許此后自動(dòng)化擴(kuò)增并檢測(cè)hnRNP B1 mRNA。容器可有由例如允許從外部測(cè)量熒光色素所發(fā)出信號(hào)的至少部分的透明性材料構(gòu)成，并且尤其優(yōu)選可以在分注試驗(yàn)材料后密封的容器以防止污染。
由于根據(jù)如上所述實(shí)施方案的RNA擴(kuò)增和測(cè)定方法可以以一步和等溫方式實(shí)施，因此其比RT-PCR更方便并且適合于自動(dòng)化。然而，由于反應(yīng)在相對(duì)低的35-65℃恒定溫度在沒有如RT-PCR中的變性和復(fù)性步驟時(shí)實(shí)施，反應(yīng)易受非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物如引物二聚體或待測(cè)定RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)影響，并且因此需要更復(fù)雜的設(shè)計(jì)以構(gòu)建與RT-PCR可比較的測(cè)定系統(tǒng)，因?yàn)檫@個(gè)原因以前不可能使用前述RNA擴(kuò)增和測(cè)定方法以快速、簡(jiǎn)便、等溫和一步方式測(cè)定hnRNP B1 mRNA。根據(jù)本發(fā)明，首次有可能以快速、簡(jiǎn)便、等溫和一步方式高特異性和高敏感地測(cè)定hnRNP B1 mRNA。
本發(fā)明可應(yīng)用作為早期診斷肺癌和其它扁平上皮癌、監(jiān)測(cè)化學(xué)療法等的治療效果、診斷微小轉(zhuǎn)移和決定治療方針的指標(biāo)。
實(shí)施例本發(fā)明將通過實(shí)施例進(jìn)一步解釋，并應(yīng)理解本發(fā)明不受實(shí)施例限制。
實(shí)施例1hnRNP B1 RNA通過體外(in vitro)轉(zhuǎn)錄位于SP6噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子下游的具有hnRNP B1 cDNA(包含堿基編號(hào)157-1249，具有根據(jù)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center Biotechnology Information)登錄號(hào)NM_031243的編號(hào))的雙鏈DNA為模板制備，隨后通過DNA酶I處理徹底消化雙鏈DNA并純化RNA。RNA通過在260nm測(cè)量吸光度定量。
如下實(shí)施例以所述RNA作為測(cè)量對(duì)象，但是它們完全適用于測(cè)定作為本發(fā)明測(cè)定對(duì)象的hnRNP B1 mRNA。
實(shí)施例2制備了以嵌入性熒光色素標(biāo)記的寡核苷酸探針。在如SEQ ID NO16和17所示序列5’端的第13位堿基(SEQ ID NO16中的A，SEQ ID NO17中的T)位置使用Label-ON試劑(Clontech)導(dǎo)入氨基，并且以生物素標(biāo)記3′端。_唑黃通過Ishiguro等(見上文，1996)中所述方法與該氨基結(jié)合(圖1B)。此外，_唑黃通過Ishiguro等(見上文，1996)中所述方法經(jīng)接頭與如SEQ ID NO16所示序列5’端第12位的G和第13位的A間的磷酸二酯部分結(jié)合以制備_唑黃-標(biāo)記的核酸探針(圖1A)。
實(shí)施例3將本發(fā)明的方法用于檢測(cè)hnRNP B1 RNA拷貝的不同起始數(shù)。
(1)使用RNA稀釋劑(10mM Tris/HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.25U/μl核糖核酸酶抑制劑、5mM DTT)將前述的hnRNP B1 RNA(包含堿基編號(hào)157-1249)稀釋至25、50、100和1000個(gè)拷貝/5μl作為RNA樣品使用。使用RNA稀釋劑作為陰性標(biāo)準(zhǔn)(0拷貝)。
(2)將具有如下組分的20μl反應(yīng)混合液分配至0.5ml體積PCR管(GeneAmp薄壁反應(yīng)管，Perkin-Elmer)后，添加5μl RNA樣品。反應(yīng)混合液組成添加酶溶液后(30μl中)終濃度如下。
60mM Tris/HCl(pH 8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀1mM DTT0.25mM每種dATP、dCTP、dGTP、dTTP3mM每種ATP、CTP、UTP2.25mM GTP3.6mM ITP1μM第一引物(SEQ ID NO7)第一引物具有添加至如這種SEQ IDNO所示核苷酸序列5’端的T7聚合酶啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO22)。
1μM第二引物(SEQ ID NO14)
25nM嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針(SEQ ID NO16)該核酸探針使用實(shí)施例2中的Label-ON試劑制備。
0.16μM切割用寡核苷酸(SEQ ID NO20)此寡核苷酸的3′-OH基以氨基修飾。
6U/30μl核糖核酸酶抑制劑(Takara Bio，Inc.)13％DMSO。
(3)將反應(yīng)混合液在43℃維持5分鐘，隨后添加在43C維持2分鐘的5μl具有如下組成的酶溶液。
酶溶液組成(在30μl中)反應(yīng)時(shí)的終濃度2％山梨醇8U/30μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara Bio，Inc.)142U/30μl T7 RNA聚合酶(GIBCO)3.6μg/30μl牛血清白蛋白(4)接下來，將配置了熱調(diào)節(jié)功能并允許直接測(cè)定PCR管的熒光分光光度計(jì)用于在43℃的反應(yīng)，同時(shí)定時(shí)測(cè)定反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)470nm，熒光波長(zhǎng)520nm).
將反應(yīng)混合液熒光強(qiáng)度比隨時(shí)間相關(guān)的改變(在預(yù)設(shè)時(shí)間時(shí)的熒光強(qiáng)度值÷背景熒光強(qiáng)度值)示于圖2，其中將添加酶的時(shí)間點(diǎn)定義為0分鐘。
圖2中的結(jié)果顯示取決于hnRNP B1 RNA起始濃度的熒光曲線，其中可以在20分鐘內(nèi)檢測(cè)出25個(gè)拷貝/試驗(yàn)的hnRNP B1 RNA。這提示hnRNPB1 RNA可以通過本發(fā)明方法以高靈敏度快速測(cè)定。
實(shí)施例4使用第一引物、第二引物、嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針和切割用寡核苷酸的不同組合通過本發(fā)明方法測(cè)定hnRNP B1 RNA。
(1)使用RNA稀釋劑(10mM Tris/HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.25U/μl核糖核酸酶抑制劑、5mM DTT)將前述的hnRNP B1 RNA(包含堿基編號(hào)157-1249)稀釋至103或102個(gè)拷貝/5μl以制備RNA樣品。
(2)將具有如下組分的20μl反應(yīng)混合液分注入0.5ml體積PCR管(GeneAmp薄壁反應(yīng)管，Perkin-Elmer)后，添加5μl RNA樣品。反應(yīng)混合液組成添加酶溶液后(30μl中)終濃度如下。
60mM Tris/HCl(pH 8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀1mM DTT0.25mM每種dATP、dCTP、dGTP、dTTP3mM每種ATP、CTP、UTP2.25mM GTP3.6mM ITP1μM第一引物(表1和2中所示SEQ ID NO.)第一引物具有添加至相應(yīng)SEQ ID NO.所示核苷酸序列5’端的T7聚合酶啟動(dòng)子序列(SEQ IDNO22)。
1μM第二引物(表1和2中所示SEQ ID NO.)25nM嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針(表1和2中所示SEQ ID NO)核酸探針使用實(shí)施例2中的Label-ON試劑制備。
0.16μM切割用寡核苷酸(表1和2中所示SEQ ID NO.)此寡核苷酸的3’-OH基以氨基修飾。
6U/30μl核糖核酸酶抑制劑(Takara Bio，Inc.)13％DMSO(3)將反應(yīng)混合液在43℃維持5分鐘，隨后添加在43℃維持2分鐘的5μl具有如下組成的酶溶液。
酶溶液組成反應(yīng)時(shí)(在30μl中)的終濃度2％山梨醇8U/30μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara Bio，Inc.)142U/30μl T7 RNA聚合酶(GIBCO)3.6μg/30μl牛血清白蛋白(4)接下來，將配置了熱調(diào)節(jié)功能并允許直接測(cè)定PCR管的熒光分光光度計(jì)用于在43℃的反應(yīng)，同時(shí)定時(shí)測(cè)定反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)470nm，熒光波長(zhǎng)520nm)。
表1和2顯示結(jié)果，其中(+)表示超過1.2的反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度比，并且將該點(diǎn)處的時(shí)間作為檢測(cè)時(shí)間，將添加酶的點(diǎn)定義為0分鐘。
當(dāng)使用表1和2中所列的第一引物、第二引物、嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針和切割用寡核苷酸的組合，在30分鐘內(nèi)檢出了102或103個(gè)拷貝/試驗(yàn)的hnRNP B1 RNA。
具體地，hnRNP B1 RNA可以在使用這樣的組合時(shí)迅速檢測(cè)到，該組合由如下序列組成自SEQ ID NO4-8中所選作為第一引物的序列、自SEQ ID NO9-15中所選作為第二引物的序列、作為嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針的SEQ ID NO16或17序列、自SEQ ID NO18-21中所選作為切割用寡核苷酸的序列。SEQ ID NO4-8是SEQ ID NO1的部分序列，SEQ ID NO9-15是SEQ ID NO2的部分序列，并且SEQ ID NO16和17是SEQ ID NO3的部分序列。該試驗(yàn)表明使用本發(fā)明的第一引物、第二引物和嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針的RNA擴(kuò)增和測(cè)定方法允許快速檢測(cè)hnRNP B1 RNA。
表1顯示使用不同寡核苷酸組合的測(cè)定結(jié)果。
表1
將這些寡核苷酸組合用于使用103個(gè)拷貝/試驗(yàn)的hnRNP B1 RNA作為樣品的RNA擴(kuò)增和熒光測(cè)定。將具有超過1.2的熒光強(qiáng)度比的樣品顯示為(+)，并且將該點(diǎn)處的時(shí)間記錄為檢測(cè)時(shí)間。
表2顯示使用不同寡核苷酸組合的測(cè)定結(jié)果表2
將這些寡核苷酸組合用于使用102個(gè)拷貝/試驗(yàn)的hnRNP B1 RNA作為樣品的RNA擴(kuò)增和熒光測(cè)定。將具有超過1.2的熒光強(qiáng)度比的樣品顯示為(+)，并且將該點(diǎn)處的時(shí)間記錄為檢測(cè)時(shí)間。
實(shí)施例5將本發(fā)明的方法用于定量hnRNP B1 RNA。
(1)使用RNA稀釋劑(10mM Tris/HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.25U/μl核糖核酸酶抑制劑、5mM DTT)將前述的hnRNP B1 RNA(包含堿基編號(hào)157-1249)稀釋至102、103、104、105和106個(gè)拷貝/5μl，作為繪制校準(zhǔn)曲線用的標(biāo)準(zhǔn)RNA。使用RNA稀釋劑作為陰性標(biāo)準(zhǔn)(NEG)。以類似方式制備樣品L(103個(gè)拷貝/5μl)、M(104個(gè)拷貝/5μl)和H(105個(gè)拷貝/5μl)。
(2)將具有如下組分的20μl反應(yīng)混合液分注入0.5ml體積PCR管(GeneAmp薄壁反應(yīng)管，Perkin-Elmer)后，加入5μl每種標(biāo)準(zhǔn)RNA和樣品。反應(yīng)混合液組成添加酶溶液后(30μl中)終濃度如下。
60mM Tris/HCl(pH 8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀1mM DTT0.25mM每種dATP、dCTP、dGTP、dTTP3mM每種ATP、CTP、UTP2.25mM GTP3.6mM ITP1μM第一引物(SEQ ID NO7)第一引物具有添加至這種SEQ ID NO所示核苷酸序列5’端的T7聚合酶啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO22)。
1μM第二引物(SEQ ID NO14)25nM嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針(SEQ ID NO16)此核酸探針是具有如實(shí)施例2中所述通過接頭結(jié)合至磷酸二酯的_唑黃的核酸探針。
0.16μM切割用寡核苷酸(SEQ ID NO20)該寡核苷酸的3′-OH基以氨基修飾。
6U/30 μl核糖核酸酶抑制劑(Takara Bio，Inc.)13％DMSO(3)反應(yīng)混合液在43℃維持5分鐘，隨后添加在43℃維持2分鐘的5μl具有如下組成的酶溶液酶溶液組成反應(yīng)時(shí)的終濃度(在30μl中)2％山梨醇8U/30μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara Bio，Inc.)142U/30μl T7 RNA聚合酶(GIBCO)3.6μg/30μl牛血清白蛋白(4)接下來，將配置了熱調(diào)節(jié)功能并允許直接測(cè)定PCR管的熒光分光光度計(jì)用于在43℃的反應(yīng)，同時(shí)定時(shí)測(cè)定反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)470nm，熒光波長(zhǎng)520nm).
將反應(yīng)混合液熒光強(qiáng)度比隨時(shí)間相關(guān)的改變(在預(yù)設(shè)時(shí)間時(shí)的熒光強(qiáng)度值÷背景熒光強(qiáng)度值)示于圖3，其中添加酶的時(shí)間點(diǎn)定義為0分鐘。在圖3的結(jié)果中，將熒光強(qiáng)度比達(dá)到1.2時(shí)的時(shí)間點(diǎn)定義為檢測(cè)時(shí)間，由檢測(cè)時(shí)間和拷貝起始數(shù)的對(duì)數(shù)繪制出校準(zhǔn)曲線，如圖4中所示。此外，自該校準(zhǔn)曲線定量樣品L、M和H的拷貝數(shù)并且結(jié)果示于表3。
在示于圖4的結(jié)果中，在大約12分鐘時(shí)檢測(cè)到102個(gè)拷貝/試驗(yàn)，并且在檢測(cè)時(shí)間和起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間得到令人滿意的線性。表3中對(duì)于樣品L、M和H的定量結(jié)果也是對(duì)應(yīng)于添加的hnRNP B1 RNA量的值。
因此，這證實(shí)本發(fā)明的方法以快速、高敏感和特異性方式定量了hnRNPB1 RNA。
hnRNP B1 RNA定量的結(jié)果示于表3。
表3
通過來自于樣品L(103個(gè)拷貝/5μl)、M(104個(gè)拷貝/5μl)和H(105個(gè)拷貝/5μl)測(cè)定結(jié)果的熒光曲線得到的檢測(cè)時(shí)間以及圖4的校準(zhǔn)曲線而計(jì)算的拷貝數(shù)的結(jié)果。
工業(yè)可應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，有可能以等溫、一步、方便和快速方式完成高敏感地測(cè)定hnRNP B1 mRNA。本發(fā)明因此適合作為用于早期診斷肺癌和其它扁平上皮癌，并且用于監(jiān)測(cè)化學(xué)治療等的治療效果，用于預(yù)測(cè)預(yù)后及用作決定治療方針的指標(biāo)。因?yàn)楸景l(fā)明可以在單個(gè)步驟并在密封容器內(nèi)實(shí)施，故可以使作為二次污染原因的擴(kuò)增產(chǎn)物污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)最小化。
此外，還因?yàn)楸痉椒ㄒ砸徊?、方便和快速方式?shí)施，多種樣品甚至可以通過人工方法處理，并且可以使可能降低再現(xiàn)性的操作數(shù)最小化。此外，由于本發(fā)明的RNA擴(kuò)增方法僅擴(kuò)增RNA，故可以實(shí)現(xiàn)精確擴(kuò)增和測(cè)定mRNA，無需RT-PCR中所需的完全除去雙鏈DNA的步驟?？傊?，本發(fā)明的方法適用于高度敏感和快速的表達(dá)分析。此外，由于該方法可以在等溫和一步方式實(shí)施，無需提供如PCR中的熱循環(huán)機(jī)制，并且因此容易自動(dòng)化。
序列表<110>東曹株式會(huì)社<120>用于測(cè)定不均一核核糖核蛋白B1(hnRNP B1)mRNA的方法<130>R778<150>JP 2004-224098<151>2004-07-30<160>22<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第一引物<400>1gatggagaaa actttagaaa ctgttccttt ggagaggaaa aagagagaga 50<210>2<211>87<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>2
cctcttgatc ttttgcttgc aggatccctc attaccacac agtctgtaag ctttccccat 60tgttcgtagt agttcctcaa actttct 87<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針<400>3tcttctgtgg tttcaaagct taagccacca ataaagagct tacggaac 48<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第一引物<400>4gatggagaaa actttagaaa ctgttcct 28<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>第一引物<400>5agaaaacttt agaaactgtt cct 23<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第一引物<400>6agaaaacttt agaaactgtt cctttgga 28<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第一引物<400>7ctgttccttt ggagaggaaa aagaga 26<210>8<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>第一引物<400>8cctttggaga ggaaaaagag aga 23<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>9cattgttcgt agtagttcct caaactttct 30<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>10tccccattgt tcgtagtagt tcct 24<210>11
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>11agtctgtaag ctttccccat tgtt 24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>12cattaccaca cagtctgtaa gctt 24<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>13cctcattacc acacagtctg taagct 26
<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>14caggatccct cattaccaca ca 22<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二引物<400>15cctcttgatc ttttgcttgc agga 24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針<400>16
ccaccaataa agagcttacg gaac 24<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針<400>17tcttctgtgg tttcaaagct taag 24<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>切割用寡核苷酸<400>18tccatcgcgg actcagtcgc ttcagcc 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>切割用寡核苷酸
<400>19ttttctccat cgcggactca gtcgctt 27<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>切割用寡核苷酸<400>20gaacagtttc taaagttttc tccatcg 27<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>切割用寡核苷酸<400>21caaaggaaca gtttctaaag tttt 24<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>T7聚合酶啟動(dòng)子序列<400>22aattctaata cgactcacta tagggaga 28
權(quán)利要求
1.用于測(cè)定存在于樣品中的不均一核核糖核蛋白B1(hnRNP B1)mRNA的方法，該方法包括(1)使用與所述RNA的特定堿基序列5’末端下游的至少部分同源的第一引物和與所述特定堿基序列3’末端上游的至少部分互補(bǔ)的第二引物，以形成含有啟動(dòng)子序列和該啟動(dòng)子序列下游的前述特定堿基序列的雙鏈DNA的步驟，其中所述第一引物和第二引物中的至少一方在5’末端具有啟動(dòng)子序列，(2)使用所述雙鏈DNA作為模板形成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；(3)接下來使用所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為DNA合成的模板，鏈?zhǔn)綌U(kuò)增所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；和(4)測(cè)定所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于測(cè)定hnRNP B1 mRNA的方法，其特征在于通過測(cè)定核酸探針在熒光特性上的變化實(shí)現(xiàn)測(cè)定所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量，所述核酸探針以嵌入性色素標(biāo)記并如此設(shè)計(jì)從而當(dāng)其與靶核酸形成互補(bǔ)雙鏈時(shí)嵌入性熒光色素部分通過嵌入互補(bǔ)雙鏈部分而在熒光特性上發(fā)生改變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用于測(cè)定hnRNP B1 mRNA的方法，其特征在于所述第一引物包含如SEQ ID NO1所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基，和/或所述第二引物包含如SEQ ID NO2所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的用于測(cè)定hnRNP B1 mRNA的方法，其特征在于所述第一引物包含如SEQ ID NO1所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基并且所述第二引物包含如SEQ ID NO2所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基，第一引物和第二引物的至少之一在5’末端具有啟動(dòng)子序列，并且當(dāng)?shù)谝灰锞哂袉?dòng)子序列時(shí)，該方法包含了包括如SEQ ID NO3所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針，并且當(dāng)?shù)诙锞哂袉?dòng)子序列時(shí)，該方法包含了包括與如SEQ ID NO3所示序列互補(bǔ)的序列中至少15個(gè)連續(xù)堿基的嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針。
5.用于hnRNP B1 mRNA的測(cè)定試劑，其特征在于包含了作為組成成分的如下物質(zhì)作為第一引物的含有如SEQ ID NO1所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸；作為第二引物的含有如SEQ ID NO2所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸，其中第一引物和第二引物的至少之一在5’末端具有啟動(dòng)子序列；以及當(dāng)?shù)谝灰锞哂袉?dòng)子序列時(shí)，包含如SEQ ID NO3所示序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針；以及當(dāng)?shù)诙锞哂袉?dòng)子序列時(shí)，包含與如SEQ ID NO3所示序列互補(bǔ)的序列中至少15個(gè)連續(xù)堿基的嵌入性熒光色素標(biāo)記的核酸探針。
全文摘要
樣品中存在的不均一核核糖核蛋白B1(hnRNP B1)mRNA的測(cè)定方法，所述方法包括使用與所述RNA的特定堿基序列5’末端下游的至少部分同源的第一引物和與所述特定堿基序列3’末端上游的至少部分互補(bǔ)的第二引物(其中所述第一引物和第二引物中的至少一方在5’末端具有啟動(dòng)子序列)以形成含有啟動(dòng)子序列和該啟動(dòng)子序列下游的前述特定堿基序列的雙鏈DNA的步驟；使用所述雙鏈DNA作為模板形成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；接下來使用所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為DNA合成的模板形成上述雙鏈DNA的步驟；在允許同時(shí)進(jìn)行前述各步驟的條件下重復(fù)前述步驟的核酸擴(kuò)增步驟；以及測(cè)定前述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的步驟。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1993481SQ20058002583
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月30日
發(fā)明者齋藤壽一, 林俊典 申請(qǐng)人:東曹株式會(huì)社